一种烟草赤星病叶片抗病性的鉴定方法
【专利摘要】本发明公开了一种烟草赤星病叶片抗病性的鉴定方法，属于烟草抗病性鉴定【技术领域】。将成熟期健康烟叶消毒、破碎，用无菌水配成4~6%的溶液；将赤星病菌产孢的菌丝点接种于培养基平板，在培养箱内24~26℃培养10~20天，产孢后用烟叶溶液将孢子洗下，静置培养7~9小时促进其萌发，得到菌悬液；当需要鉴定的烟叶进入成熟期时采样，消毒、晾干及保湿处理。吸取菌悬液10~15μl滴在烟叶上，每片烟叶滴10~16滴，将烟叶置于相对湿度≥90%，温度为24~26℃的保湿框架或人工气候箱内光照培养3~5天，待烟叶出现黄色侵染斑后，测量病斑直径，判定其抗病性。所述鉴定方法成功率高，重现性好，快速准确，检查监测便捷，不会产生由于人工接种造成的田间污染，推广应用价值较高。
【专利说明】一种烟草赤星病叶片抗病性的鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明属于烟草抗病性鉴定【技术领域】，具体涉及一种成功率高，重现性好，快速准确，检查监测便捷，无田间污染的烟草赤星病叶片抗病性鉴定方法。
【背景技术】[0002]烟草赤星病是一种危害烟草生产的严重病害，常给我国各烟区的烟叶生产带来巨大的经济损失，使选育抗赤星病的烟草品种显得尤为重要，而快速、准确、可靠且简便易行的抗病性鉴定方法能够有效缩短育种进程。在现有的鉴定方法中，田间人工病圃法鉴定周期长，易受大田生长环境影响，使接种效果不稳定，在致病结果的定量分析上也存在一定问题。赤星病菌毒素鉴定法虽然具有处理快速和适用对象多样化的特点，却与烟草赤星病的实际发病历程并不完全相同，从而对鉴定结果的可靠性产生影响，此外，实际操作中毒素浓度的确定也需投入较多的人力物力。因此，开发一种成功率高，重现性好，快速准确，检查监测便捷，无田间污染，且成本较低的烟草赤星病叶片抗病性鉴定方法是一个亟待解决的技术问题。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种成功率高，重现性好，快速准确，检查检测便捷，无田间污染的烟草赤星病叶片抗病性鉴定方法。
[0004]本发明的目的是这样实现的:一种烟草赤星病叶片抗病性的鉴定方法，包括烟叶溶液制备、病菌孢子培养、待鉴烟叶预处理及抗病性鉴定工序，具体包括:
A、烟叶溶液制备:将成熟期健康无病斑的烟叶消毒、晾干后，进行组织破碎，再用无菌水配成4~6%的烟叶溶液；
B、病菌孢子培养:将赤星病菌产生孢子的菌丝点接种于培养基平板上，在培养箱内24~26°C培养10-20天，产生孢子后用烟叶溶液将孢子洗下，继续静置培养7、小时，促进孢子萌发，得到赤星病菌孢子悬浮液，其孢子浓度为1.5^2.5X IO4个/ml，发芽率> 87% ；
C、待鉴烟叶预处理:当需要鉴定抗病性的烟草品种的烟叶进入成熟期时进行采样，将烟叶消毒后，晾干表面溶液，再进行保湿处理；
D:抗病性鉴定:吸取赤星病菌孢子悬浮液10-?5μ I滴在烟叶上，每片烟叶滴10-16滴，然后将烟叶置于相对湿度> 90%，温度为24~26°C的保湿框架或人工气候箱内光照培养3飞天，待烟叶出现黄色侵染斑后，测量病斑直径，判定烟草品种其烟叶的抗病性。
[0005]本发明具有以下有益效果:
