一种富含dha破囊壶菌的培养液及培养方法
【专利摘要】本发明涉及一种富含DHA破囊壶菌的培养液和培养方法，其中培养方法包括如下步骤：a、将保藏于平板上的破囊壶菌菌落转移至10-30ml液体培养基中活化培养，用作接种液，每100ml培养液中含葡萄糖1g，蛋白胨0.15g，酵母提取物0.01g，琼脂1g；b、以大于5%的接种比例，将接种液添加至新鲜的液体培养基中培养。该方法的特点在于：破囊壶菌的培养时间为4-7天，摇床转速为100-180rpm，培养温度为15-30℃，起始pH值范围为4-8，培养液盐度为15‰-70‰。利用该方法培养破囊壶菌，其菌体DHA可达总脂肪酸含量的25-45%。
【专利说明】—种富含DHA破囊壶菌的培养液及培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及到微生物破囊壶菌的培养领域。发明了一种用于破囊壶菌的培养液及培养方法，特别地适用于富含DHA破囊壶菌的培养。
【背景技术】
[0002]DHA对于人的大脑发育至关重要，摄食一定量的DHA对人体有很多益处，如预防心血管疾病、改善老年痴呆、抑制发炎等。
[0003]破囊壶菌是一类异养的海生真菌类原生生物,现被列在管毛生物界 iStramenopi7a )、不等毛门{Heterokon ia )、网粘菌纲 iLabyrin thulomycetes )、破囊壶菌目 iThraustochytriales')'MM^mHthraustochytriaceae')。破囊壶菌广泛分布于海洋及河口栖地，目前已分离研究的破囊壶菌大致有40多个品种。
[0004]破囊壶菌可以用来生产ω-3多不饱和脂肪酸，尤其是DHA。优良的破囊壶菌菌株具有生长速度快、活性物质含量高等特点，对培养条件的耐受范围也较广。
[0005]利用海洋微生物来生产脂质，需要确定培养条件以获得较高产量。比如对于破囊壶菌积累DHA而言，温度、盐度、pH等条件都能在一定程度上影响DHA的产率。当培养温度降低时，破囊壶菌的生长情况会受到明显的影响，但DHA占总脂质的含量会提高，因此需要寻找一个合适的培养温度，以获得最高DHA产率。破囊壶菌对于培养基盐浓度的耐受范围较广，即使在蒸馏水配制的培养基中也可以生长，不过此时的生长状况并不佳。此外，一定的pH范围对于破囊壶菌积累DHA也有影响。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种富含DHA破囊壶菌的培养液及培养方法，以该方法培养破囊壶菌，可获得较高含量的DHA。
[0007]为了实习上述目的，本发明的技术方案，一种富含DHA破囊壶菌的培养方法，其特征在于:本方法主要包括如下步骤，a、首先将保藏于平板上的破囊壶菌菌落转移至10-30ml液体培养基中活化培养，培养两天后用作接种液；b、以大于5%的接种比例，将接种液添加至新鲜的液体培养基中培养。
[0008]根据本发明的方法，在培养过程中，破囊壶菌对培养条件的耐受范围广。破囊壶菌的培养时间为4-15天，培养转速为100-180rpm。通常培养温度为15_30°C，优选情况下在25-30。。。
[0009]根据本发明，培养液的盐度为15%。-70%。，起始pH值范围为4-8。
[0010]根据本发明使用的液体培养基，使用的碳源是一种糖类，此外酵母提取物和蛋白胨共同作为氮源使用。使用的培养方式包括摇瓶培养、发酵罐培养。
[0011]我们用这种方法培养破囊壶菌，在细胞生长的稳定期，收获生物量，此时细胞已经达到最大密度。获得生物质后，冷冻干燥，并对其油脂含量进行分析，实验表明，用这种方法培养破囊壶菌，其DHA的产量较高，为总脂肪酸含量的25-45%，此方法适合于富含DHA的海洋微生物破囊壶菌的培养。
[0012]通过本发明培养的破囊壶菌，细胞体内脂肪酸组成简单，主要为DHA和十六烷酸(棕榈酸)。
[0013]在本发明的优选实施方式中，破囊壶菌属于Aurant1chytrium。
【具体实施方式】
[0014]下面结合实例对本发明做进一步描述。
[0015]从沿海水域采集海水，通过棉花过滤后用来配制培养基。
[0016]破囊壶菌划线保存于琼脂培养基上，每个培养皿中含有琼脂培养基20_40ml。琼脂培养基组成如下:每10ml过滤海水中含葡萄糖Ig,蛋白胨0.15g,酵母提取物0.01g,琼脂Ig.
[0017]从上述培养皿中挑去菌落，转移至新的海水培养液中，培养液组成如下:每10ml过滤海水中含葡萄糖2g，蛋白胨0.15g，酵母提取物0.lg，KH2PO4 0.025g。先在20ml培养液中培养2天后，以5%的比例接种至新鲜培养液中。培养4天后，收集生物质，检测其DHA含量。
[0018]根据本方法,培养了四株破囊壶菌，它们属于Schizochytrium、Aurant1chytriumThraustochytrium属。摇瓶在转速为160rpm下运行。在培养了 4天后，收获生物质,用灭菌去离子水冲洗后，冷冻干燥。结果表明，当培养温度为25-30°C时，这四株破囊壶菌生长良好，干重为6-7g/L。
[0019]称取冻干的生物质，提取脂质，进行酯交换反应，采用气相色谱法检测样本中脂肪酸的组成和含量。
[0020]结果显示，当培养温度为25_30°C时，生物量的DHA含量相对较高，DHA占总脂肪酸的含量为30-35%。
【权利要求】
1.一种用于富含DHA破囊壶菌的培养方法，其特点在于:该培养方法包括如下步骤，a、将保藏于平板上的破囊壶菌菌落转移至10_30ml液体培养基中活化培养，用作接种液；b、以大于5%的接种比例，将接种液添加至新鲜的液体培养基中培养。
2.权利要求1中所述的培养液，其特点在于:每10ml培养液中含葡萄糖lg，蛋白胨0.15g，酵母提取物0.01g,琼脂lg。
3.—种生产DHA的方法，其特点在于:该方法包括如下步骤，a、在培养基中培养破囊壶菌山、在培养的稳定期收获生物质，冷冻干燥；c、称取冻干的微生物细胞提取脂质。
4.权利要求1所述的一种用于富含DHA破囊壶菌的培养方法，其特征在于:破囊壶菌的培养时间为4-7天，摇床转速为100-180rpm，培养温度为15_30°C，起始pH值范围为4-8，培养液盐度为15%。-70%。。
5.上述权利要求的任意一项方法,其中该破囊壶菌属于Aurant1chytrium。
6.上述权利要求的任意一项方法，其中葡萄糖是培养基中的唯一碳源。
7.上述权利要求的 任意一项方法，其中酵母提取物和蛋白胨共同作为氮源使用。
【文档编号】C12R1/645GK104046568SQ201310540173
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年11月5日 优先权日:2013年11月5日
【发明者】刘瑛, 张飞, 李晶晶, 张善发, 成家杨, 温志友, 袁文桥 申请人:北京大学深圳研究生院