一种过表达苹果酸酶基因的重组载体及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种过表达苹果酸酶基因的重组载体及应用。包括筛选标记基因表达盒及目的基因表达盒；所述的筛选标记基因表达盒包括抗性筛选基因，在抗性筛选基因的上游融合了大肠杆菌P1启动子，抗性筛选基因的下游融合了大肠杆菌ccdB终止子；所述的目的基因表达盒包括三角褐指藻fcpC基因启动子、苹果酸酶基因、三角褐指藻fcpA基因终止子及一个Omega?leader序列，所述的Omega?leader序列在三角褐指藻fcpC基因启动子的下游。本发明的重组载体比较小，适合转化，容易操作，都是三角褐指藻的同源序列，利于表达。通过过表达苹果酸酶基因能够显著地提高微藻细胞内的脂质含量，为生物能源的研究奠定了基础。
【专利说明】一种过表达苹果酸酶基因的重组载体及应用
【技术领域】
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[0001]本发明属于微藻基因工程领域，具体涉及一种过表达苹果酸酶基因的重组载体及应用。
【背景技术】
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[0002]传统能源的不可再生性决定了其日益枯竭的趋势，且造成环境问题日益严重。能源危机和环境污染的日益严峻激起了人们的能源忧患意识及污染物零排放观念，加强了对废油脂及工业下脚料的回收处理及科学利用，推动清洁新型能源的开发利用。寻求一种安全可靠的、清洁的可再生能源已成为当今世界共同关注的焦点。生物能源是指利用生物可再生原料及太阳能生产的能源，包括生物质能生物液体燃料及利用生物质生产的能源如燃料酒精、生物柴油、生物质气化及液化燃料、生物制氢等(谭天伟，等，2003)。其中，生物柴油是采用来自动物或植物脂肪酸单酯包括脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯及脂肪酸丙酯等与甲醇(或乙醇)经酯交换反应而得到的长链脂肪酸甲(乙)酯，是一种可以替代普通石油柴油的可再生的清洁燃料，相较于其它种类的生物能源，生物柴油具有原料广泛、生产高效、环境友好、净化环境等突出特点(谭天伟，等，2002)。
[0003]Chisti通过建立数学模型和工程计算指出微藻生物能源是唯一可以取代石化油的生物柴油(Chisti，et al.,2007 ；Chisti, et al.，2008)。因具有清洁、高效、环保、产油量大等优点，微藻生物能源被视为最具有发展潜力的生物柴油的资源(Metting，etal., 1996 ；Spolaore, et al.，2006 ；ffeers, et al.，1977 ；Hu et al., 2008)。娃藻是海洋浮游生物最重要的组成成分，在提供海洋初级生产力方面发挥着重要的作用。它们是研究发现新颖的在其他经常研究的生物体中不存在的代谢路径的主要研究对象，因为在它们进化过程中形成一系列新颖的代谢路径(Armbrust, et al.，2004)。由于三角褐指藻具有生长周期短、生长快、脂质含量高等优点，成为最具潜力的产油微藻(Yang, et al.，2013 ；Niu, etal.，2012)。因此，通过遗传学改造提高三角褐指藻的脂质含量与生物量是提高工业化生产产量的重要途径。
[0004]海洋硅藻三角褐指藻，一种广泛使用的饵料藻，其快速增长和高脂肪含量已成为有吸引力和有前途的，作为生物柴油的新来源，它的基因组在2008年已被测序(http://genome, jg1-psf.0rg/Phatr2/Phatr2.home, html),使得它也成为研究功能基因组学一个模型微藻。
