专利名称：生产二十二碳六烯酸(dha)的破囊壶菌菌株-sc1的制作方法
生产二十二碳六烯酸(DHA)的破囊壶菌菌株-SC1 发明领域
发明涉及篩选一种新型的未报道过的生产相当数量的二十二碳六 烯酸的破嚢壶菌(Thraustochytrid)菌林-SCl，该菌林是利用花粉饵 i秀法(Pollen baiting method)从果阿(Goa )死水中分离的。-&开 了显示生产相当数量的co -3脂肪酸的分离的有机体的脂肪酸谦。也公 开了分离的有机体的18S rRNA序列该序列表明了它们的分子系统发 生。
背景技术：
近十年来，人们对多不饱和脂肪酸(PUFAs)的营养重要性的兴趣明 显增加。多不饱和脂肪酸是含有两个或多个双键的长链脂肪酸。对它 们更加感兴趣的原因在于它们在治疗、食物和营养应用中的潜力。在 市场中它们产于选择的种子植物和一些海洋来源。但是，来自于现有 来源的提纯的PUFA产品已经无法满足正在增长的市场的需要(Gill 和Valivety 1997)。为了满足需求的预期增长并且规避鱼油的缺点， 目前正在开发PUFA的替代生产程序。
根据从脂肪酸链末端碳原子的端键位置是3C还是6C将PUFA分 为两个系列。通常将它们分为两个主要的组，co-6(co6或n-6)和co -3(co3或n-3系列)。在co-6脂肪酸中，花生四烯酸尤其重要，因 为它是多种前列腺素和类花生酸的主要前体，而在co-3脂肪酸中，目 前二十二碳六烯酸正在受到广泛关注并且被称为"必需脂肪酸"。
二十二碳六烯酸(DHA)(非饱和的、22-碳长的co-3脂肪酸)通常 发现于鱼类和海洋植物中。因为如下事实它是人脑组织的主要构造 单元，并且是脑灰质以及视网膜中的主要结构脂肪酸，所以它非常重 要。最近的发现表明，DHA低水平和某些衰老相关的行为与神经疾病 有关联，例如痴呆、抑郁、记忆丧失和视力问题，证明了 DHA对人的
生理学重要性。
WHO最近建议每日能量摄取的1-2 %为(0-3 PUFA，根据2000卡 路里的饮食摄取对应于每日大约为2. 2到4. 4 g。我们主要通过消费 海洋食物来进行co-3 PUFA的饮食摄取，这些食物具有富含w-3 PUFA 的特征。不同人群的平均摄取量是不同的。这种强烈需求导致了大规 模海洋养鱼场的形成，并且根据在饮食中co-3多不饱和脂肪酸(尤其 是DHA和二十碳五烯酸)的补充进行一些海洋鱼类幼体的正常生长和 发育(Rodriguez等人1998)。
目前，经选择的鱼油和微藻类物种是DHA的主要工业来源。具有 最高水平的EPA和DHA的鱼油包括鲭、鲱和鲑鱼。 一些鱼，例如鳕鱼、 黑线鳕，主要在肝脏中储存脂肪。虽然最好的来源是冷水鱼，例如， 金枪鱼、沙丁鱼、鲱和湖红点鲑。但是为了从鱼油中获得最大的DHA 收益，人们不得不最好吃生鱼或煮熟的鱼，而且人们应该吃腮后面鳍 周围和沿着腹部的皮，因为这些区域是储存油最多的地方。必须适切 注意的是，光、热和氧气都减少鱼油中的EPA和DHA。因为鱼油是高 度多不饱和的，所以它们会快速腐败。腐败的鱼闻起来是腥臭的，因 此不会促进食欲。来自于鱼油的PUFA或其婴儿配方包裹体也有许多缺 点。鱼油通常含有二十碳五烯酸， 一种婴儿配方中的不良成分，因为 它能导致婴儿体内花生四烯酸水平的下降。这和嬰儿体重获得率下降 有关。
并且，因为渔业的枯竭或多种变化，鱼油供应有可能是不可靠的。 人们担忧无法具有满足全球DHA需求的充足的鱼油。
作为鱼油的替代物，可以从微生物中获得PUFA。尤其是，海藻被 认为是海洋食物链中co-3多不饱和脂肪酸的主要提供者。这些海洋微 生物代表了最大比例的未描述的海洋物种(Colwell 1997)，其中海洋 微藻构成了 二十二碳六烯酸的巨大的潜在来源。
n-3油的潜在来源是被称为破囊壶菌的微-异养生物群。这是一群 非光合异养生物，目前和卵菌纲(oomycetes )与拟网祐菌 (labyrinthulids ) —起被归类于金黄藻菌鞭毛菌界