1、本发明所述鉴定方法在室内即可进行，克服了田间人工病圃法由于大田自然条件复杂多样，影响发病的因素较多，难以精确操控和定量分析的缺点，无需大量实验面积即可顺利操作，提高鉴定结果准确性的同时，降低了鉴定成本，除了具有重现性好，快速准确，结论稳定可靠的优点外，还避免了由于人工接种造成的大田污染。
[0006]2、在赤星病菌孢子培养步骤，本发明所述鉴定方法在培养基的选择上兼顾了产孢量和萌发率两方面的要求。优选的PDA培养基、Czapek培养基产孢量大，萌发率高，配合多点接种法及适宜的培养环境设定，缩短了产孢周期，改善了产孢同步性和孢子质量稳定性，在提高鉴定效率的同时，兼顾了重现性及鉴定结果的可靠性。
[0007] 3、本发明所述鉴定方法在制备赤星病菌孢子悬浮液时，加入了烟叶溶液以促进孢子萌发，烟叶溶液较普通的葡萄糖、蔗糖溶液含有更丰富的有利于病菌孢子发芽的营养物。所优选的初熟期烟叶感病性更强，能进一步促进病菌孢子的侵染，有效提高了鉴定、监测的效率。
[0008]4、本发明所述鉴定方法在消毒步骤采用的是次氯酸钠溶液和乙醇溶液复用的消毒工艺。所述的乙醇溶液在杀灭烟叶表面微生物的同时，还具有一定的抽提作用，有利于增强赤星病菌孢子悬浮液对烟叶的渗透性，因而具有诱导感病的功效，提高了鉴定实验的成功率。
[0009]5、在待鉴烟叶预处理步骤，本发明所述方法选用初熟期的烟叶作为鉴定样本，目的是为了在考虑菌悬液孢子浓度的基础上，通过准确控制菌悬液的滴加量，兼顾鉴定试验的致病率与病斑检测的便捷性，控制病害发展的严重度，从而有利于提高鉴定的准确性和成功率。
[0010]6、在接种后的观察、监测期间，本发明所述方法对鉴定环境的温度、湿度和光照条件等都进行了较精确的设定。各工艺参数尤其是温、湿度的协同作用，能明显加速赤星病菌孢子的萌发及其对叶面的侵染，进一步缩短了鉴定周期。
[0011 ] 综上所述，本发明所述鉴定方法成功率高，重现性好，快速准确，检查监测便捷，无需大块试验面积即可实现，且不会产生由于人工接种造成的田间污染，具有较好的推广应用价值。
【具体实施方式】
[0012]下面对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换，本发明均落入本发明的保护范围。
[0013]一种烟草赤星病叶片抗病性的鉴定方法，包括烟叶溶液制备、病菌孢子培养、待鉴烟叶预处理及抗病性鉴定工序，具体包括:
A、烟叶溶液制备:将成熟期健康无病斑的烟叶消毒、晾干后，进行组织破碎，再用无菌水配成4~6%的烟叶溶液；
B、病菌孢子培养:将赤星病菌产生孢子的菌丝点接种于培养基平板上，在培养箱内24~26°C培养10-20天，产生孢子后用烟叶溶液将孢子洗下，继续静置培养7、小时，促进孢子萌发，得到赤星病菌孢子悬浮液，其孢子浓度为1.5^2.5X IO4个/ml，发芽率≥ 87% ；
C、待鉴烟叶预处理:当需要鉴定抗病性的烟草品种的烟叶进入初熟期时进行采样，将烟叶消毒后，晾干表面溶液，再进行保湿处理；
D:抗病性鉴定:吸取赤星病菌孢子悬浮液10-?5μ I滴在烟叶上，每片烟叶滴10-16滴，然后将烟叶置于相对湿度≥90%，温度为24~26°C的保湿框架或人工气候箱内光照培养3飞天，待烟叶出现黄色侵染斑后，测量病斑直径，判定烟草品种其烟叶的抗病性。
