专利名称：在蔗糖上生长的重组破囊壶菌和其组合物、制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本申请涉及在蔗糖上生长的重组破囊壶菌和包含所述重组破囊壶菌的细胞培养物，以及使用所述重组破囊壶菌生产细胞培养物、生物质、微生物油、组合物和生物燃料的方法。
背景技术：
脂肪酸基于碳链长度和饱和特性分类。根据存在于链中的碳的数目将脂肪酸称为短链、中链或长链脂肪酸，当碳原子间不存在双键时称为饱和脂肪酸，而当存在双键时称为不饱和脂肪酸。当仅存在一个双键时不饱和长链脂肪酸是单不饱和的，而当存在多于一个双键时是多不饱和的。多不饱和脂肪酸(PUFA)基于所述脂肪酸甲基末端的第一个双键的位置分类Ω-3(η-3)脂肪酸在第三个碳处包含第一个双键，而Ω-6(η-6)脂肪酸在第六个碳处包含第一个双键。例如，二十二碳六烯酸(“DHA”)是Ω-3长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)，具有22个碳的链长和6个双键，通常标为“22: 6η-3”。其他Ω -3LC-PUFA包括标为“20: 5η_3”的二十碳五烯酸(“ΕΡΑ”)和标为“22:5η-3”的Ω-3 二十二碳五烯酸(“DPA η_3”)。DHA和EPA已被称为“必需”脂肪酸。Q-6LC-PUFA包括标为“20: 4n_6”的花生四烯酸(“ARA”)和标为“22:5n-6”的Ω-6 二十二碳五烯酸(“DPA n_6，，)。Ω-3脂肪酸是生物学上重要的分子，由于其存在于细胞膜而影响细胞生理学，调节生物活性化合物的生成和基因表达，且充当生物合成底物。Roche，H. Μ.，Proc. Nutr.Soc. 58 :397-401(1999)。例如，DHA占人大脑皮层中脂质的约15%_20%、并占视网膜中月旨质的约30%-60%，其集中于睾丸和精子中，且是乳汁中的重要成分。Jean-Pascal Berge和Gilles Barnathan，“来自海洋生物脂质的脂肪酸分子生物多样性，作为生物标记的作用，生物活性化合物和经济方面”(Fatty Acids from Lipids of Marine Organisms Molecular Biodiversity, Roles as Biomarkers, Biologically Active Compounds， andEconomical Aspects)，《海洋生物技术》(Marine Biotechnology) I 49 (Τ· Scheper 编，2005) o DHA占大脑中Ω-3脂肪酸的多达97%和视网膜中Ω-3脂肪酸的多达93%。此外，DHA对胎儿和婴儿发育以及维持成人中的认知功能是必需的。同上。包括DHA和EPA在内的Ω -3脂肪酸还具有抗炎特性。参见例如同上以及Simopoulos, Α. P.，J. Am. Coll. Nutr. 21 495-595(2002)。特别的是，EPA与花生四烯酸竞争通过环氧合酶和脂氧合酶进行的二十烷类如前列腺素和白三烯的合成。同上。由于Ω-3脂肪酸不在人体内从头合成，这些脂肪酸必须获得自营养源。破囊壶菌(thraustochytrids)是破囊壶菌目(Thraustochytriales)微生物，其被认为是脂质生产的替代来源。例如，已经报道了破囊壶菌菌种的菌株以占该生物体所产生总脂肪酸的高百分比生成Ω-3脂肪酸。参见例如美国专利第5，130,242号；Huang，J.等，J. Am. Oil. Chem. Soc. 78 :605-610(2001)；和 Huang, J.等，Mar. Biotechnol. 5 450-457(2003)，以整体引用的方式并入本文。破囊壶菌还被认为是生产生物燃料的脂质来源。参见例如美国公开第2009/0064567号和WO 2008/067605，以整体引用的方式并入本文。虽然破囊壶菌代谢葡萄糖和/或果糖，它们是蔗糖的两个糖成分，但是其似乎无法天然代谢鹿糖。参见，例如，Aki等，JAOCS 80:789-794(2003) ;Yokochi等，Appl.Microbiol.Biotechnol. 