cD和tdcE编码的多肽的 酶活性失活。
7. 权利要求1的经遗传修饰的细菌细胞，其中所述细菌细胞还包含（a)tdcD;(b) tdcE(c)aspC; (d)sfcA(e)poxB; (f)citF和（g)pta的遗传修饰，所述遗传修饰使tdcD， tdcE，aspC，sfcA，poxB，citF和pta编码的多肽的酶活性失活。
8. 权利要求1的经遗传修饰的细菌细胞，其中所述细菌细胞是大肠杆菌、氧化葡 糖杆菌、浅井氏葡糖杆菌、德尔马瓦无色杆菌、粘无色杆菌、乳无色杆菌、根瘤农杆菌、 放射形土壤杆菌、奠产碱杆菌、梓檬节杆菌、肿胀节杆菌、石赌节杆菌、Arthrobacter hydrocarboglutamicus、氧化节杆菌、天牛短小杆菌、印度固氮菌、产氨短杆菌、散枝短 杆菌（Brevibacteriumdivaricatum)、Brevibacteriumlactofermentum、黄色短杆菌、 Brevibacteriumglobosum、暗褐短杆菌、酮戊二酸短杆菌、Brevibacteriumhelcolum、 Brevibacteriumpusillum、Brevibacteriumtestaceum、玫瑰色短杆菌、Brevibacterium immariopliiIi觀、扩展短杆菌、Brevibacteriumprotopharmiae、嗜乙酰棒杆菌、谷氨酸棒 状杆菌、美棒杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌、醋谷棒杆菌、产气肠杆菌、解淀粉欧文氏菌、胡萝卜 软腐欧文氏菌、草生欧文氏菌、菊欧文氏菌、Flavobacteriumperegrinum、Flavobacterium fucatum、Flavobacteriumaurantinum、莱茵黄杆菌、Flavobacteriumsewanense、 Flavobacteriumbreve、Flavobacteriummeningosepticum、微球菌属物种CCM825、摩 氏变形菌、Nocardiaopaca、粗糖诺卡氏菌、Planococcuseucinatus、雷氏变形菌、谢 氏丙酸杆菌、成黄假单胞菌、氮假单胞菌、荧光假单胞菌、卵状假单胞菌、施氏假单胞菌、 Pseudomonasacidovolans、霉味假单胞菌、睾丸酮假单胞菌、铜绿假单胞菌、红串红球菌、 玫瑰红红球菌、红球菌属物种ATCC15592、红球菌属物种ATCC19070、脲芽孢八叠球菌、金 黄色葡萄球菌、Vibriometschnikovii、Vibriotyrogenes、马杜拉诺卡氏菌、Actinomyces violaceochromogenes>Kitasatosporiaparulosa、天蓝色链霉菌、Streptomyces flavelus、浅灰链霉菌、变铅青链霉菌、橄榄色链霉菌、田无链霉菌、弗吉尼亚链霉菌、抗 生链霉菌、可可链霉菌、淡紫灰链霉菌、绿色产色链霉菌、杀鲑气单胞菌、短小芽孢杆菌、 环状芽孢杆菌、解硫胺素芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis)，枯草芽孢 杆菌（Bacillussubtilis)，Bacillusamyloliquifaciens,凝固芽抱杆菌（Bacillus coagulans)，弗氏埃希氏菌、嗜氨微杆菌、粘质沙雷菌、鼠伤寒沙门氏菌、Salmonella schottmulleri或柑橘黄单胞菌。
9. 权利要求1的经遗传修饰的细菌细胞，其中所述细菌细胞是大肠杆菌。
10. 权利要求1的经遗传修饰的细菌细胞，其中所述细菌细胞不具有任何外源核苷酸 序列。
11. 权利要求1的经遗传修饰的细菌细胞，其中所述遗传修饰的细菌细胞是经代谢演 化的且经选择用于增加琥珀酸生产的细胞。
12. 权利要求1的经遗传修饰的细菌细胞，其中所述细菌细胞产生至少250mM琥珀酸。