[0005]载体兀件是决定微藻表达系统中DNA表达稳定性的关键部件之一。随着基因组测序技术的快速进步，基因测通技术和序列信息注释已被开发用于传输序列功能性信息的渠道。通常，研究基因的功能可以使用各种的方法，如异位表达，基因沉默，蛋白质亚细胞定位，启动子活性分析，结构一功能分析，并在体内或体外用生物化学测定基因表达模式分析。然而，对基于限制性内切酶/连接酶克隆方法工程表达构建体的常规方法是非常费力和耗时的，并且经常受到限制性酶切位点的阻碍。在模型藻莱茵衣藻和三角褐指藻甚至大多数高等植物中载体构建是功能基因分析的主要障碍，因此，迫切需要创新和有效的技术手段克服以上困难。最近的通路克隆系统用两步骤的位点特异性重组快速大规模克隆研究一个或者多个基因进入载体(G and J，2004)。需连入载体的DNA片段，首先克隆到一个普通供体载体。然后，由两个位点特异性重组位点(attBl和attB2位)中的供体质粒侧翼的DNA片段可以被精确地转印到各种表达载体中，通过位点特异性重组反应。一旦DNA产物被靶向到供体载体中，无需传统的限制性内切酶和连接酶克隆的简单反应。将重组克隆系统，DNA的转移构建体整合到表达目的载体所介导Gateway技术，和许多开放阅读框条目(供体)的克隆的集合和表达质粒已被广泛用于功能基因组学中的许多生物创建(Aliverti etal.，2008)。然而，在这种方式中使用的酶的成本相对昂贵，特别是相关技术几乎没有在硅藻三角褐指藻中报道，并且转化效率不高，因此通过利用选择标记基因构造微藻的遗传转化的零背景的TA克隆载体。此外，该技术可灵活地适应用于PCR扩增的基因或片段开发专门的表达载体的单步装配(Chen et al.，2009)。通过限制性内切酶XcmI的高效酶切，该质粒可以形成两个3’的T突出端以便用于TA克隆，我们这次构建的T载体基于限制性内切酶XcmI的灵活运用(Chen et al.，2009)，T载体连接方式几乎适用于所有的基因克隆连接工作，使得未来都省时省力连接目的基因到在三角褐指藻表达的载体。
[0006]用于遗传转化的关键步骤是有一个包含所有表达基因元件的载体，该载体包含选择标记(通常是抗生素抗性基因)的表达盒或者选择质粒在细菌或选择在宿主生物体中的基因转移，以及用于表达的宿主生物体中另一个靶基因表达盒的操作。然而，所生产的选择标记蛋白的获得转基因生物体后不想要的。构建生产转基因细胞异源蛋白质有时是有问题的，因为一些蛋白质可能会影响转基因细胞或细胞的生长，一个可行的选择是使用诱导型启动子来限制选择标记蛋白在转基因生物体的表达。诱导型启动子的发展也是必不可少的转化载体允许选择标记物的表达，以及是在细胞中表达感兴趣的基因的设计思路。
[0007]某些广泛用于植物转化的异源启动子已被用于在微藻的基因转化中。如在甲藻Amphidinium中，花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子和pI’2’农杆菌启动子启动了报告基因⑶S的表达(Leon and Fernandez, 2007)。然而，由于这些微细藻类的独特的核特性,异源启动子表达量的影响，而不是如预期在高等植物中表达量高，在藻类中表现出相对低的表达水平，且通常为瞬时表达。与此相对，单细胞绿藻莱茵衣藻的RBCS2启动子比在转基因盐藻中使用35S启动子表现出更高的效率(Sun et al.，2005)。在羽状娃藻Cylindrothecafusiformis和中心娃藻海链藻(Poulsenand Kroger.2005)中用内源的岩藻黄素叶绿素a/c结合蛋白(fcp)启动子和硝酸还原酶(NR)启动子呈现相对较高的转化效率(Poulsenet al.，2006)。从娃藻Cylindrotheca fusiformis中克隆的启动子在娃藻三角褐指藻中呈现相对较高效率的表达(Miyagawa et al.，2009)。此外和羽状娃藻Cylindrothecafusiformis和中心娃藻Thalass1sira pseudonana相比，三角褐指藻遗传转化方法的技术限制，其转换效率都比较低。因此，新型和有效的内源性启动子的功能研究是外源基因在三角褐指藻高效表达的重要因素。
[0008] 绿色荧光蛋白是真核细胞中基因表达的定量基因(Soboleski，2004)。含绿色荧光蛋白(GFP)标记基因的质粒DNA可通过蛋白免疫印迹法和细胞荧光来检测该蛋白质的表达(Tolonen et al.，2006)。Scott等人已成功将绿色突光蛋白报告基因在衣藻Chlamydomonas reinhardtii 叶绿体中表达(Scott Franklin, 2002)。Li 等人在转基因盐藻成功表达硝酸还原酶诱导的绿色突光蛋白表达(Li et al.，2007)。Niu等人在三角褐指藻中成功建立诱导表达绿色荧光蛋白表达系统(Niu et al.，2012)。
