烟草赤星病的人工接种方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物保护领域的病菌接种方法，特别涉及烟草赤星病的人工接种方 法。
【背景技术】
[0002] 烟草赤星病是由链格抱菌（AlternariaalternataFriesKeissler)引起的一种 叶部真菌病害，发生于烟草生长中后期，是烟草生产上威胁较大的病害之一。该病具有潜育 期短、流行速度快的特点，在适宜的环境条件下，短时间内即可造成大流行，给烟叶生产带 来巨大损失。自20世纪90年代以后，我国烟草赤星病的发生逐年上升，且愈趋严重，成为 主要的侵染性病害之一。因此，科学的控制赤星病是生产上亟待解决的问题。利用抗病品 种是防治烟草赤星病最为有效的措施，这就有必要确定赤星病病菌的致病性强弱及优势菌 群，并进行烟草种质资源与品种抗病性鉴定与筛选工作。这其中就牵涉到快速、简便、有效 的人工接种方法，
[0003] 因为依靠田间自然发病鉴定，调查困难，费时费力，周期长，而温室接种试验场地 较为费工，人工接种法可节省菌液、劳力、试材和设备，且环境条件可控、稳定，不受干扰，接 种简单、发病快速、结果更为准确可靠，因此探索出室内人工接种赤星病菌的适宜方法，是 对快捷有效的测定病原菌的致病力及筛选赤星病抗病品种，具有很好的应用价值。
[0004] 接种是证病过程的重要环节，是研宄赤星病病原致病性、发病规律、侵染途径、品 种（材料）的抗性鉴定及控制病害等方面的有效保障，特别是在品种对烟草赤星病的抗性 研宄中，对所鉴定品种进行人工接菌诱发病害发生是品种抗性筛选研宄不可缺少的手段和 方法。目前，已报道的赤星病菌人工接种方法主要有菌丝块接种法（董汉松，曲建军，吕士 恩等.烟草赤星病菌孢子萌发和侵染条件的研宄山东科学1993(2) :30-35)、菌丝悬滴接 种法（沈奕，高智谋，杜雷等.烟草赤星病菌苗期人工接种方法的研宄安徽农业大学学报 2009, 36(3) :356-359)、孢子悬滴法（张世才.重庆烟草赤星病菌的致病力分化及遗传差异 性研宄.2009,西南大学硕士学位论文）、孢子液棉球法（成巨龙，孙渭.烟草不同发育阶段 对赤星病的抗性表现与综合防治技术.植物保护学报2001，28(1):44-48)及喷雾法（焦天 雷?烟草（NicotianatabacumL.)赤星病抗性QTL的定位分析.2011，浙江大学硕士学位 论文）；但在试验中发现，利用上述几种不同方法进行赤星病病菌接种时，对赤星病的发病 程度影响差异很大，且出现了接菌不发病或发病不理想的问题，接种方法的不成熟会限制 了病原菌与寄主互作研宄工作的开展。
【发明内容】
[0005] 为了弥补以上领域的不足，本发明提供了烟草赤星病菌的人工接种方法。
[0006] 本发明所提供的烟草赤星病菌的人工接种方法，包括如下步骤：
[0007] (1)取烟草叶片，表面经流水冲洗洁净后，取接种点，用针头刺破接种点部位的叶 片，制造伤口准备接种；
[0008] (2)用注射器吸取烟草赤星病菌的分生孢子液，从所述烟草叶片正面的接种点处 注入叶肉组织内，得到接种后的烟草叶片；所述分生孢子液的浓度为1X105孢子/mL~ 1X107孢子/mL;所述烟草赤星病菌的菌龄为5天~15天；
[0009] (3)将所述接种后的烟草叶片的叶基处保湿，并置于28~30°C的条件下黑暗培养 8小时后，再进行12小时光照黑暗交替培养；培养7~15天。
[0010] 所述步骤（1)中所述烟草叶片为烟草植株下部的成熟叶片。
[0011] 所述烟草植株下部的成熟叶片为烟株下部倒数第3片叶。
[0012] 所述步骤⑵中所述分生孢子液的浓度为1X106孢子/mL。
[0013] 所述步骤（2)中所述烟草赤星病菌的菌龄为10天或15天。
[0014] 所述步骤⑵中所述接种的量为10yL。
[0015] 所述步骤（3)中所述烟草叶片的叶基处保湿为用浸泡无菌水的脱脂棉球保湿，并 用保鲜膜覆盖保湿。
[0016] 本发明所提供的烟草赤星病菌（链格孢菌）致病性测定的室内人工接种方法，结 果表明，利用赤星病菌孢子悬浮液经离体叶片伤口注射对成熟叶片进行接种，病菌的分生 孢子可以直接进入叶片内，借助水分及寄主叶肉组织营养萌发、扩繁，向细胞间扩展，局部 组织死亡形成的病斑会得到大面积扩大。可达到接种率高，发病程度适中的效果，这为鉴定 我国烟草主产区不同赤星病菌致病性及小种差异及烟草赤星病抗性品种的筛选提供了一 种简易、方便、快速、准确的人工接种方法，具有较好的应用价值。
【附图说明】
[0017] 图1为离体叶片伤口注射法接种后10d寄主发病情况；CK:无菌水对照；A，B:供试 赤星病菌孢子悬浮液接种。
[0018] 图2为15d时接种叶片发病典型症状。
[0019] 图3为不同接种浓度下的发病情况比较（接种后第8d)。
[0020] 图4为不同叶龄的接种效果比较。
[0021] 图5为不同接种方法发病情况比较；ck;a:伤口注射法；b:菌丝块法；c:孢子液悬 滴法；d:孢子液棉球法；e:菌丝悬滴法。
【具体实施方式】
[0022] 实施例1、烟草赤星病的人工接种方法
[0023] 1.试验材料
[0024] 1. 1接种赤星病分离物及来源
[0025] 供试赤星病分离物，采用文献（孙丽萍.烟草突变体抗赤星病快速高通量筛选鉴 定方法研宄.2013,中国农业科学院硕士学位论文.）中的赤星病分离物作为本实验的供 试菌株，由本实验室保存；保存与活化菌株的培养基为马铃薯葡萄糖培养基（PDA)(方中 达?植病研宄法（第三版），2007.)。
[0026] 1.2供试品种
[0027] 烤烟品种K326(记载过该烤烟品种K326的非专利文献是："王树会，等.K326和云 烟85不同部位烟叶挥发性成分分析，烟草科技，2005, 4 :35-37"），由中国烟草总公司青州 烟草研宄所中国烟草核心种质库提供。
[0028] 1.3接种工具及测定仪器
[0029] 接种注射器为lmL医用注射器，血球计数仪测定分生孢子悬浮液浓度。
[0030] 2.试验方法及结果
[0031] 2. 1赤星病菌培养
[0032] 将低温保存的供试赤星病菌株活化后打取菌饼（d= 0. 5cm)转接