缺失phoQ和rpoS基因的都柏林沙门氏菌及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一株缺失PhoQ和rpoS基因的都 柏林沙门氏菌及应用。该菌株缺失了PhoQ和rpoS基因，由于该菌株的毒力降低而保留较 好的免疫原性。本发明还包括利用该重组菌制备疫苗以及该疫苗在小鼠上的应用。在小鼠 模型上，都柏林沙门氏菌phoQ和rpoS双基因缺失株免疫后能对10LD50的毒力型都柏林沙 门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌攻击均提供100 %的保护。
【背景技术】
[0002] 沙门氏菌是最常见的人和动物的重要病原菌，呈全球性分布。沙门氏菌导致牛副 伤寒，主要由都柏林沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌引起，其中都柏林沙门氏菌是牛专一性沙 门氏菌。犊牛副伤寒以顽固性下痢为典型症状，常引起犊牛大规模发病，死亡率较高，对养 牛业造成重大损失。有报道表明，我国20世纪70~80年代，由该病引起的死亡率曾达到 85%。此外，都柏林沙门氏菌是重要的人兽共患性病原菌，是引起人类沙门氏菌中毒的主要 血清型之一，人食用都柏林沙门氏菌污染的动物产品及奶制品，可发生食物中毒，致死率可 高达28. 3%，而其他沙门氏菌中毒致死率仅为3%左右（Helmsetal，2003)。
[0003] 疫苗接种是预防犊牛副伤寒的最佳手段，活疫苗由于可同时诱导体液免疫和细胞 免疫，因此是免疫效果最佳的疫苗。在我国，唯一的牛副伤寒活疫苗是利用醋酸铊致弱法选 育出的都柏林沙门氏菌弱毒株。此疫苗采用化学诱变致弱，具有致弱的遗传背景不清、存在 毒力返强风险、保留部分残留毒力、没有可用于区分疫苗株和野毒株的遗传标记等缺点。因 此，利用基因工程技术缺失毒力基因的减毒途径对开发遗传背景清晰、减毒后遗传稳定性 好、安全有效的都柏林沙门氏菌活疫苗意义重大。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，通过基因工程的方法，筛选获得一株都 柏林沙门氏菌双基因缺失的基因工程致弱菌株。
[0005] 本发明的第二个目的是利用构建的双基因缺失都柏林沙门氏菌的基因工程致弱 菌株制备犊牛副伤寒基因工程疫苗。该疫苗的免疫原性强，安全性好，无抗性基因，无外源 基因，遗传背景清楚，具有鉴别诊断标记。
[0006] 本发明通过以下技术方案实现：
[0007] 申请人构建了一株都柏林沙门氏菌双基因缺失株AphoQ-ArpoS，该双基因缺失 株被命名为都柏林沙门氏菌AphoQ-ArpoS,SalmonellaDublinAphoQ-ArpoS,于 2014 年2月19日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2014039〇
[0008] 本发明的基本构建方法是：利用入噬菌体Red重组系统对亲本株都柏林沙门氏 菌CICC21497株的phoQ、rpoS基因进行缺失，获得双基因缺失株。首先根据都柏林沙门氏 菌phoQ基因（GenBank基因登录号：CP001144. 1)上下游序列和模板质粒pKD3基因序列 (GenBank基因登录号：AY048742)，设计同源重组phoQ基因缺失突变和鉴定引物；然后以 质粒PKD3为模板，PCR扩增带有phoQ上下游同源臂的两端含FRT位点的氯霉素乙酰转移 酶基因（即氯霉素抗性基因），同时将同源重组辅助性质粒PKD46 (GenBank基因登录号： AY048746)转入都柏林沙门氏菌亲本株并经L-阿拉伯糖诱导后制备成电转化感受态，将 此PCR产物转入携带质粒pKD46的感受态细胞进行电转，通过氯霉素抗性筛选，获得用带 有phoQ上下游同源臂的两端含FRT位点的氯霉素乙酰转移酶基因替换phoQ基因的单基 因突变株AphoQ::cat，37°C条件下消除辅助性质粒pKD46，PCR鉴定得到都柏林沙门氏菌 AphoQ::cat;最后在具有FLP位点专一性重组的质粒pCP20作用下将氯霉素乙酰转移酶 基因和一个FRT位点消除，其操作步骤是：30°C下向重组菌导入pCP20, 42°C条件下消除抗 性基因，质粒也逐渐丢失，用含氯霉素与不含氯霉素、但均含氨苄青霉素的培养基平行筛选 氯霉素抗性消失菌株，得到都柏林沙门氏菌AphoQ单基因缺失株。再以该菌株为基础用同 样的操作过程最终获得重组的都柏林沙门氏菌双基因缺失株AphoQ-ArpoS(英文名为： SalmonellaDublinAphoQ-ArpoS)〇