[0009]目前微生物油脂的高额生产成本阻碍了其大规模产业化.提高产油微生物中的油脂含量是解决成本问题的一个关键。然而，无论是在微生物还是植物中，油脂含量的提高都是一个具有较大难度的工作。研究者曾采取各种各样的方法，包括基因修饰等方法来去除可能对油脂积累有阻碍作用的物质，但这些尝试都失败了，或者说油脂产量的提高不显著(10%~15% ) (Rafledge et al.2010)。近年来研究证实，油脂积累期间苹果酸酶活力的降低和油脂积累程度有直接的联系.因此研究苹果酸酶在产油藻类中的调控作用，对于实现提高产油生物中的油脂含量具有重大意义(Rafledge et al.2006)。
[0010]苹果酸酶(ME)催化不可逆的氧化脱羧反应，使苹果酸氧化脱羧形成丙酮酸和CO2 的过程需要辅酶 NAD(P) +和二价离子的参与(Chang and Tong2003 ；Vongsangnak, etal.2012)。按辅酶专一性和对底物的选择性可以将苹果酸酶分为3类:第I类是NAD+依赖型ME (NAD — ME) (EC1.1.1.38)，具有催化草酰乙酸脱羧的能力；第2类是能同时利用NAD+和NADP+的ME (NADP—ME) (EC1.1.1.39)，但利用NAD+时活性更高，不能催化草酰乙酸脱羧；第3类是NADP+依赖型ME(EC1.1.1.40)，也具有催化草酰乙酸脱羧的能力。产油藻类中的苹果酸酶主要是第3类。
[0011]反应产生的NAD(P)H对脂肪酸生成至关重要，为细胞代谢提供了必须的还原力(Wynn, et al.1999 ；ffynn and Ratledgel997 ；ffynn and Ratledge2000)。研究报道 ME 广泛地存在于各类生物体中参与着各类代谢路径，如脂肪生成、能量代谢、乙酸代谢、厌氧生长以及光合作用(Wynn, etal.1999 ;Moreadith and Lehninger 1984 ;Hi 11 et al.1996 ；Goodridge et al.1996)。
[0012]虽然微生物代谢途径中有许多生成NADPH的过程，但脂肪酸合成酶几乎只能利用由苹果酸酶产生的NADPH。因此，苹果酸酶可能产生了一个单独的NADPH池，这个单独的NADPH池与脂肪酸合成酶直接偶联.使得产生的NADPH优先进入脂肪酸合成途径，或者说产油微生物中脂肪酸合成酶和苹果酸酶等可能有机地复合在一起，形成脂代谢体(Lipogenicmetabolon) (Wynn, et al.2001)。还没有研究指出其他的NADPH生成酶有提供脂肪酸合成酶所需还原力的功能。因此苹果酸酶可能是产油微生物中唯一可以提供脂肪酸生物合成所需NADPH的酶。
[0013]基于苹果酸酶对微生物油脂积累的重要调控作用，如果能鉴定和分离产油微生物的苹果酸酶基因，利用基因工程手段选择性增加或降低苹果酸酶的活性，将有利于定向获得功能性油脂及次生代谢产物。
[0014]目前，已经有一些关于脂质积累与ME关系的研究。有些研究表明ME的表达与动物脂肪组织中脂肪形成的关系(Al-Dwairi, et al.2012 ；Zhou, et al.2012)，ME基因还与月旨质合成与分泌以及II型糖尿病相关(Bourneuf, et al.2006 ；Ibrahim, et al.2010)。在特定的启动子gpdl的控制下在Mucor circinelloides中过表达ME基因,转化株ME的活性是野生型的2-3倍、脂质积累是野生型的2.5倍(Zhang et al.2007)。还有研究表明过表达ME的大肠杆菌在有苹果酸的培养基中培养，能产生更多的NADPH，使转化株的细胞内脂质积累提高4倍。共表达乙酰辅酶A羧化酶与苹果酸酶能够显著地提高总脂产量，转化株的脂质含量比野生型的脂质含量提高了 5.6倍(Meng，et al.2011)。异源表达ME也能够提高 ME 的活性和脂质积累。Mucor circinelloides 的 ME 基因在 Rhodotorula glutinis中过表达，使得Rhodotorula glutinis转化株在脂质积累的末期ME活性及脂质含量都增加了两倍多(Li, et al.2013)。
[0015]相反有研究表明，加入抑制因子的Mucor circinelloide的ME活性显著下降，因为抑制因子能够抑制脂质代谢从而降低ME的活性(Kendrick，et al.1992)。
【发明内容】
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[0016]本发明的第一个目的是提供一种过表达苹果酸酶基因的重组载体。
