一种厌氧微生物培养基复合去氧层的制作方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种培养基去氧层。
【背景技术】
[0002]厌氧微生物是一类生存于低氧或无氧环境条件下的微生物，在自然界广泛分布。厌氧微生物的研宄由来已久，现如今在石油资源利用、新能源开发利用、新材料的研发、流行病防控、特殊传染病的诊断、抗生素研制、特殊有机物质发酵等众多领域都需要用到厌氧微生物。
[0003]由于氧气对于厌氧微生物的生长有害，培养厌氧微生物需要专门方法或设备，目前比较普遍采用的方法包括使用厌氧培养基、厌氧培养罐、厌氧培养箱等。厌氧培养基通过向培养基中加入还原剂的方法，部分去除培养基中的氧，以满足厌氧微生物的生存需要，但由于无法完全去除氧，这种培养基仅适用于低氧状态下的厌氧微生物生存；而且加入的还原性物质还存在影响或危害厌氧微生物生长的风险，限制了这种培养基的应用。厌氧培养罐和厌氧培养箱都是通过物理或化学的手段去除培养器材内部的氧，以实现对厌氧微生物的培养。虽然他们除氧效果好，但是这两种设备都因结构复杂，购置和维持运行成本高，携带不方便等原因无法广泛推广使用。
【发明内容】
[0004]本发明是为了解决现有厌氧培养基无法完全去除氧，还原剂存在影响或危害厌氧微生物生长的风险，以及厌氧培养罐和厌氧培养箱结构复杂，购置和维持运行成本高，携带不方便等问题，而提供的一种厌氧微生物培养基复合去氧层。
[0005]本发明厌氧微生物培养基复合去氧层由下而上依次为无菌硅胶塞、含有培养基成分的无菌琼脂、还原剂和无菌琼脂；且无菌硅胶塞上设置有竖直贯通的细孔。
[0006]本发明厌氧微生物培养基复合去氧层中的无菌硅胶塞直径应略大于培养容器内径，便于固定。无菌硅胶塞位于厌氧微生物培养基液面或表面之上，可以与厌氧微生物培养基的液面或表面接触。无菌硅胶塞具有支撑作用，固定厌氧微生物培养基复合去氧层位置；同时无菌硅胶塞还具有隔热的作用，可以避免含有培养基成分的无菌琼脂在形成过程中杀灭厌氧微生物。无菌硅胶塞具有竖直贯通的细孔，该细孔可以流通空气但液体琼脂无法通过，在固定无菌硅胶塞位置的同时，位于厌氧微生物培养基上方的空气沿细孔排出，而不会被挤压溶解到厌氧微生物培养基中，也不会增加培养容器内的压强。
[0007]本发明含有培养基成分的无菌琼脂中的培养基成分应与厌氧微生物培养基成分相同；可以避免含有培养基成分的无菌琼脂与厌氧微生物培养基(特别是液体培养基)接触而改变或影响厌氧微生物培养基的浓度和成分。含有培养基成分的无菌琼脂还是还原剂的支撑层。
[0008]本发明厌氧微生物培养基复合去氧层中加入有还原剂，可以吸收培养容器中残留的氧气及培养过程中外界渗入的氧；而且还原剂不进入到厌氧微生物培养基中，不会影响或危害厌氧微生物的生长。
[0009]本发明无菌琼脂将还原剂与外界隔绝，避免还原剂的快速氧化，更有效的阻隔外界氧气的渗入。
[0010]本发明厌氧微生物培养基复合去氧层制作简单，设备要求低，成本低廉，方便携带和临时制作，而且除氧效果好，特别适合在传染病原监测、工业微生物初筛等领域应用。
【具体实施方式】
[0011]本发明技术方案不局限于以下所列举【具体实施方式】，还包括各【具体实施方式】间的任意组合。
[0012]【具体实施方式】一:本实施方式厌氧微生物培养基复合去氧层由下而上依次为无菌硅胶塞、含有培养基成分的无菌琼脂、还原剂和无菌琼脂；且无菌硅胶塞上设置有竖直贯通的细孔。
[0013]本实施方式无菌硅胶塞具有竖直贯通的细孔，该细孔孔径可以流通空气但液体琼脂无法通过。
[0014]【具体实施方式】二:本实施方式与【具体实施方式】一的不同点是:厌氧微生物培养基复合去氧层的含有培养基成分的无菌琼脂和还原剂之间设置分子筛垫层或细菌滤膜。其它步骤及参数与实施方式一相同。
[0015]本实施方式中分子筛垫层和细菌滤膜用于阻止还原剂进入含有培养基成分的无菌琼脂，避免通过扩散作用还原剂进入厌氧微生物培养基。
[0016]【具体实施方式】三:本实施方式与【具体实施方式】一或二的不同点是:厌氧微生物培养基复合去氧层在无菌琼脂之上还包含N层还原剂和无菌琼脂，还原剂与无菌琼脂间隔设置，其中N为自然数。其它步骤及参数与实施方式一或二相同。
[0017]多次重复设置，隔绝氧气效果更好。
[0018]【具体实施方式】四:本实施方式与【具体实施方式】一、二或三的不同点是:含有培养基成分的无菌琼脂中琼脂浓度为25g/L。其它步骤及参数与实施方式一、二或三相同。
[0019]本实施方式中琼脂浓度为25g/L制备出的含有培养基成分的无菌琼脂以凝固硬度适中，并且在培养过程中又不会干燥、开裂。
[0020]【具体实施方式】五:本实施方式与【具体实施方式】一至四之一的不同点是:无菌琼脂中琼脂浓度为25g/L。其它步骤及参数与实施方式一至四之一相同。