49:72-76(1998) ；Honda 等，Mycol. Res. 4:439-448(1998)；Singh, World J. of Microbiology 12:76-81(1996) ；Goldstein, American J. of Botany50:271-279(1963);和美国专利第5，340，742号。由此，破囊壶菌培养，包括商业和工业培养，目前需要葡萄糖浆作为碳源和能 源，而不是更廉价的含有蔗糖的碳水化合物来源。对于产生能够在替代碳源如蔗糖上生长的破囊壶菌以在商业和工业应用中使用的需求一直存在。发明概述本发明涉及一种生产破囊壶菌细胞培养物的方法，包括(a)以包含编码异源蔗糖酶的多核苷酸序列的核酸分子转化破囊壶菌细胞，并(b)在包含蔗糖作为碳源的培养基中培养转化的破囊壶菌细胞。在一些实施方案中，蔗糖酶是转化酶。在一些实施方案中，蔗糖酶可操作地与信号肽连接。在一些实施方案中，编码异源蔗糖酶的多核苷酸序列与选自下组的序列是至少90%相同的编码登录号P00724或S33920的氨基酸序列的多核苷酸序列；编码登录号P00724或S33920的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列经密码子优化以供在裂殖壶菌属(Schizochytrium)中表达；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述方法进一步包括以包含编码异源蔗糖转运蛋白的多核苷酸序列的核酸分子转化破囊壶菌细胞。在一些实施方案中，编码异源蔗糖转运蛋白的多核苷酸序列与选自下组的序列是至少90%相同的登录号L47346或X69165的多核苷酸序列；和经密码子优化以供在裂殖壶菌属中表达的登录号L47346或X69165的多核苷酸序列。在一些实施方案中，破囊壶菌是裂殖壶菌属或破囊壶菌属(Thraustochytrium)的。在一些实施方案中，本发明涉及通过所述方法生产的破囊壶菌细胞培养物。本发明也涉及包含含有编码异源蔗糖酶的多核苷酸序列的核酸分子的破囊壶菌细胞。在一些实施方案中，蔗糖酶是转化酶。在一些实施方案中，蔗糖酶可操作地与信号肽连接。在一些实施方案中，编码异源蔗糖酶的多核苷酸序列与选自下组的序列是至少90%相同的编码登录号P00724或S33920的氨基酸序列的多核苷酸序列；编码登录号P00724或S33920的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列经密码子优化以供在裂殖壶菌属中表达；和SEQ ID N0:1或SEQ ID N0:4的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述细胞进一步包含编码异源蔗糖转运蛋白的多核苷酸序列。在一些实施方案中，编码异源蔗糖转运蛋白的多核苷酸序列与选自下组的序列是至少90%相同的登录号L47346或X69165的多核苷酸序列；和经密码子优化以供在裂殖壶菌属中表达的登录号L47346或X69165的多核苷酸序列。在一些实施方案中，破囊壶菌是裂殖壶菌属或破囊壶菌属的。本发明也涉及一种破囊壶菌培养物，其包含(a)本文所述的任何一种破囊壶菌细胞，和(b)包含蔗糖作为碳源的细胞培养基。本发明也涉及一种生产破囊壶菌生物质的方法，该方法包括(a)将本文所述的任何一种破囊壶菌细胞在包含蔗糖作为碳源的培养基中培养，并(b)从所述培养基收获生物质。本发明也涉及一种生产微生物油的方法，该方法包括(a)将本文所述的任何一种破囊壶菌细胞在包含蔗糖作为碳源的培养基中培养以生成生物质，并(b)从所述生物质提取油。本发明也涉及一种生产用于动物或人的食品、化妆品、工业组合物、或药物组合物的方法，该方法包括(a)将本文所述的任何一种破囊壶菌细胞在包含蔗糖作为碳源的培养基中培养，(b)从所述培养基收获生物质，并(C)从所述生物质制备食品、化妆品、工业组合物、或药物组合物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从生物质提取油并从所述油制备食品、化妆品、工业组合物、或药物组合物。在一些实施方案中，所述食品是婴儿配方食品。在一些实施方案中，所述婴儿配方食品适合早产儿。