[0017]本发明的过表达苹果酸酶基因的重组载体，是一个多功能的微藻转化载体。该重组载体包括筛选标记基因表达盒及目的基因表达盒；所述的筛选标记基因表达盒包括抗性筛选基因，在抗性筛选基因的上游融合了大肠杆菌Pl启动子，抗性筛选基因的下游融合了大肠杆菌CCdB终止子；所述的目的基因表达盒包括三角褐指藻fcpC基因启动子、苹果酸酶基因、三角褐指藻fcpA基因终止子及一个Omega leader序列，所述的Omega leader序列在三角褐指藻fcpC基因启动子的下游。
[0018]所述的大肠杆菌Pl启动子的序列如SEQ ID N0.1所示，大肠杆菌ccdB终止子的序列如SEQ ID N0.2所示，三角褐指藻fcpC基因启动子的序列如SEQ ID N0.3所示，苹果酸酶基因的序列如SEQ ID N0.4所示，三角褐指藻fcpA基因终止子的序列如SEQ ID N0.5所不，Omega leader 序列如 SEQ ID N0.6 所不。
[0019]所述的目的基因表达盒，优选在三角褐指藻fcpC基因启动子和三角褐指藻fcpA基因终止子之间通过不依赖于连接反应的高效克隆方法引入上游XcmI序列和下游XcmI序列，形成了目的基因TA克隆位点，所述的XcmI序列如SEQ ID N0.7所示。
[0020]所述的目的基因表达盒，优选在三角褐指藻fcpA基因终止子前融合一个MYC标签序列，所述的MYC标签序列如SEQ ID N0.8所示。
[0021]所述的抗性筛选基因，优选为氯霉素酰基转移酶基因，其核苷酸序列如SEQ IDN0.9所示。
[0022]所述的表达盒是指含有启动子、目的基因或目的基因克隆位点和终止子、且其中的基因能正常进行转录和翻译的序列。
[0023]所述的融合为本领域技术人员所熟知的DNA片段连接技术。
[0024]不依赖于连接反应的高效克隆方法(LIC)属于现有技术。
[0025]本发明的第二个目的是提供所述的过表达苹果酸酶基因的重组载体在构建高效的微藻生物产油器中的应用。
[0026]所述的微藻，优选为三角褐指藻。
[0027]本发明的过表达苹果酸酶基因的重组载体包括2个基因表达盒，一个为筛选标记基因表达盒，另一为目的基因表达盒。筛选标记基因表达盒集成了真核和原核的表达盒，采用氯霉素酰基转移酶基因作为抗性筛选基因，其上游融合了来自大肠杆菌的Pl启动子和三角褐指藻fcpC基因启动子，下游融合了大肠杆菌CCdB终止子和三角褐指藻fcpA基因终止子。该融合表达盒使得氯霉素酰基转移酶基因既能在大肠杆菌中表达，又能在三角褐指藻中表达。该设计有效减小了表达载体的大小，便于载体的克隆操作以及高效的转化。本发明中采用了三角褐指藻的内源性的高效启动子fcpC，fcpC与三角褐指藻的光合作用相关，因此具有极高的启动效率，是理想的构建载体元件。
[0028]目的基因表达盒，用于表达外源基因，采用三角褐指藻的高表达水平的fcpC基因的启动子及终fcpA基因的终止子。目的基因表达盒内通过特别设计的2个XcmI内切酶位点引入了 TA克隆的连接方式。XcmI酶切线性化的载体即可直接一个步骤克隆Taq聚合酶PCR的产物。在三角褐指藻fcpC基因启动子的后面融合了一个Omega leader序列，曾有相关研究表明，把CaMV35S启动子-419~_90(E12)序列与omega序列相串联，⑶S基因在转基因烟草中有最大的表达活性。用这种结构增强⑶S基因表达，在转基因烟草中⑶S活性比仅仅用CaMV35S启动子高20-70倍(Mitsuhara et al., 1996)。由此可以看出，omega序列具有提闻启动子活性进而提闻目的基因表达的作用。
[0029]在三角褐指藻fcpA基因终止子的前面，添加的另外一个序列MYC-tag，具有高效，可靠，稳定的特性属于被广泛应用的成熟的理想的蛋白标签。在1985年就有相关文献报道将MYC序列位于终止密码子之前,用于western blot检测目的基因的表达(Evan etal.，1985)。MYC-tag应用于本发明的过表达苹果酸酶基因的重组载体，可以解决一些后续载体的应用问题。例如在载体携带三角褐指藻的内源性基因进行过表达研究时，因为无内源性基因表达的蛋白与藻细胞内自身表达的蛋白相同，无法使用特定的抗体进行检测，MYC标签可以方便可靠的检测出基因是否成功的导入了细胞中。另一方面，对于其他非三角褐指藻内源性的基因的携带导入实验中，也可以不必再针对不同的蛋白而使用不同的抗体，而可以统一使用MYC抗体进行检测，节约了成本。
