专利名称：能同时降解果酒中苹果酸和柠檬酸菌株的筛选方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种能同时降解果酒中苹果酸及柠檬酸菌株的筛选方法及应用，是一 种利用微生物一陆生伊萨酵母降低果酒中苹果酸和柠檬酸含量的方法，属于食品加工领 域。
背景技术：
果酒的质量主要取决于水果质量，在气候条件不良的年份(低温、高湿)或由于采 收过早往往导致水果原料的质量不能充分体现，造成水果成熟度不够、含酸量高。水果中 含量较高的酸主要是苹果酸和柠檬酸。苹果酸，学名羟基丁二酸，主要有三种存在形式，即 D-苹果酸、DL-苹果酸、L-苹果酸，自然界存在的苹果酸都是L-苹果酸。L-苹果酸主要存 在于不成熟的山楂、苹果和葡萄果实的浆汁中。柠檬酸，学名2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸， 天然柠檬酸在自然界分布很广，主要存在于植物如柠檬、柑橘、菠萝、山楂等果实中。柠檬酸 含量随着不同的栽培品种和植物的生长情况而有所变化。游离酸的存在，不仅使果酒具有酸味，而且可以防止果酒被有害微生物污染和发 生化学变化，保持果酒品质的稳定。但是有机酸并不是越多越好，适度的酸度给人带来清 新、爽口和愉悦的感觉，酸度过高会使山葡萄酒有酸涩感、酒味粗硬、品质下降。所以在果酒 生产过程中往往会面临降酸的问题。常见的降酸微生物主要包括粟酒裂殖酵母(Schisosaccharomyces pombe)和苹 果酸-乳酸菌。粟酒裂殖酵母在厌气条件下分解苹果酸生成乙醇和C02。该酵母有较强的 耐SO2的性能，但繁殖与发酵速度较慢，发酵最适温度偏高，并且使用粟酒裂殖酵母纯种发 酵得到的果酒品质有股霉味，酒质不佳。苹果酸-乳酸发酵细菌是利用乳酸菌的代谢作用， 将酸味尖锐的苹果酸转化成口感柔和的乳酸，从而降低酒的酸度。这种方法可以提高果酒 对微生物的稳定性，改变酒中微量组分的含量和比例，改变呈香物质的浓度，有利于提高酒 的风味。但这种方法在生产实际应用中也面临着许多困难，例如操作不易控制，并且乳酸菌 易引起果酒的多种病害。本发明利用筛选得到的陆生伊萨酵母来降低苹果酸和柠檬酸的酸 度，目前尚未见报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种能同时降解果酒中苹果酸及柠檬酸菌株的筛选方法；通 过以苹果酸为唯一碳源做培养基从葡萄园的土壤中筛选得到一株能降解苹果酸和柠檬酸 的微生物——陆生伊萨酵母。本发明的另一目的在于提供一种菌株——陆生伊萨酵母在降解果酒中苹果酸及 柠檬酸的应用。本发明的技术方案是这样实现的能同时降解果酒中苹果酸及柠檬酸菌株，其特 征在于以苹果酸为唯一碳源做培养基从葡萄园的土壤中筛选降酸菌，具体筛选方法如 下
采集葡萄园土壤2g加到盛有100mL无菌生理盐水的三角瓶中，并加入8 12粒 无菌玻璃珠，充分振荡后静置，取上清液再分别加入到以浓度为2g/L的苹果酸为唯一碳源 的液体富集培养基中进行富集培养，培养条件为28°C，150r/min，摇床振荡培养，以24h为 一个周期，每个周期结束后，按照以上的操作，依次将所培养的菌液转接入新鲜的富集培养 基中，同时苹果酸浓度由2g/L、4g/L、6g/L、8g/L逐渐递增到10g/L ；选出生长较好的菌株， 将筛选得到的降酸菌用平板划线法进行多次分离纯化后，挑取单菌落接入到YPD斜面培养 基上于28°C培养24h后4°C保存。陆生伊萨酵母在降解果酒中苹果酸及柠檬酸的应用的实验例如下将果实原料进行破碎后加入0. 