在一些实施方案中，所述食品是牛奶、饮料、治疗性饮品、营养饮品或其组合。在一些实施方案中，所述食品是用于动物或人食物的添加剂。在一些实施方案中，所述食品是营养补充剂。在一些实施方案中，所述食品是动物饲料。在一些实施方案中，所述动物饲料是水产养殖饲料。在一些实施方案中，所述动物饲料是家畜饲料、动物园动物饲料、役畜饲料、牲畜饲料或其组合。本发明也涉及一种生产生物 燃料的方法，该方法包括(a)将本文所述的任何一种破囊壶菌细胞在包含蔗糖作为碳源的培养基中培养以生成生物质，(b)从所述生物质提取油，并(c)通过对油进行酯交换(transesterifying),裂化油，经由热解聚加工油，将油加入石油精炼过程，或其组合生产生物燃料。在一些实施方案中，通过对油进行酯交换生产生物燃料。在一些实施方案中，生物燃料是生物柴油。在一些实施方案中，通过裂化油生产生物燃料。在一些实施方案中，生物燃料是喷气生物燃料。在一些实施方案中，通过经由热解聚加工油生产生物燃料。在一些实施方案中，生物燃料是可再生柴油。在一些实施方案中，通过将油加入石油精炼过程生产生物燃料。在一些实施方案中，生物燃料是共处理的可再生柴油(co-processed renewable diesel)。附图简述
图1显不了裂殖壶菌属的密码子选择表。图2 显示了 pSchiz-EPCT(+)-slSuc2_CL0076 的质粒图谱，也称为 pCL0076 (SEQ IDNO:2)。图3显示了来自在蔗糖-SSFM上生长的用pCL0076转化的裂殖壶菌属菌种ATCC20888的培养物的细胞沉淀的干重(g/L)。将转化体称为1-1、1-3、1-24、3-1、3-2、3-5、
3-21、4-1、4-24和4_31。“对照”是指在葡萄糖-SSFM上生长的野生型裂殖壶菌属菌种ATCC20888细胞。
图4显示了来自在蔗糖-SSFM上生长的用pCL0076转化的裂殖壶菌属菌种ATCC20888的培养物的细胞沉淀中的脂肪含量(以占干生物质的重量％表示)。将转化体称为1-1、1-3、1-24、3-1、3-2、3-5、3-21、4-1、4-24 和 4-310 “对照”是指在葡萄糖-SSFM 上生长的野生型裂殖壶菌属菌种ATCC20888细胞。图5显示了在蔗糖-SSFM上生长的用pCL0076转化的裂殖壶菌属菌种ATCC 20888的培养物随着时间(天)测量的细胞沉淀的干重(g/L)。将转化体称为1-3和3-5。“对照”是指在葡萄糖-SSFM上生长的野生型裂殖壶菌属菌种ATCC 20888细胞。图6显示了来自在蔗糖-SSFM上生长的两种转化体的培养物的细胞沉淀中的脂肪含量(以占干生物质的重量％表示)。将转化体称为1-3和3-5。“对照”是指在葡萄糖-SSFM上生长的野生型裂殖壶菌属菌种ATCC 20888细胞。图7显示了来自用PCL0076转化并在蔗糖-SSFM上生长2天或7天后收获的裂殖壶菌属菌株B76-32的培养物的细胞沉淀的干重(g/L)。2118*是指在葡萄糖-SSFM上生长的野生型裂殖壶菌属菌种ATCC 20888细胞的亚分离株。B76-32**是指在葡萄糖-SSFM上生长的B76-32亲本株。图8显示了来自用PCL0076转化并在蔗糖-SSFM上生长2天或7天后收获的裂殖壶菌属菌株B76-32的培养物的细胞沉淀的脂肪含量。每个样品的最右边的一列显示以占干生物质的重量％表示的脂肪含量。每个样品的最左边的一列显示由酰基和18个或更少的碳(浅灰色)或20个或更多的碳(中度灰色)组成的总脂肪的％。2118*是指在葡萄糖-SSFM上生长的野生型裂殖壶菌属菌种ATCC 20888细胞的亚分离株。B76-32**是指在葡萄糖-SSFM上生长的B76-32亲本株。