(Stramenophila )。因为裂殖壶菌(Schizochytrium )和破囊壶菌 (Thraustochytrium)属成员具有高脂容量和高水平DHA,所以人们 已经将其作为潜在的工业用w-3生产者进行了研究。这些物种有时还 被分类为海洋真菌。破囊壶菌是微异养生物(腐生生物或有时作为寄生 虫)的常见名字。破囊壶菌具有广泛的地理分布，在南极洲、北海、印 度、日本和澳大利亚分离到了其菌林(Lewis等人进行了综述，1999 )。 在活的植物中几乎找不到它们，并且看起来它们被植物抗微生物剂所 抑制。这些群体的成员经常富存于死亡的本地植物和外来植物物质中， 例如巨藻和水下的红树林叶子。它们通常存于浅海和海洋水柱(water column)和沉淀物中，包括深海。
和鱼油相比，微生物能提供稳定的脂肪酸供应，该脂肪酸能容易 地被大量生产，鱼腥味更少，并具有高纯度的DHA和其它PUFA。 最近一些研究已经罗列了破囊壶菌菌林能产生
1. 在培养中高生物量
2. 高比例的脂，作为这种生物量的一部分 3， 在脂中高比例的PUFA
论及利用破嚢壶菌产生PUFA的多数报告讨论的几乎都是DHA生 产，因为根据到目前为止的报告，这种化合物是许多破囊壶菌菌林产 生最多的PUFA。
高水平的DHA还被发现于曱藻中，例如氮源对隐甲藻 (Crypthecodinium cohni)和前沟藻(Amphidinium species)。 在已 有的科学文献中的数据表明，不同破嚢壶菌菌林在生物量、脂和最大 DHA产出中有很大不同。例如，集生裂殖壶菌(Schizochytrium aggregat認)在10天后产生0.9 g每升的生物量(Vazhappi 1 ly和 Chen，1998)，而裂殖壶菌SR21在4天后达到48 g每升的生物量 (yaguchi等人，1997)。非常清楚的是，开发微生物PUFA生产方法需 要选择合适的微生物和最优化的培养技术。
为了增加富PUFA产物的生产，需要商谈下述关键策略
1.进一步的分离、筛选和维护PUFA生产菌株已经分离了一些
具有富含DHA的油的商业生产潜力的菌林。但是，可以分离并优化具 有更高PUFA产量和/或更有吸引力的PUFA谱的破囊壶菌。对这些分离 物和化合物的需求会持续增大。
2. PUFA生产效率的优化可以通过改变培养条件容易地操纵个 别破囊壶菌菌抹生产的PUFA的类型和数量。还可以考虑使用分子技术 改进PUFA语。不同的市场将需求生产高水平PUFA的菌林，其中通过 生物量(即，PUFA产量w/w细胞量)或容量(即，产量w/v发酵培养 基)来检测生产水平。
3. 通过异养培养使用裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)生产 DHA (OmegaTech， Boulder, Colorado, USA)。裂殖壶菌菌林的一个主 要缺点是在微生物油中除了 DHA以外还产生co -6 二十二碳五烯酸(DPA) (Nakhara等人1996: Yokochi等人1998: Ratledge 2001)。目前还 不太了解DPA的营养食品特性，因此不希望在用于食物和药物应用的 油中存在此物质。从DHA中分离DPA是困难的并且是昂责的。
本发明涉及分离破嚢壶菌的数种菌林，其一些菌林产生明显数量 的二十二碳六烯酸(DHA; C22:6， n-3)，篩选自从果阿的死水中收集的 死树叶和被称为红树林的海洋维管植物的树突(dendrites)。这些菌 林在二十二碳六烯酸商业生产中将具有显著意义。
背景技术：
Huang等人根据新分离的产生二十二碳六烯酸的破嚢壶菌的多不 饱和脂肪酸镨和18SrRNA基因的比较分析，对其进行了分组。在从日 本和斐济沿岸区域收集的海水中筛选出产生明显数量的DHA的海洋微 生物的7个菌林。除了 DHA以外，它们积累其中间呼吸中间体脂肪酸。 根据18S rRNA基因中的特殊的插入序列，证明这些分离林是新的破囊 壶菌。根据分离抹和典型破嚢壶菌的18S rRNA基因的分子分析，构建 了系统树，显示出具有相同PUFAi普的菌林构成了每个聚类单元。这些 结果表明，C20-22 PUFA谱可以作为用于破囊壶菌分组的有效特征。
Fan等人在工业微生物学和生物技术杂志(the Journal of
