在真核细胞中生产琥珀酸的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是申请号为200880117129. 3的中国专利申请的分案申请，原申请是国际 申请PCT/EP2008/065583的中国国家阶段申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及包含编码延胡索酸还原酶的核苷酸序列的重组真核细胞和使用所述 重组真核细胞生产琥珀酸的方法。
【背景技术】
[0003] 琥珀酸是大量化学品的潜在前体。例如，琥珀酸可以被转化为1，4-丁二醇（BD0)、 四氢呋喃和Y-丁酸内酯。衍生自琥珀酸的另一产物是通过连接琥珀酸和BD0制造的聚酯 聚合物。
[0004] 琥珀酸主要通过丁烷氢化的石油化学方法生产。这些方法被认为对环境有害，并 且昂贵。琥珀酸的发酵生产可以是生产琥珀酸的一种有吸引力的替代性方法，其中可以使 用可再生的原料作为碳源。
[0005] 已知大量不同的细菌如Escherichiacoli和瘤胃细菌Actinobacillus、 Anaerobiospirillum、Bacteroides、Mannheimia或Succinimonassp.能生产王虎I白酸。对 这些细菌菌株的代谢改造提高了琥珀酸产率和/或生产力，或者减少了副产物形成。
[0006]W02007/061590公开了用于生产苹果酸和/或琥珀酸的丙酮酸脱羧酶阴性酵母， 用丙酮酸羧化酶或磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶和苹果酸转运蛋白（MAE)对所 述酵母加以转化。
[0007] 尽管琥珀的发酵生产有所改进，但是仍然需要用于发酵生产琥珀酸的改进的微生 物。
【发明内容】
[0008] 本发明的一个目的是用于生产琥珀酸的替代性微生物。
[0009] 根据本发明用包含下述核苷酸序列的选自酵母和丝状真菌的重组真核细胞实现 了这一目的，所述核苷酸序列编码催化延胡索酸转化成琥珀酸的NAD(H)-依赖型延胡索酸 还原酶。
[0010] 惊讶地发现，与野生型真核细胞生产的琥珀酸量相比，根据本发明的重组真核细 胞生产的琥珀酸的量有所提高。优选地，根据本发明的真核细胞与不包含编码NAD(H)_依 赖型延胡索酸还原酶的核苷酸序列的野生型真核细胞相比，生产至少1. 2、优选至少1. 5、 优选至少2倍的琥珀酸。
[0011] 在本文中使用时，根据本发明的重组真核细胞被定义为下述细胞，所述细胞含有 天然不存在于真核细胞中的核苷酸序列或多肽，或所述细胞经天然不存在于真核细胞中的 核苷酸序列或多肽转化或遗传修饰，或者其含有内源核酸序列的额外的一个或多个拷贝。 野生型真核细胞在本文中被定义为重组细胞的亲本细胞。
[0012] 编码催化延胡索酸转化成琥珀酸的NAD(H)_依赖型延胡索酸还原酶的核苷酸 序列可以是异源或同源的核苷酸序列，或者编码已通过突变、断裂或缺失被进一步遗 传修饰的异源或同源的NAD⑶-依赖型延胡索酸还原酶。重组DNA技术是本领域公 知的，如Sambrook和Russel(2001)"MolecularCloning:ALaboratoryManual(3rd edition),ColdSpringHarborLaboratoryPress中。
[0013] 用于表示给定（重组）核酸或多肽分子和给定宿主生物或宿主细胞之间相互关系 时，术语"同源的"被理解为表示天然情况下所述核酸或多肽分子由相同物种的宿主细胞或 生物生产，优选由相同品种或菌株的宿主细胞或生物生产。
[0014] 关于核酸0NA或RNA)或蛋白质使用时，术语"异源的"是指下述核酸或蛋白质，所 述核酸或蛋白质不作为其出现的生物、细胞、基因组或DNA或RNA序列的一部分天然存在， 或者存在于与其天然存在不同的细胞或基因组或DNA或RNA序列中的一个或多个位置中。 异源核酸或蛋白质对引入它的细胞而言不是内源的，而是得自另一细胞或合成生产或重组 生产的。