[0030]本发明的过表达苹果酸酶基因的重组载体比较小，适合转化，容易操作，都是三角褐指藻的同源序列，利于表达。
[0031]本发明的过表达苹果酸酶基因的重组载体能够在微藻中进行过表达苹果酸酶基因。苹果酸酶(ME)催化不可逆的氧化脱羧反应，使苹果酸氧化脱羧形成丙酮酸和CO2的过程需要辅酶NAD (P) + 和二价离子的参与(Chang and Tong2003 ；Vongsangnak, et al.2012),反应产生的NAD(P)H对脂肪酸生成至关重要，为细胞代谢提供了必须的还原力。虽然微生物代谢途径中有许多生成NADPH的过程，但脂肪酸合成酶几乎只能利用由苹果酸酶产生的NADPH。因此，苹果酸酶可能产生了一个单独的NADPH池，这个单独的NADPH池与脂肪酸合成酶直接偶联.使得产生的NADPH优先进入脂肪酸合成途径，或者说产油微生物中脂肪酸合成酶和苹果酸酶等可能有机地复合在一起，形成脂代谢体(Lipogenic metabolon)(Wynn, et al.2001)。还没有研究指出除了苹果酸酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶以外的其他NADPH生成酶有提供脂肪酸合成酶所需还原力的功能。因此苹果酸酶可能是产油微生物中少有的可以提供脂肪酸生物合成所需NADPH的酶。通过过表达苹果酸酶基因能够显著地提高微藻细胞内的脂质含量，为生物能源的研究奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】
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[0032]图1为目的基因表达盒构建图；
[0033]图2为pHY18表达载体结构图，Pnr/Tnr:硝酸还原酶启动子/终止子；PfcpC:三角褐指藻fcpC启动子，TfcpA:三角褐指藻fcpA终止子；CAT:氯霉素乙酰转移酶基因；0ri:PUC19质粒复制起点；
[0034]图3为CAT在大肠杆菌和三角褐指藻中的表达，A左为商业化载体pMD19_T转化大肠杆菌；A右为pHY18载体转化大肠杆菌(LB培养基含3511^171氯霉素)；B左为转化载体pHY18-eGFP的三角褐指藻生长在25011^1/1氯霉素f/2_si培养基中，B右为野生型三角褐指藻；
[0035]图4为PCR验证和微藻蛋白质印迹分析，A为用引物P201和P202PCR扩增转化eGFP基因融合，其中，泳道1:转基因株系，泳道2:未转基因藻株，泳道M:100bp Marker，箭头表示0.7-kb的eGFP的条带；B为Western blot分析用抗Myc及抗GFP抗体检测绿色突光蛋白，β-actin作为内部对照基因和探讨，泳道1:未转基因藻株，泳道2:转基因株系；
[0036]图5共聚焦显微镜观察eGFP基因，A为转基因三角褐指藻株，B为未转化的三角褐指藻B;
[0037]图6为ME基因的PCR扩增结果图，泳道M为10bp的ladder marker ;泳道I和泳道2为ME基因的扩增结果；
[0038]图7为ME基因编码的蛋白序列的进化树；
[0039]图8为PtME_pHY18重组质粒的BamH I酶切图，泳道Ml为Ikb的ladder marker ；泳道M2为10bp的ladder marker ;泳道I为PtME_pHY18重组质粒的BamH I酶切结果；泳道2为PtME-pHY18重组质粒；
[0040]图9为PtME_pHY18重组质粒的引物图谱；
[0041]图10为抗生素筛选阳性三角褐指藻的培养结果照片，其中，A为200mg.l-1氯霉素平板筛选阳性藻的照片，Wildtype为未转化藻,Transgenic为转化藻；B为200mg *L_1氯霉素浓度的f/2培养基培养转化藻和未转化藻,Wild type为未转化藻,Transgenic为转化藻；
[0042]图11为转化藻的三角褐指藻的单细胞PCR验证结果，泳道M为10bp的laddermarker ;泳道I为以野生型的藻为DNA为模板，以引物Pt51+Pt52的扩增结果；泳道2为以野生型的藻为DNA为模板，以引物Pt89+Pt92r的扩增结果；泳道3_6为以转化藻DNA为模板，分别以 Pt51+Pt52、Pt51+Pt92r、Pt89+Pt52、Pt89+Pt92r 为 PCR 引物的扩增结果。