05%的果胶酶和100mg/L的S02，浸汁12小时后用 汁渣分离机进行分离压榨出汁，在30°C条件下接入降酸有效菌进行降酸发酵，发酵48h后 进行酒精发酵，酒精发酵是在20 25°C条件下接入酿酒酵母菌，酒精发酵结束后再进行过 滤、澄清，最后进入陈酿工序。酸度检测方法采用NaOH滴定法(以苹果酸或柠檬酸计)。菌种鉴定通过对筛选出的高效降酸菌进行形态学、生理生化特性和分子生物学 鉴定。最终确定筛选得到一株具有高效降解苹果酸和柠檬酸能力的菌株(命名为S8)属于 伊萨酵母属(Issatchenkia)中的陆生伊萨酵母(Issatchenkia terricola)种。菌株的生长特性研究以培养时间为横坐标，0D■值为纵坐标，确定菌体生长曲 线。对培养温度、培养基的起始PH值及摇床转速设计不同水平的数值进行试验，最终确定 菌株的最适培养温度，培养基的最适起始PH值及最适摇床转速。菌株的耐受性研究对S02浓度、酒精度及pH值设计不同水平的数值进行试验，最 终确定了菌株对S02浓度、酒精度及pH值的耐受性。与现有技术相比，本发明具有的优点和效果如下本发明中筛选得到的陆生伊萨酵母具有同时降解苹果酸和柠檬酸的效果，且降解 率达80%以上，并且该菌株耐受S02浓度达450mg/L，最适培养温度为30°C，发酵温度适中。
图1麦芽汁琼脂培养基上的菌落形态图2菌株S8细胞的显微形态图3菌株S8的生长曲线图4菌株S8的最适温度确定图5菌株S8的最适pH的确定图6菌株S8最适摇床转速的确定图7菌株S8对S02浓度的耐受性图8菌株S8对酒精度的耐受性
具体实施例方式实施例1 利用从葡萄园土壤中筛选得到的陆生伊萨酵母(Issatchenkia terricola)进行 降解苹果酸和柠檬酸。
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本发明利用的主要培养基为富集培养基(NH4)2S042g, KH2P042. 5g，FeSO4 · 7H20 0. lg，酵母膏 0. 5g，苹果酸按需 加入，用于IL蒸馏水中，取IOOmL配制溶液分装于250mL三角瓶中，115°C湿热灭菌30min。固体分离培养基(NH4)2S042g，KH2P042. 5g, FeSO4 ·7Η20 0. lg，酵母膏 0. 5g，琼脂粉 20g，溶于800mL蒸馏水中，苹果酸按需加入200mL蒸馏水中，115°C湿热灭菌30min，冷却到 50 60°C，将二者混合，倒平板。麦芽汁培养基由干麦芽制的，具体方法参照现代食品微生物学实验技术刘慧 主编，中国轻工业出版社，2006 :265。YPD培养基葡萄糖2%，酵母浸粉1%，蛋白胨1%，自然pH，121°C湿热灭菌 20minoWL营养培养基酵母浸粉0.4%，胰蛋白胨0. 5 %，葡萄糖5 %，KH2PO4O. 055 %，KCl 0. 0425%，无水 CaCl2O. 0125%, FeCl3O. 00025%, MgSO4O. 0125%, MnSO4O. 00025%。1、菌种筛选(1)富集培养将采集到的土壤定量加到无菌生理盐水中，加数粒玻璃珠，充分振 荡后静置，取上清液分别加入到以苹果酸(苹果酸浓度为2g/L)为唯一碳源的液体富集培 养基中，280C，150r/min,摇床振荡培养24h。24h为一个周期，每个周期结束后，按照以上的 操作，依次取一定量培养的菌液转接入新鲜的富集培养基中，连续转接培养多次。同时苹果 酸浓度由2g/L、4g/L、6g/L、8g/L逐渐递增到10g/L。