[0015] 根据本发明的NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶使用NAD(H)作为辅助因子，其中大 部分真核细胞包含fadh2-依赖型延胡索酸还原酶，其中FADH2是辅助因子。发现：真核细 胞包含编码NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶的核苷酸序列是有利的，因为NAD(H)-依赖型 延胡索酸还原酶为细胞提供了将NAD(H)氧化为NAD+并影响细胞中氧化还原平衡的其它选 项。
[0016] 优选地，细胞表达编码催化琥珀酸形成的酶的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列 优选地编码NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶，所述延胡索酸还原酶包含与SEQIDNO: 1和/ 或SEQIDN0:3和/或SEQIDN0:4和/或SEQIDN0:6的氨基酸序列具有至少40%、优 选地至少 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99% 序列同一性的氨基酸氨基酸序列。优选地，核苷酸序列编码包含SEQIDN0:1和/或SEQ IDN0:3和/或SEQIDN0:4和/或SEQIDN0:6的氨基酸序列的NAD(H)-依赖型延胡索 酸还原酶。
[0017] 序列同一性在本文中被定义为通过比较序列测定的两条或更多条氨基酸（多肽 或蛋白质）序列或两条或更多条核酸（多核苷酸）序列之间的关系。通常，在比较的序列 的整个长度上比较序列同一性或相似性。在本领域中，"同一性"也表示氨基酸或核酸序列 之间的序列相关度，根据情况通过这类序列串之间的匹配测定。
[0018] 测定同一性的优选方法被设计为在测试的序列之间给予最大匹配。测定同一性 和相似性的方法被编码于公众可获得的计算机程序中。测定两条序列之间同一性和相似 性的优选的计算机程序方法包括BLASTP和BLASTN，公众可从NCBI和其它来源（BLAST Manual，Altschul，S.，等，NCBINLMNIHBethesda，MD20894)获得。使用BLASTP的氨基 酸序列比较的优选参数为缺口开放11. 0,缺口延伸1，Blosum62矩阵。
[0019] 编码在本发明细胞中表达的酶的核苷酸序列也可以通过它们在中度杂交条件或 优选严格杂交条件下与编码SEQIDN0:1、SEQIDN0:3、SEQIDN0:4和/或SEQIDN0:6的NAD(H)依赖型延胡索酸还原酶的核苷酸序列杂交的能力来定义。严格杂交条件在本文中 定义为下述条件：所述条件允许至少约25个、优选约50个核苷酸、75或100个、优选约200 或更多个核苷酸的核酸序列，在约65°C的温度下，在包含约1M盐的溶液（优选6xSSC(氯 化钠、柠檬酸钠））或具有与之相当的离子强度的任何其它溶液中杂交，以及在65°C下，在 包含约0. 1M或更少盐、优选0. 2xSSC的溶液或具有与之相当的离子强度的任何其它溶液 中洗涤。优选地，杂交过夜进行，即至少进行10小时，以及优选地，洗涤进行至少进行1小 时，其中至少将洗涤溶液更换两次。这些条件通常会允许具有约90%或更多序列同一性的 序列的特异性杂交。
[0020] 中度条件在本文中定义为下述条件，所述条件允许至少50个核苷酸、优选约200 或更多个核苷酸的核酸序列，在约45°C的温度下，在包含约1M盐的溶液（优选6xSSC)或 具有与之相当的离子强度的任何其它溶液中杂交，以及在室温下，在包含约1M盐的溶液 (优选6xSSC)或具有与之相当的离子强度的任何其它溶液中洗涤。优选地，杂交过夜进 行，即至少进行10小时，以及优选地，洗涤进行至少1小时，其中至少将洗涤溶液更换两次。 这些条件通常会允许具有多达50%序列同一性的序列的特异性杂交。本领域技术人员应当 能够调整这些杂交条件，从而特异性地鉴定同一性在50%和90%之间变化的序列。
[0021] 为了提高引入的酶在本发明的真核细胞中以活性形式表达的可能性，可以改变相 应的编码核苷酸序列，从而使其密码子选择针对选用的真核宿主细胞而优化。用于密码子 优化的若干方法是本领域已知的。针对真核细胞的密码子选择来优化核苷酸序列密码子选 择的一种优选的方法是W02008/000632中公开的密码子对优化技术。密码子对优化是在宿 主细胞中生产多肽的一种方法，其中在其密码子使用方面（特别是使用的密码子对），对编 码多肽的核苷酸序列进行了修饰，从而获得编码多肽的核苷酸序列提高的表达和/或提高 的多肽生产。密码子对被定义为编码序列中两个相继三联体（密码子）的集合。