[0009] 本发明比较了该重组的都柏林沙门氏菌AphoQ-ArpoS基因工程菌株（双基因 缺失株）与都柏林沙门氏菌亲本株的生长速度、生化特性、免疫原性和免疫保护性等方面 的生物学特性。
[0010] 为深入评价都柏林沙门氏菌AphoQ-ArpoS基因工程菌株制备的疫苗在防制犊 牛副伤寒中的应用，用制备的疫苗在试验动物（小白鼠，购自湖北省疾病预防控制中心）进 行了安生性（毒力）及免疫效果评价，达到了预期的效果，从而完成了本发明。
[0011] 本发明的主要优点是：
[0012] 本发明通过入噬菌体Red同源重组的方法将都柏林沙门氏菌phoQ基因、rpoS基 因两个基因完全缺失，降低了毒力回复突变的可能性，增加了稳定性与安全性，为犊牛副伤 寒的安全和有效防制奠定了遗传学基础。
[0013] 本发明所缺失的phoQ、rpoS基因均是都柏林沙门氏菌的毒力基因，动物（小鼠） 实验表明该双基因缺失的菌株毒力明显降低，而对机体仍有较好的免疫力。
[0014] 与传统的疫苗株比较，本发明的双基因缺失株不含抗性基因，也不含外源基因，具 有可用于鉴别诊断重组菌株的遗传标记，且其遗传背景清晰。
[0015] 更详细的发明方案见《【具体实施方式】》所述。
【附图说明】
[0016] 序列表SEQIDN0 :1是含phoQ基因上游同源臂和抗性基因上游片段上游引物 P1-C1的DNA序列，（phoQ上游同源臂）。
[0017] 序列表SEQIDN0 :2是含phoQ基因下游同源臂和抗性基因下游片段下游引物P2-C2的DNA序列，（phoQ下游同源臂）。
[0018] 序列表SEQIDN0 :3是含rpoS基因上游同源臂的抗性基因上游片段上游引物P3-C3的DNA序列，（rpoS上游同源臂）。
[0019] 序列表SEQIDN0 :4是含rpoS基因下游同源臂和抗性基因下游片段下游引物P4-C4的DNA序列（rpoS下游同源臂）。
[0020] 序列表SEQIDN0 :5是鉴定phoQ基因的上游引物序列phoQ-F。
[0021] 序列表SEQIDNO:6是鉴定phoQ基因的下游引物序列phoQ-R
[0022] 序列表SEQIDNO:7是鉴定rpoS基因的上游引物序列rpoS-Al。
[0023] 序列表SEQIDNO:8是鉴定rpoS基因的下游引物序列rpoS_A2。
[0024] 序列表SEQIDNO:9是鉴定rpoS基因的下游引物序列rpoS-A3。
[0025] 序列表SEQIDNO:10是检测质粒pKD46 (GenBank登录号：AY048742)中exo基因 的正向引物序列。
[0026] 序列表SEQIDN0 :11是检测质粒pKD46 (GenBank登录号：AY048742)中的exo基 因的反向引物序列。
[0027] 序列表SEQIDN0 :12是本发明构建的都柏林沙门氏菌AphoQ-ArpoS或AphoQ 缺失的phoQ基因的核苷酸序列，序列长度为1464bp。
[0028] 序列表SEQIDNO:13是本发明构建的都柏林沙门氏菌AphoQ-ArpoS或AphoQ 缺失的rpoS基因的核苷酸序列，序列长度为993bp。
[0029] 序列表SEQIDNO: 14是质粒pKD46质粒上exo基因的核苷酸序列，序列长度为 681bp〇
[0030] 序列表SEQIDNO:15是质粒pKD3上的两端含FRT位点的氯霉素乙酰转移酶基因 序列，序列长度为l〇12bp。
[0031] 图1 :采用的Red重组技术进行基因敲除的步骤示意图。
[0032] 图2 :是pKD3质粒图谱。
[0033] 图3 :是pKD46质粒图谱。
[0034] 图4 :是pCP20质粒图谱。
[0035] 图5 :本发明采用的Red重组技术构建双基因缺失重组菌的整体流程示意图。
[0036] 基本步骤是先扩增两端含phoQ基因同源臂的两端含FRT位点的氯霉素乙酰转 移酶（氯霉素抗性基因）基因片段，将此PCR产物电转化入都柏林沙门氏菌，在一定条件 下诱导其同源重组替代