[0014]所述成熟期健康无病斑的烟叶为初熟期烟叶。
[0015]所述初熟期的烟叶为烟株任何部叶的叶片。[0016]所述烟叶消毒指的是先将烟叶置于4飞％的次氯酸钠溶液中浸泡0.8^1.2min，清水漂净后再置于75%的乙醇溶液中，浸泡2(T40s。
[0017]所述烟叶消毒优选先将烟叶置于5%的次氯酸钠溶液中浸泡lmin，清水漂净后再置于75%的乙醇溶液中，浸泡30s。
[0018]所述组织破碎采用的是研磨法。
[0019]所述接种采用的是多点接种。
[0020]所述多点接种指的是每个培养基平板接种5~7个点。[0021]所述培养基可以为燕麦培养基、PDA培养基、Czapek培养基中的任一种。
[0022]所述培养基优选为PDA培养基或Czapek培养基中的任一种。
[0023]所述病菌孢子培养优选将烟草赤星病菌接种于Czapek培养基平板上，在培养箱内25°C培养15天，产生孢子后用烟叶溶液将孢子洗下，继续静置培养8小时，促进病菌孢子萌发。
[0024]所述保湿处理指的是将烟叶置于具有保湿效果的器械内，并将加入营养液的消毒保湿材料包裹于叶柄上。
[0025]所述具有保湿效果的器械可以为人工气候箱或具有保湿效果的框架。
[0026]所述营养液可以为10%的霍氏营养液或IOOppm的烟用复合肥液中的任一种。
[0027]所述营养液优选10%的霍氏营养液。
[0028]所述保湿处理的保湿天数为3飞天。
[0029]所述滴在烟叶上指的是滴在叶片的正面，不要在主脉上。
[0030]所述吸取赤星病菌孢子悬浮液滴在烟叶上之后，将烟叶置于相对湿度为95%，温度为25°C的保湿框架或人工气候箱内光照培养4天。
[0031]所述测量病斑直径，判定烟草品种其烟叶的抗病性指的是每次试验都必须加净叶黄作为抗病对照，G140作为感病对照，对参与鉴定的烟草品种的烟叶病斑直径测量后进行方差分析，与净叶黄差异不显著的烟草品种其叶片抗病性为抗病等级，与G140差异不显著的烟草品种其叶片抗病性为感病等级，介于净叶黄和G140之间的烟草品种其叶片抗病性为中抗或中感等级。
[0032]实施例1
——NC89品种对烟草赤星病的抗病性鉴定
A、烟叶溶液制备:将初熟期健康无病斑的烟叶采摘后，首先置于5%的次氯酸钠溶液中浸泡lmin，清水漂净后再置于75%的乙醇溶液中，浸泡30s。晾干后在灭菌的研钵里磨细，进行组织破碎，用无菌水配成5%的烟叶溶液；
B、病菌孢子培养:将培养皿中已经长有赤星病菌的菌丝用消毒刀片切成小块，再转接到Czapek培养基平板上，每个平板接种6个点。置于25°C的培养箱中培养15天，产生孢子后用烟叶溶液将孢子洗下，继续静置培养8小时，促进孢子萌发，得到赤星病菌孢子悬浮液，其孢子浓度为2.3 X IO4个/ml，发芽率为88% ；
C、待鉴烟叶预处理:当需要鉴定的烟草品种的烟叶进入成熟期后，当中部叶片初熟时进行采样。首先将烟叶置于5%的次氯酸钠溶液中浸泡lmin，清水漂净后再置于75%的乙醇溶液中，浸泡30s，晾干表面溶液，并将加入了 10%的霍氏营养液的消毒棉花包裹于叶柄上。
[0033]D、抗病性鉴定:用移液枪吸取赤星病菌孢子悬浮液12 μ I滴在烟叶正面叶脉间部位，每片烟叶滴14滴，然后将烟叶置于相对湿度为95%，温度为25°C的保湿框架内培养4天，待烟叶出现黄色侵染斑后，测量病斑直径，判定烟草品种其烟叶的抗病性。抗病性鉴定用净叶黄作抗病对照，用G140作感病对照。