[0022] 在本文中使用时，术语"基因"表示含有核酸聚合酶（在真核生物中为RNA聚合酶 II)的模板的核酸序列。基因被转录为mRNA，随后被翻译为蛋白质。
[0023] 在本文中使用时，术语"核酸"包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷 酸多聚体，即多核苷酸，除非另有限制，其包括具有天然核苷酸主要特性的已知类似物，因 为它们能够以类似于天然存在的核苷酸的方式与单链核酸杂交（例如肽核酸）。多核苷酸 可以是天然或异源的结构基因或调苄基因的全长或亚序列。除非另有说明，该术语包括特 定的序列及其互补序列。
[0024] 术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"在本文中可互换使用，表示氨基酸残基的多聚体。 该术语适用于下述氨基酸多聚体，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸 的人工化学类似物，还适用于天然存在的氨基酸多聚体。天然存在的氨基酸的这类类似物 的关键特征是，当掺入蛋白质中时，蛋白质与下述抗体特异反应，所述抗体针对相同但是完 全由天然存在的氨基酸组成的蛋白质产生。术语"多肽"、"肽"和"蛋白质"也包括修饰， 所述修饰包括但不限于糖基化、脂质结合、硫酸盐化、谷氨酸残基的Y-羧基化、羟基化和 ADP-核糖基化。
[0025] 在本文中使用时，术语"酶"被定义为在细胞中催化（生物）化学反应的蛋白质。
[0026] 通常，编码酶的核苷酸序列与使得相应核苷酸序列在本发明真核细胞中充分表达 的启动子可操作地连接，从而赋予所述细胞生产琥珀酸的能力。
[0027] 在本文中使用时，"可操作地连接"是指处于功能性关系中的多核苷酸元件（或编 码序列或核酸序列）的连接。当核酸序列被放置为与另一核酸序列处于功能性关系时，其 是"可操作地连接"的。例如，如果启动子或增强子能影响编码序列的转录，则其与编码序 列可操作地连接。
[0028] 在本文中使用时，术语"启动子"是指下述核酸片段，其发挥控制一个或多个基因 转录的功能，就转录方向而言位于基因转录起点的上游，并且在结构上通过DNA-依赖型 RNA聚合酶结合位点、转录起点和本领域技术人员已知的任何其它DNA序列的存在而被识 另IJ。"组成型"启动子是在大部分环境和发育条件下有活性的启动子。"诱导型"启动子是 在环境或发育调节下有活性的启动子。
[0029] 能够用于实现编码酶（例如NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶或引入本发明真核细 胞中的任何其它酶）的核苷酸序列表达的启动子对编码待表达的酶的核苷酸序列而言可 以不是天然的，即对与之可操作地连接的核苷酸序列（编码序列）而言异源的启动子。优 选地，所述启动子对宿主细胞而言是同源的，即内源的。
[0030] 本文上下文中合适的启动子既包括组成型又包括诱导型的天然启动子以及经改 造的启动子，所述启动子是本领域技术人员公知的。真核宿主细胞中合适的启动子可以是 GAL7、GAL10 或GAL1、CYC1、HIS3、ADH1、PGL、PH05、GAPDH、ADC1、TRP1、URA3、LEU2、EN0、TPI 和八(《1。其它合适的启动子包括^)(：、6?01、？61(1、了￡?1和了011。
[0031] 通常，编码酶的核苷酸序列包含终止子。本发明中可以使用在真核细胞中有功能 的任何终止子。优选的终止子得自宿主细胞的天然基因。合适的终止子序列是本领域公知 的。优选地，这类终止子与下述突变组合，所述突变防止本发明宿主细胞中无义介导的mRNA 衰退（见例如Shirley等，2〇〇2,Genetics比1:1465_1482) 〇
[0032] 在一个优选的实施方案中，可以过量表达编码NAD(H)-依赖型延胡索酸还原酶的 核苷酸序列