(2)初筛在富集培养后取一定量的富集菌液，用生理盐水稀释到10_5，选择10_3、 10_4、10_5稀释度，分别吸取0. 5mL稀释液涂布于含苹果酸浓度为10g/L的琼脂平板培养基 上，28°C恒温培养24h。将所得的典型单菌落点植于分离培养基上，相同条件下培养。(3)复筛将初筛所得到的单菌落用平板划线法进行多次分离纯化，挑取单菌落 接入YPD斜面培养基于28°C培养24h后4°C保存。2、降酸特性研究以WL培养基为基础培养基，用5g/L苹果酸或柠檬酸代替葡萄糖做唯一碳源进行 培养，测定降酸率，得到一株降酸率最高的菌株，其降解苹果酸和柠檬酸率均高达80%以 上。3、菌种鉴定(1)菌落形态观察将得到的降酸率最高的菌株接种于麦芽汁培养基上，在30°C 下培养1 2d，对形成的菌落特征进行观察，如图1所示。(2)细胞形态观察采用光学显微镜观察菌株的细胞形态，如图2所示。(3)生化试验鉴定对菌株做淀粉水解试验、明胶液化试验、M R试验、硝酸盐还原 试验等各种生化鉴定试验，观察菌株对各种碳源和氮源的利用情况。(4)分子生物学鉴定测定该菌株的ITS保守序列组成，并与Genbank中的相关序 列进行比对，以确定该菌的具体种类。结果得出该菌株的ITS基因序列与陆生伊萨酵母的 ITS基因序列的同源性达到100%，因此鉴定该菌株为伊萨酵母属(Issatchenkia)中的陆 生伊萨酵母(Issatchenkia terricola)种，命名为S8。 4、菌株S8的生长特性研究(1)生长曲线的测定
将活化的菌株接种到灭菌的YPD液体培养基中，于28°C，150r/min下摇床培养12h 后，以2%接种量转接到YPD液体培养基中，测定0D,值，然后于28°C，150r/min下摇床培 养，每隔2h测定0D,值(以未接菌的YPD培养液做空白试验)，以培养时间为横坐标，0D_ 值为纵坐标，确定菌体生长曲线，如图3所示。(2)最适生长温度的确定将活化的菌株接种到灭菌的YPD液体培养基中，取处于对数生长期的菌悬液，以 2%接种量转接到50mLYPD液体培养基中，分别在24°C、26°C、28°C、30°C、32°C、34°C，150r/ min摇床培养，培养24h后取菌液测定0D_ (以未接菌的YPD培养液做空白)，最大0D6(1(1值 下的培养温度即为最适生长温度，如图4所示。(3)最适生长起始pH值的确定用NaOH或HC1调节YPD液体培养基的pH值分别为3. 5、4. 0、4. 5、5. 0、5. 5、6. 0，取 处于对数生长期的菌悬液，以2%的接种量接种于50mL上述不同pH值的YPD液体培养基 中，置于最适生长温度，150r/min摇床培养，培养24h后取菌液测定0D6QQ(以未接菌的YPD 培养液做空白)，最大0D,值下的pH即为最适生长pH。由图5可知，最适培养温度为30°C。(4)最适摇床转速的确定取处于对数生长期的菌悬液，以2%接种量转接到50mLYPD液体培养基中，在最 适生长温度、最适生长 pH 下，分别在 110r/min、130r/min、150r/min、170r/min、190r/min、 210r/min下振荡培养，培养24h后取菌液测定0D_(以未接菌的YPD培养液做空白对照)， 最大0D_值下的摇床转速可以得到最适摇床转速。由图6可知，最适摇床转速为150r/min。5、菌株S8的耐受性试验(1)菌株对S02的耐受性取处于对数生长期的菌悬液，以相同接种量分别接种于S02添加量为350mg/L， 400mg/L，450mg/L，500mg/L、550mg/L、600mg/L 的 50mL YPD 液体培养基中，30°C，150r/min 下振荡培养24h，取菌液测定0D_ (以未接菌的YPD培养液做空白对照)，确定菌株对S02的 耐受性。