[0034]鉴定结果表明:NC89品种烟叶表面的病斑直径为1.7~2.0cm,对烟草赤星病表现为感病等级。
[0035]实施例2
——PVHOl和PVH06品种对烟草赤星病的抗病性鉴定
A、烟叶溶液制备:将初熟期健康无病斑的烟叶采摘后，首先置于6%的次氯酸钠溶液中浸泡0.8min，清水漂净后再置于75%的乙醇溶液中，浸泡20s。晾干后在灭菌的研钵里磨细，进行组织破碎，用无菌水配成4%的烟叶溶液；
B、病菌孢子培养:将培养皿中已经长有赤星病菌的菌丝用消毒刀片切成小块，再转接到Czapek培养基平板上，每个平板接种7个点。置于24°C的培养箱中培养10天，产生孢子后用烟叶溶液将孢子洗下，继续静置培养7小时，促进孢子萌发，得到赤星病菌孢子悬浮液，其孢子浓度为1.8X IO4个/ml，发芽率为87%;
C、待鉴烟叶预处理:当需要鉴定的烟草品种的烟叶进入成熟期后，当上二棚部叶片初熟时进行采样。首先将烟叶置于6%的次氯酸钠溶液中浸泡0.8min，清水漂净后再置于75%的乙醇溶液中，浸泡20s，晾干表面溶液，并将加入了 IOOppm的烟用复合肥液的消毒棉花包裹于叶柄上。
[0036]D、抗病性鉴定:用移液枪吸取赤星病菌孢子悬浮液15 μ I滴在烟叶正面叶脉间部位，每片烟叶滴10滴，然后将烟叶置于相对湿度为90%，温度为26°C的保湿框架内培养3天，待烟叶出现黄色侵染斑后，测量病斑直径，判定烟草品种其烟叶的抗病性。抗病性鉴定用净叶黄作抗病对照，用G140作感病对照。
[0037]鉴定结果表明:PVH01、PVH06品种烟叶表面的病斑直径分别为1.9~2.1cm和1.8~2.1cm，两个品种对烟草赤星病表现为感病等级。
[0038]实施例3
——9147、9102、9111-21新品系对烟草赤星病的抗病性鉴定
A、烟叶溶液制备:将初熟期健康无病斑的烟叶采摘后，首先置于4%的次氯酸钠溶液中浸泡1.2min，清水漂净后再置于75%的乙醇溶液中，浸泡40s。晾干后在灭菌的研钵里磨细，进行组织破碎，用无菌水配成6%的烟叶溶液；
B、病菌孢子培养:将培养皿中已经长有赤星病菌的菌丝用消毒刀片切成小块，再转接到PDA培养基平板上，每个平板接种5个点。置于26°C的培养箱中培养20天，产生孢子后用烟叶溶液将孢子洗下，继续静置培养9小时，促进孢子萌发，得到赤星病菌孢子悬浮液，其孢子浓度为2.1 X IO4个/ml，发芽率为90% ；
C、待鉴烟叶预处理:当需要鉴定的烟草品种的烟叶进入成熟期后，当上二棚部叶片初熟时进行采样。首先将烟叶置于4%的次氯酸钠溶液中浸泡1.2min，清水漂净后再置于75%的乙醇溶液中，浸泡40s，晾干表面溶液，并将加入了 IOOppm的烟用复合肥液的消毒棉花包裹于叶柄上。
[0039]D、抗病性鉴定:用移液枪吸取赤星病菌孢子悬浮液10 μ I滴在烟叶正面叶脉间部位，每片烟叶滴16滴，然后将烟叶置于相对湿度为92%，温度为24°C的保湿框架内培养5天，待烟叶出现黄色侵染斑后，测量病斑直径，判定烟草品种其烟叶的抗病性。抗病性鉴定用净叶黄作抗病对照，用G140作感病对照。