图9A显示了转化酶蛋白的Western印迹，而图9B显示了相应的考马斯染色的SDS-PAGE凝胶。如Western印迹顶部所示，酿酒酵母(S. cerevisiae)转化酶对照和PCL0076转化体1-3的3天培养物的上清分别以5 μ g、2. 5 μ g、1. 25μ g、和0. 625 μ g的量上样。图1OA显示了由作为蔗糖浓度的函数的反应速率说明的转化酶活性测定。图1OB显示了用于计算Km和Vmax的标准Lineweaver-Burk图。图11显示了在裂殖壶菌属分泌蛋白上检出的N-聚糖结构，如通过全甲基化的N-聚糖的NS1-总离子映射(NS1-total ion mapping)所测定的。图12显示了通过全甲基化N-聚糖的NS1-总离子映射获得的聚糖种类表。图13 显示了 pCL0120(SEQ ID NO:5)的质粒图谱。图14显示了密码子优化的核酸序列(SEQ ID NO:4)，其编码融合的来自裂殖壶菌属的SECl信号肽与来自黑曲霉(Aspergillus niger)的成熟Sucl转化酶(GenBank登录号 S33920)。图15 显示了 pCL0137_EPCT(+)-slSucl 的质粒图谱，也称为 pCL0137。发明详述本发明涉及在蔗糖上生长的重组破囊壶菌和包含所述重组破囊壶菌的细胞培养物，以及使用所述重组破囊壶菌生产细胞培养物、生物质、微生物油、组合物和生物燃料的方法。破囊壶菌
根据本发明，术语“破囊壶菌”是指破囊壶菌目(Thraustochytriales)的任何成员，其包括破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)。破囊壶菌当前的分类学地位可以简述如下界管毛生物界(Stramenopila)(Chromista)门网粘菌(Labyrinthulomycota)(不等毛门(Heterokonta))纲网粘菌纲(Labyrinthulomycetes) (Labyrinthulae)目网粘菌目(Labyrinthulales)科网粘菌科(Labyrinthulaceae)目破囊壶菌目(Thraustochytriales)科破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)对于本发明的目的而言，作为破囊壶菌描述的菌株包括如下生物体目破囊壶菌目；科破囊壶菌科；属破囊壶菌属(种菌种，arudimentale, aureum，benthicola，globosum， kinnei， motivum， multirudimentale, pachydermum， proliferum， roseum，striatum)、吾肯氏壶菌属(Ulkenia)(种菌种，amoeboidea，kerguelensis，minuta，profunda， radiata， sailens， sarkariana， schizochytrops, visurgensis， yorkensis)、裂殖壶菌属(种菌种，aggregatum，limnaceum，mangrovei, minutum，octosporum)，Japonochytrium 属(种菌种、marinum)、Aplanochytrium 属(种菌种、haliotidis，kerguelensis，profunda, stocchinoi)、Althornia 属(种菌种、crouchii)、或 Elina 属(种菌种、marisalba，sinorifica)。出于本发明的目的，吾肯氏壶菌属中描述的物种将被看作是破囊壶菌属的成员。Aurantiochytrium、Oblongichytrium、Botryochytrium、Parietichytrium和Sicyoido chytrium是本发明包括的额外的属。破囊壶菌属的菌株包括但不限于，保藏菌株PTA-10212、PTA-10213、PTA-10214、PTA-10215、 PTA-9695、 PTA-9696、 PTA-9697、 PTA-9698、 PTA-10208、 PTA-10209、PTA-10210、PTA-10211、破囊壶菌属菌种(23B) (ATCC 20891) ；Thraustochytriumstriatum (Schneider) (ATCC 24473) ；Thraustochytrium aureum(Goldstein) (ATCC34304) ；Thraustochytrium roseum(Goldstein)(ATCC 28210)；和 Japonochytrium 属菌种(LI) (ATCC 28207)。