13. 权利要求1的经遗传修饰的细菌细胞，其中所述细菌细胞包含对下述靶基因的遗 传修饰：（a)IdhA; (b)ackA; (c)adhE; (d)focA-pfIb和（e)mgsA，并产生至少 200mM瑭J白酸， 其中所述遗传修饰使所述靶基因编码的多肽的酶活性失活。
14. 权利要求13的经遗传修饰的细菌细胞，其中所述细菌细胞还包含选自下述的一个 或者多个基因的遗传修饰：P〇xB、pta、tdcD、tdcE、mdh、sdh、iclR、icl、pdh、sfcA、aspC、 aceAB和citDEF，所述一个或者多个遗传修饰使所述一个或者多个基因编码的多肽的酶活 性失活。
15. 权利要求13的经遗传修饰的细菌细胞，其中所述细菌细胞还包含poxB的遗传修 饰，所述遗传修饰使PoxB编码的多肽的酶活性失活。
16. 权利要求13的经遗传修饰的细菌细胞，其中所述细菌细胞还包含（a)poxB; (b) tdcD和（c)tdcE的遗传修饰，所述遗传修饰使poxB、tdcD和tdcE编码的多肽的酶活性失 活。
17. 权利要求13的经遗传修饰的细菌细胞，其中所述细菌细胞还包含（a)poxB和（b) sfcA的遗传修饰，所述遗传修饰使poxB和sfcA编码的多肽的酶活性失活。
18. 权利要求13的经遗传修饰的细菌细胞，其中所述细菌细胞还包含（a)poxB; (b) sfcA; (c)tdcD和（d)tdcE的遗传修饰，所述遗传修饰使poxB，sfcA，tdcD和（d)tdcE编码 的多肽的酶活性失活。
19. 权利要求13的经遗传修饰的细菌细胞，其中所述细菌细胞还包含（a)tdcD; (b) tdcE(c)aspC; (d)sfcA(e)poxB; (f)citF和（g)pta的遗传修饰，所述遗传修饰使tdcD， tdcE，aspC，sfcA，poxB，citF和pta编码的多肽的酶活性失活。
20. 权利要求13的经遗传修饰的细菌细胞，其中所述细菌细胞是大肠杆菌、氧化 葡糖杆菌、浅井氏葡糖杆菌、德尔马瓦无色杆菌、粘无色杆菌、乳无色杆菌、根瘤农杆菌、 放射形土壤杆菌、奠产碱杆菌、梓檬节杆菌、肿胀节杆菌、石赌节杆菌、Arthrobacter hydrocarboglutamicus、氧化节杆菌、天牛短小杆菌、印度固氮菌、产安短杆菌、散枝短 杆菌、Brevibacteriumlactofermentum、黄色短杆菌、Brevibacteriumglobosum、暗 褐短杆菌、酮戊二酸短杆菌、Brevibacteriumhelcolum、Brevibacteriumpusillum、 Brevibacteriumtestaceum、玫瑰色短杆菌、Brevibacteriumimmariophilium、扩 展短杆菌、Brevibacteriumprotopharmiae、嗜乙酰棒杆菌、谷氨酸棒状杆菌、美棒 杆菌、嗜乙酰乙酸棒杆菌、醋谷棒杆菌、产气肠杆菌、解淀粉欧文氏菌、胡萝卜软腐欧 文氏菌、草生欧文氏菌、菊欧文氏菌、Flavobacteriumperegrinum、Flavobacterium fucatum、Flavobacteriumaurantinum、莱茵黄杆菌、Flavobacteriumsewanense、 Flavobacteriumbreve、Flavobacteriummeningosepticum、微球菌属物种CCM825、 摩氏变形菌、Nocardiaopaca、粗糖诺卡氏菌、Planococcuseucinatus、雷氏变形菌、 谢氏丙酸杆菌、成黄假单胞菌、氮假单胞菌、荧光假单胞菌、卵状假单胞菌、施氏假单胞 菌、Pseudomonasacidovolans、霉味假单胞菌、睾丸酮假单胞菌、铜绿假单胞菌、红串红 球菌、玫瑰红红球菌、红球菌属物种ATCC15592、红球菌属物种ATCC19070、脲芽孢八 叠球菌、金黄色葡萄球菌、Vibriometschnikovii、Vibriotyrogenes、马杜拉诺卡氏 菌、Actinomycesviolaceochromogenes>Kitasatosporiaparulosa、天蓝色链霉菌、 