[0040]鉴定结果表明:9147、9102、9111_21三个新品系烟叶表面的病斑直径分别为1.4~1.8cm、1.4~1.7cm、1.0~1.3cm,三个新品系对烟草赤星病表现为9147和9102表现为感病等级，9111-21表现为抗病等级。/
【权利要求】
1.一种烟草赤星病叶片抗病性的鉴定方法，其特征在于包括烟叶溶液制备、病菌孢子培养、待鉴烟叶预处理及抗病性鉴定工序，具体包括: A、烟叶溶液制备:将成熟期健康无病斑的烟叶消毒、晾干后，进行组织破碎，再用无菌水配成4~6%的烟叶溶液； B、病菌孢子培养:将赤星病菌产生孢子的菌丝点接种于培养基平板上，在培养箱内24~26°C培养10-20天，产生孢子后用烟叶溶液将孢子洗下，继续静置培养7、小时，促进孢子萌发，得到赤星病菌孢子悬浮液，其孢子浓度为1.5^2.5X IO4个/ml，发芽率> 87% ； C、待鉴烟叶预处理:当需要鉴定抗病性的烟草品种的烟叶进入成熟期时进行采样，将烟叶消毒后，晾干表面溶液，再进行保湿处理； D:抗病性鉴定:吸取赤星病菌孢子悬浮液10-?5μ I滴在烟叶上，每片烟叶滴10-16滴，然后将烟叶置于相对湿度> 90%，温度为24~26°C的保湿框架或人工气候箱内光照培养3飞天，待烟叶出现黄色侵染斑后，测量病斑直径，判定烟草品种其烟叶的抗病性。
2.如权利要求1所述的烟草赤星病叶片抗病性的鉴定方法，其特征在于所述成熟期健康无病斑的烟叶为初熟期烟叶。
3.如权利要求1所述的烟草赤星病叶片抗病性的鉴定方法，其特征在于所述烟叶消毒指的是先将烟叶置于4飞％的次氯酸钠溶液中浸泡0.8^1.2min，清水漂净后再置于75%的乙醇溶液中，浸泡2(T40s。
4.如权利要求1所述的烟草赤星病叶片抗病性的鉴定方法，其特征在于所述培养基可以为燕麦培养基、PDA培养基、Czapek培养基中的任一种。
5.如权利要求4所述的烟草赤星病叶片抗病性的鉴定方法，其特征在于所述培养基为PDA培养基或Czapek培养基中的任一种。
6.如权利要求1所述的烟草赤星病叶片抗病性的鉴定方法，其特征在于所述保湿处理指的是将烟叶置于具有保湿效果的器械内，并将加入营养液的消毒保湿材料包裹于叶柄上。
7.如权利要求6所述的烟草赤星病叶片抗病性的鉴定方法，其特征在于所述营养液可以为10%的霍氏营养液、IOOppm的烟用复合肥液中的任一种。
8.如权利要求1所述的烟草赤星病叶片抗病性的鉴定方法，其特征在于所述吸取赤星病菌孢子悬浮液滴在烟叶上之后，将烟叶置于相对湿度为95%，温度为25°C的保湿框架或人工气候箱内光照培养4天。
9.如权利要求f8任一项所述的烟草赤星病叶片抗病性的鉴定方法，其特征在于所述测量病斑直径，判定烟草品种其烟叶的抗病性指的是每次试验都必须加净叶黄作为抗病对照，G140作为感病对照，对参与鉴定的烟草品种的烟叶病斑直径测量后进行方差分析，与净叶黄差异不显著的烟草品种其叶片抗病性为抗病等级，与G140差异不显著的烟草品种其叶片抗病性为感病等级，介于净叶黄和G140之间的烟草品种其叶片抗病性为中抗或中感等级。
【文档编号】C12R1/645GK103571912SQ201310540265
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月5日 优先权日:2013年11月5日
【发明者】段玉琪 申请人:云南省烟草农业科学研究院