裂殖壶菌属包括但不限于 Schizochytrium aggregatum、Schizochytrium limacinum、裂殖壶菌属菌种(S31) (ATCC 20888)、裂殖壶菌属菌种(S8)(ATCC20889)、裂殖壶菌属菌种(LC-RM) (ATCC 18915)、裂殖壶菌属菌种(SR 21)，保藏菌株ATCC 28209 和保藏的 Schizochytrium limacinum 菌株 IFO 32693。在一些实施方案中，本发明的破囊壶菌细胞是Sicyoidochytrium或破囊壶菌属细胞。在一些实施方案中，破囊壶菌的属选自裂殖壶菌属菌种、Schizochytriumaggregatum、Schizochytrium limacinum、Schizochytrium minutum、破囊壶菌属菌种、Thraustochytrium striatum、Thraustochytrium aureum、Thraustochytrium roseum、Japonochytrium属菌种及其衍生株。如本发明所使用的，术语“转化”是指能够将核酸分子(即，重组核酸分子)插入本发明的破囊壶菌细胞的任何方法。在微生物体系中，术语“转化”用来描述由于微生物获得外源核酸所致的一种遗传性改变而且基本上与术语“转染”同义。用于将核酸分子引入破囊壶菌细胞的合适的转化技术，包括但不限于粒子轰击、电穿孔、显微注射，脂转染、吸附、感染和原生质体融合。虽然短语“核酸分子”主要是指物理的核酸分子而短语“核酸序列”或“多核苷酸序列”主要是指核酸分子中的核苷酸序列，但所述短语可以互换使用，尤其是能够编码蛋白的核酸分子、多核苷酸序列、或核酸序列。在一些实施方案中，利用重组DNA技术(例如，聚合酶链反应(PCR)扩增或克隆)或化学合成产生本文所述的分离的核酸分子。根据本发明，“分离的”核酸分子是已自其天然环境移出的核酸分子(即已经过人为操作)，其天然环境是该核酸分子在自然界中存在于其中的基因组或染色体。如此，“分离的”并不一定反映核酸分子已被纯化的程度，但表示该分子不包括该核酸分子在自然界中存在于其中的整个基因组或整个染色体。分离的核酸分子可以包括DNA、RNA (例如mDNA)，或DNA或RNA的衍生物(例如cDNA)。分离的核酸分子包括天然核酸分子及其同源物，包括但不限于，天然的等位基因变体和修饰的核酸分子，其中已经将核苷酸以如下方式插入、删除、取代和/或倒置，该方式使得这样的修饰在所编码的肽或蛋白的序列、功能和/或生物活性上提供期望的效果。术语“蛋白质”包括单链多肽分子以及其中单独的组分多肽通过共价或非共价手段连接的多重多肽复合物。术语“多肽”包括两个或更多个氨基酸长度的肽，通常具有超过5，10或20个氨基酸。在一些实施方案中，本文所述的多肽是异源多肽。本文使用的术语“异源”是指多肽(或多核苷酸)序列，例如，其不在本发明的破囊壶菌细胞中天然存在。裂殖壶菌属天然使用己糖和甘油而非蔗糖作为碳源。检查裂殖壶菌属的基因组数据库没有揭示蔗糖分解代谢的初始步骤所需的基因，这支持了通常的发现，即破囊壶菌代谢葡萄糖和/或果糖，它们是蔗糖的两个糖组分，但天然地不代谢蔗糖。参见，例如，Aki等，JAOCS 80:789-794(2003) ;Yokochi 等，Appl. Microbiol. Biotechnol. 49:72-76 (1998)；Honda 等，Mycol. Res. 4:439-448 (1998) ；Singh, World J. of Microbiology12:76-81(1996) ；Goldstein, American J. of Botany 50:271-279(1963);和美国专利第5，340，742 号。本发明涉及用包含编码与蔗糖代谢相关的异源多肽的多核苷酸序列的核酸分子转化的破囊壶菌细胞。在一些实施方案中，所述多肽是异源多肽。在一些实施方案中，本发明的破囊壶菌细胞包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含一种或多种编码一种或多种异源蔗糖酶、异源蔗糖转运蛋白、或其组合的多核苷酸序列。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞包含核酸分子，所述核酸分子包含编码分泌的蔗糖酶的多核苷酸序列。