由图7可知，菌株最大耐S02浓度为450mg/L。(2)菌株对酒精度的耐受性取处于对数生长期的菌悬液，以相同接种量分别转接入无水乙醇含量分别为2%、 4%,5%,6%,8%U0% (v/v)的 50mL YPD 液体培养基中，30°C，150r/min 下振荡培养 24h， 取菌液测定0D_(以未接菌的YPD培养液做空白对照)，确定菌株对酒精的耐受性，由图8 可知，菌株最大耐酒精度为5%。
权利要求
一种能同时降解果酒中苹果酸和柠檬酸菌株的筛选方法，其特征在于降解果酒中苹果酸和柠檬酸的有效菌为伊萨酵母属(Issatchenkia)的陆生伊萨酵母(Issatchenkia terricola)种，具体的筛选方法如下采集葡萄园土壤2g定量加到盛有100mL无菌生理盐水的三角瓶中，并加入8～12粒无菌玻璃珠，充分振荡后静置，取上清液再分别加入到以浓度为2g/L的苹果酸为唯一碳源的液体富集培养基中进行富集培养，培养条件为28℃，150r/min，摇床振荡培养，以24h为一个周期，每个周期结束后，按照以上的操作，依次将所培养的菌液转接入新鲜的富集培养基中，同时苹果酸浓度由2g/L、4g/L、6g/L、8g/L逐渐递增到10g/L；再通过初筛和复筛后选出对苹果酸具有较好降酸效果的菌株；将筛选得到的降酸菌——陆生伊萨酵母用平板划线法进行多次分离纯化后，挑取单菌落接入到YPD斜面培养基上于28℃培养24h后4℃保存。
2.根据权利要求1所示的一种能同时降解果酒中苹果酸和柠檬酸菌株的筛选方法， 其特征在于所述的初筛过程如下在富集培养后取一定量的富集菌液，用生理盐水稀释到 10_5，选择10_3、10_4、10_5稀释度，分别吸取0. 5mL稀释液涂布于含酒石酸浓度为10g/L的琼 脂平板培养基上，28°C恒温培养72h。将所得的典型单菌落点植于分离培养基上，相同条件 下培养。
3.根据权利要求1所示的一种能同时降解果酒中苹果酸和柠檬酸菌株的筛选方法，其 特征在于所述的复筛过程如下将初筛所得到的单菌落用平板划线法进行多次分离纯化， 挑取单菌落接入YEPD斜面培养基于28°C培养72h后4°C保存。
4.一种菌株——陆生伊萨酵母在降解果酒中苹果酸及柠檬酸的应用。
全文摘要
本发明涉及一种能同时降解果酒中苹果酸和柠檬酸菌株的筛选方法及应用，其特征在于具体的筛选方法如下采集葡萄园土壤2g定量加到盛有100mL无菌生理盐水的三角瓶中，并加入8～12粒无菌玻璃珠，充分振荡后静置，取上清液再分别加入到以浓度为2g/L的苹果酸为唯一碳源的液体富集培养基中进行富集培养，培养条件为28℃，150r/min，摇床振荡培养，以24h为一个周期，每个周期结束后，按照以上的操作，依次将所培养的菌液转接入新鲜的富集培养基中，同时苹果酸浓度由2g/L、4g/L、6g/L、8g/L逐渐递增到10g/L；再通过初筛和复筛后选出对苹果酸具有较好降酸效果的菌株；具有较高的降酸率，并且能够耐受较高浓度的SO2，发酵温度适宜。且降解率达80％以上，并且该菌株耐受SO2浓度达450mg/L，最适培养温度为30℃，发酵温度适中。
文档编号C12N1/16GK101870955SQ20101020206
公开日2010年10月27日 申请日期2010年6月18日 优先权日2010年6月18日
发明者文连奎, 王治国, 王立芳, 王贵珍 申请人:吉林农业大学