[0021]本实施方式中琼脂浓度为25g/L制备出的无菌琼脂以凝固硬度适中，并且在培养过程中又不会干燥、开裂。
[0022]【具体实施方式】六:本实施方式与【具体实施方式】一至五之一的不同点是:还原剂为硫化钠。其它步骤及参数与实施方式一至五之一相同。
[0023]实施例1
[0024]制备、使用厌氧微生物培养基复合去氧层:
[0025]1、将所需所有器材、培养基根据各自特征分别用高温高压蒸汽灭菌、过滤除菌等方法灭菌；
[0026]2、将厌氧微生物培养基先分装入培养容器内，再用高温高压蒸汽灭菌，此时培养容器可先用临时棉塞或硅胶塞密封，以便于灭菌；
[0027]3、在无菌条件下，按试验设计，向灭菌后的厌氧微生物培养基中接种培养的厌氧微生物菌株，具体方法与常规接种方法相同；
[0028]4、在无菌条件下，将无菌硅胶塞小心地用无菌接种棒塞入培养容器中，至于培养基液面相接触，液面间的全部空气排出；
[0029]5、在无菌条件下，向培养容器内灌注含有培养基成分的无菌琼脂，含有培养基成分的无菌琼脂的营养成分与厌氧微生物培养基成分相同，待其冷却凝固；
[0030]6、在无菌条件下，在含有培养基成分的无菌琼脂上放置分子筛垫层或细菌过滤膜，排空其与含有培养基成分的无菌琼脂间的空气；
[0031]7、在无菌条件下，加入无菌的硫化钠或其他还原剂；
[0032]8、在无菌条件下，继续灌注无菌琼脂，待其冷却凝固；即实现厌氧微生物培养基复合去氧层的制备。
[0033]可重复上述第5?8步操作几次，形成多层的无菌琼脂-还原剂复合层。
[0034]培养结束，在无菌条件下，小心逐层取出培养物上方各层，特别是小心取出还原剂，避免其残留在培养容器内，然后取出菌硅胶塞，用无菌移液器吸取培养物。
[0035]本实施例中含有培养基成分的无菌琼脂和无菌琼脂中琼脂浓度为25g/L。
[0036]采用本实施例方法进行空白接种试验，同时在培养液中加入氧指示剂亚甲基蓝，28°C培养48h后，氧指示剂呈阴性反应，说明成功建立了无氧环境。
[0037]采用本实施例方法接种厌氧细菌产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)进行厌氧培养，同时用厌氧培养箱常规方法接种产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)进行培养，各接种15例，28°C恒温箱培养48h，接种后初始细胞浓度均为1.0 X 103个/mL。本实施例方法培养出的产气荚膜梭菌细胞浓度为(5.65±0.12) X 107个/mL，厌氧培养箱培养出的产气荚膜梭菌细胞浓度为(5.70±0.13) X 107个/mL。两种培养方法培养物中细胞浓度无显著差异，说明采用本方法的培养效果与使用厌氧培养箱的培养效果基本相同，可以用于厌氧微生物的培养。
【主权项】
1.一种厌氧微生物培养基复合去氧层，其特征在于厌氧微生物培养基复合去氧层由下而上依次为无菌硅胶塞、含有培养基成分的无菌琼脂、还原剂和无菌琼脂；且无菌硅胶塞上设置有竖直贯通的细孔。
2.根据权利要求1所述的一种厌氧微生物培养基复合去氧层，其特征在于厌氧微生物培养基复合去氧层的含有培养基成分的无菌琼脂和还原剂之间设置分子筛垫层或细菌滤膜。
3.根据权利要求1所述的一种厌氧微生物培养基复合去氧层，其特征在于厌氧微生物培养基复合去氧层在无菌琼脂之上还包含N层还原剂和无菌琼脂，还原剂与无菌琼脂间隔设置，其中N为自然数。
4.根据权利要求1所述的一种厌氧微生物培养基复合去氧层，其特征在于含有培养基成分的无菌琼脂中琼脂浓度为25g/L。
5.根据权利要求1所述的一种厌氧微生物培养基复合去氧层，其特征在于无菌琼脂中琼脂浓度为25g/L。
6.根据权利要求1所述的一种厌氧微生物培养基复合去氧层，其特征在于还原剂为硫化钠。
【专利摘要】一种厌氧微生物培养基复合去氧层。它涉及一种培养基去氧层。它解决了现有厌氧培养基无法完全去除氧，还原剂存在影响或危害厌氧微生物生长的风险，以及厌氧培养罐和厌氧培养箱结构复杂，购置和维持运行成本高，携带不方便等问题。氧微生物培养基复合去氧层由下而上依次为无菌硅胶塞、含有培养基成分的无菌琼脂、还原剂和无菌琼脂；且无菌硅胶塞上设置有竖直贯通的细孔。本发明厌氧微生物培养基复合去氧层制作简单，设备要求低，成本低廉，方便携带和临时制作，而且除氧效果好，特别适合在传染病原监测、工业微生物初筛等领域应用。
【IPC分类】C12Q1-04, C12N1-20, C12R1-145
【公开号】CN104694445
【申请号】CN201510149249
【发明人】赵丹, 高冬妮, 范晓旭, 宋刚, 凌宏志
【申请人】黑龙江大学
【公开日】2015年6月10日
【申请日】2015年4月1日