Streptomycesflavelus、浅灰链霉菌、变铅青链霉菌、橄榄色链霉菌、田无链霉菌、弗吉尼 亚链霉菌、抗生链霉菌、可可链霉菌、淡紫灰链霉菌、绿色产色链霉菌、杀鲑气单胞菌、短 小芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、解硫胺素芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，Bacillus amyloliquifaciens，凝固芽孢杆菌，弗氏埃希氏菌、嗜氨微杆菌、粘质沙雷菌、鼠伤寒沙门 氏菌、Salmonellaschottmulleri或柑橘黄单胞菌。
21. 权利要求13的经遗传修饰的细菌细胞，其中所述细菌细胞是大肠杆菌。
22. 权利要求13的经遗传修饰的细菌细胞，其中所述细菌细胞不具有任何外源核苷酸 序列。
23. 权利要求13的经遗传修饰的细菌细胞，其中所述遗传修饰的细菌细胞是经代谢演 化的且经选择用于增加琥珀酸生产的细胞。
24. 权利要求1的经遗传修饰的细菌细胞，其中所述微生物过表达磷酸烯醇丙酮酸羧 激酶（pck)。
25. 权利要求13的经遗传修饰的细菌细胞，其中所述微生物过表达磷酸烯醇丙酮酸羧 激酶（pck)。
26. 经遗传修饰的细菌菌株，其中所述经遗传修饰的细菌菌株为KJ012(NRRL B-50022)，KJ017(NRRLB-50023)，KJO32(NRRLB-50024)，KJO60(NRRL B-50025)，KJ071(NRRLB-50027)或KJ073(NRRLB-50029)。
27. 培养或培育经遗传修饰的细菌菌株的方法，包括用权利要求1-26中的一种或多种 经遗传修饰的细菌菌株接种培养基，并培养或培育所述经遗传修饰的细菌菌株。
28. 生产琥珀酸或苹果酸的方法，包括在允许生产琥珀酸或苹果酸的条件下在培养基 中培养权利要求1-26中的一种或多种经遗传修饰的细菌菌株。
29. 组合物，其包含权利要求1-26中的一种或多种经遗传修饰的细菌菌株和培养基。
【专利摘要】本发明为用于有效生产琥珀酸和苹果酸的材料和方法。为了在pH受控的分批发酵中在矿物盐培养基中生产琥珀酸和苹果酸，构建了经遗传改造的微生物，但不添加质粒或外源基因。本发明还提供了生产琥珀酸和苹果酸的方法，包括培养经遗传修饰的微生物。NRRL B-5011620080220 NRRL B-5011120080220 NRRL B-5011520080220 NRRL B-5011420080220 NRRL B-5011220080220 NRRL B-5011320080220 NRRL B-5002520070315 NRRL B-5002220070315 NRRL B-5002320070315 NRRL B-5002420070315 NRRL B-5011020080220 NRRL B-5002920070315 NRRL B-5002820070315 NRRL B-5002720070315 NRRL B-5002620070315
【IPC分类】C12P7-46, C12R1-19, C12N1-21
【公开号】CN104694449
【申请号】CN201410742776
【发明人】K·扬塔玛, M·J·豪普特, X·张, J·C·穆尔, K·T·尚穆加姆, L·O·因格拉姆
【申请人】佛罗里达大学研究基金公司
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2008年3月19日
【公告号】CA2688938A1, CN101688196A, CN101688196B, EP2121915A2, EP2121915A4, EP2121915B1, EP2570481A1, EP2570481B1, US8691539, US20100184171, WO2008115958A2, WO2008115958A3, WO2008115958A4