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞包含核酸分子，所述核酸分子包含编码胞质蔗糖酶的多核苷酸序列。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞包含核酸分子，所述核酸分子包含编码蔗糖转运蛋白的多核苷酸序列。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含一种或多种编码一种或多种异源蔗糖酶和一种异源蔗糖转运蛋白的多核苷酸序列。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含一种或多种编码一种异源胞质转化酶和一种异源蔗糖转运蛋白的多核苷酸序列。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含一种或多种编码一种异源分泌性转化酶和一种异源蔗糖转运蛋白的多核苷酸序列。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含一种或多种编码一种异源胞质转化酶、一种异源分泌性转化酶和一种异源蔗糖转运蛋白的多核苷酸序列。 在一些实施方案中，多核苷酸序列经密码子优化以使在破囊壶菌细胞中的翻译效率最大化。在一些实施方案中，将编码蔗糖酶、蔗糖转运蛋白或其组合的多核苷酸序列整合到破囊壶菌细胞的基因组中。在一些实施方案中，将编码蔗糖酶、蔗糖转运蛋白或其组合的多核苷酸序列稳定整合到破囊壶菌细胞的基因组中。蔗糖酶是催化糖苷键的水解以产生两个较小的糖的、称为糖苷水解酶(也称为糖苷酶)的酶家族的一部分。正如本文所述，“蔗糖酶”是催化蔗糖(又称saccharose或食用糖)水解为果糖和葡萄糖的酶。在某些实施方案中，蔗糖酶是转化酶、蔗糖酶-异麦芽糖酶、果聚糖酶、sacridase、β -果糖苷酶、β _呋喃果糖苷酶、果糖水解酶、鹿糖酶(saccharase)、菊糖酶、蔗糖α -葡糖水解酶、a -D-葡糖苷酶、或其组合。在一些实施方案中，鹿糖酶是来自酿酒酵母的转化酶SUC2 ;来自发酵单胞菌属(Zymomonas)的转化酶SacC;来自毕赤酵母属(Pichia)的转化酶INVl ;来自德巴利酵母属(Debaryomyces)的转化酶INV ;来自曲霉属(Aspergillus)的鹿糖酶Sucl ;来自其他真菌、原生动物、藻类、植物或真核生物来源的蔗糖酶；或其任何组合。在某些实施方案中，蔗糖酶来自原核生物来源，如棒状杆菌型细菌(coryneform bacteria)或大肠杆菌。在一些实施方案中，本发明的破囊壶菌细胞中表达的蔗糖酶包含不同于在所述蔗糖酶所源自的生物体中表达时的糖基化模式。在一些实施方案中，在破囊壶菌细胞中表达的蔗糖酶是包含高-甘露寡糖的糖蛋白。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞还包含编码糖化纤维素原料(例如甘蔗)所需的酶的多核苷酸序列。参见，例 如，美国2009/0064567，其以整体引用的方式并入本文。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞还包含编码果糖激酶、葡糖激酶、己糖激酶、或其组合的多核苷酸序列。在一些实施方案中，用于在破囊壶菌细胞中产生蔗糖酶、蔗糖转运蛋白、或其组合的表达系统包含源自破囊壶菌序列的调节元件。在一些实施方案中，用于在破囊壶菌细胞中产生蔗糖酶、蔗糖转运蛋白、或其组合的表达系统包含源自非破囊壶菌序列的调节兀件，包括源自非破囊壶菌藻类序列的序列。在一些实施方案中，表达系统包含编码鹿糖酶、蔗糖转运蛋白、或其二者的组合的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列与任意启动子序列、任意终止子序列、和/或任意在破囊壶菌细胞中有功能的其他调节序列可操作地连接。在某些实施方案中，表达系统包含编码胞质表达的蔗糖酶和蔗糖转运蛋白的多核苷酸序列。可以使用诱导型或组成型活性的调节序列。调节序列包括但不限于美国申请
发明者J.C.利普梅尔, K.E.埃普特, J.M.汉森 申请人:Dsm Ip资产公司