[0043]图12为转化藻的Southernblot验证分析图，其中control为未转化藻，ME-2为转化藻中脂质积累较多的一株；
[0044]图13为转化藻的MYC蛋白的Western blot分析图，其中，control为未转化藻，MEl为转化藻株I ;ME2为转化藻株2 ；
[0045]图14为ME基因表达蛋白的蛋白定位的胶体金免疫电镜图，A为野生型的三角褐指藻，B为过表达ME基因的转基因三角褐指藻，OB为油体；Mt为线粒体；Ch为叶绿体；
[0046]图15为转化藻中的ME基因的qPCR分析图；
[0047]图16为转化藻的ME的酶活检测结果；
[0048]图17，A为尼罗红染色测定每106细胞的转化藻和未转化藻的中性脂质含量；B为每ml藻液的转化藻和未转化藻的中性脂质含量；C为转化藻和未转化藻的生长曲线；D为转化藻和未转化藻缺氮48小时和96小时后的中性脂质含量；
[0049]图18为转化藻和未转化藻的激光扫描共聚焦显微镜检测图，A为转化藻；B为未转化藻。
【具体实施方式】
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[0050]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0051]本发明所使用的限制性内切酶、T4DNA连接酶、NEB高保真Pfu聚合酶(购自NewEnglandB1labsjUSA);所有引物及核苷酸序列的合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。大肠杆菌DH5ci感受态细胞购自广州鼎国生物有限公司。
[0052]过表达苹果酸酶基因的重组载体构建过程中所使用的引物序列如表1所示。
[0053]表1:载体设计中使用的引物
[0054]
【权利要求】
1.一种过表达苹果酸酶基因的重组载体，其特征在于，包括筛选标记基因表达盒及目的基因表达盒；所述的筛选标记基因表达盒包括抗性筛选基因，在抗性筛选基因的上游融合了大肠杆菌Pl启动子，抗性筛选基因的下游融合了大肠杆菌CCdB终止子；所述的目的基因表达盒包括三角褐指藻fcpC基因启动子、苹果酸酶基因、三角褐指藻fcpA基因终止子及一个Omega leader序列，所述的Omega leader序列在三角褐指藻fcpC基因启动子的下游； 所述的大肠杆菌Pl启动子的序列如SEQ ID N0.1所示,大肠杆菌ccdB终止子的序列如SEQ ID N0.2所示，三角褐指藻fcpC基因启动子的序列如SEQ ID N0.3所示，苹果酸酶基因的序列如SEQ ID N0.4所示,三角褐指藻fcpA基因终止子的序列如SEQ ID N0.5所示，Omega leader 序列如 SEQ ID N0.6 所不。
2.根据权利要求1所述的过表达苹果酸酶基因的重组载体，其特征在于，所述的目的基因表达盒，其中在三角褐指藻fcpC基因启动子和三角褐指藻fcpA基因终止子之间通过不依赖于连接反应的高效克隆方法引入上游XcmI序列和下游XcmI序列，形成了目的基因TA克隆位点，所述的XcmI序列如SEQ ID N0.7所示。
3.根据权利要求1所述的过表达苹果酸酶基因的重组载体，其特征在于，所述的目的基因表达盒，在三角褐指藻fcpA基因终止子前融合一个MYC标签序列，所述的MYC标签序列如SEQ ID N0.8所示。
4.根据权利要求1所述的过表达苹果酸酶基因的重组载体，其特征在于，所述的抗性筛选基因为氯霉素酰基转移酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.9所示。
5.权利要求1所述的过表达苹果酸酶基因的重组载体在构建高效的微藻生物产油器中的应用。
6.根据权利要求5所述的过表达苹果酸酶基因的重组载体在构建高效的微藻生物产油器中的应用，其特征在于，所述的微藻为三角褐指藻。
【文档编号】C12N1/13GK104131024SQ201410329101
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月10日 优先权日:2014年7月10日
【发明者】李宏业, 薛姣, 杨维东, 刘洁生 申请人:暨南大学