Industrial Microbiology & Biotechnology) (2001)中发表了论文， 描述了 9种破囊壶菌菌林产生二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸和破囊 壶菌的利用豆渣的潜力。从亚热带红树林中分离出这些破囊壶菌菌株， 并且对其在葡萄糖酵母培养基中生产上述脂肪酸的潜力进行筛选。还 评价了它们利用豆渣(豆浆残渣)用于生长和EPA与DHA生产的能力。 在多数菌林中EPA产率低，而所有菌林(除了吾肯氏壶菌(Ulkenia sp.) KF13以外)在葡萄糖酵母培养基中DHA水平高，产生28. 1_41. 1%的总 脂肪酸。巨增裂殖壶菌(Schizochytriummangrovie)在25X:中发酵 52小时的DHA产率范围是747.7到2778.9 mg/L。
标题为"破囊壶菌KK17-3产生的多不饱和脂肪酸谱"的文献涉及 了利用饵诱法从日本濑户内海(Seto Inland Sea)沿岸海水和环西表 岛(Iromote Island )海水中新分离300多种产生多不饱和脂肪酸(PUFA) 的微生物菌林。产生DHA的菌林的PUFA语被分为四类。随后因为一种 名为KK17-3的菌林具有高DHA含量(总脂肪酸的52. 1%)，并且具有 范围广泛的其它PUFA，除了 DHA以外还包括花生四烯酸、二十碳五烯 酸和二十二碳五烯酸，因此选择它作进一步的研究。18SrRM基因序 列的分子系统发生分析显示，KK17-3是一种破嚢壶菌。
Bowles等人发表的另一篇文章涉及破囊壶菌的海洋原生生物成 员生产长链n-3多不饱和脂肪酸。进行分离抹的筛选，随后优化DHA 生产。在3个不同的地区进行分离程序，针对生物量、油和二十二碳 六烯酸的生产(DHA)筛选了 57个分离林。在这些分离林中DHA占总脂 肪酸的50%。 一些实验还表明，高C:N比的培养基能刺激DHA的产生。 最佳DHA生产为培养107小时后2. 17 g每升。
文章标题为"海洋微藻巨增裂殖壶菌的脂肪酸成分和角鲨烯含 量，，。该文章涉及鉴定破囊壶菌S.mangrovie中的脂肪酸组成和角鲨 烯含量，该菌林是从香港红树林产地的腐烂的秋茄树(Kandelia candel)叶子中新分离出来的。在三种mangrovie菌林中主要的脂肪 酸成分是十四烷酸、十六烷酸、二十二碳五烯酸(docosapentanoic acid)和二十二碳六烯酸。DHA是最主要的多不饱和脂肪酸，并且在
所有三种菌林中DHA的百分比(占总脂肪酸的)为32. 29到39. 14%。 专利WO9801536描述了属于斯瓦尼菌属或假交替单胞菌属的微生 物能在短期培养中产生二十二碳六烯酸。
我们的发明涉及鉴定10种未报道的破囊壶菌菌林，生长于果阿的 死水中的死树叶和被称为红树林的海洋维管植物的树突(dendrites ) 中。分离后，对有机体进行GC-MS分析来测定其总脂肪酸含量。这些 有机体的18S rRNA序列表明了它们的系统发生。通过进一步的研究， 这些有机体有可成为二十二碳六烯酸的有效的大规模生产者。
图1破囊壶菌不同菌林的脂肪酸语
序列列表
SeqID1:描述了 SCI的18S核糖体序列
SeqID2:描述了 AVE1的18S核糖体序列
SeqID3描述了 AVE2的18S核糖体序列
SeqID4描述了 AVE3的18S核糖体序列
SeqID5描述了 AVE4的18S核糖体DNA序列
SeqID6描述了 AVE5的18S核糖体DNA序列
SeqID7描述了 AVE6的18S核糖体序列
SeqID8描述了 AVE7的18S核糖体序列
SeqID9描述了 AVE8的18S核糖体DNA序列
SeqID10:描述了 AVE9的18S核糖体序列发明详述
破嚢壶菌(Thraustochytrium)菌林生长于死亡的叶子和被称为
红树林的海洋维管植物的树突中。从果阿的死水中收集这些植物的死 叶子，并通过花粉斜诱法进行分离。在含有抗生素(链霉素和青霉素)
和松树花粉粒的无菌海水中培养该叶子3天。将这些花粉再接种到含 有抗生素的无菌海水中。接种3天后，在显微镜下检测花粉。发现了 10种不同的破嚢壶菌菌林，并将其涂板到含有抗生素的MV (岩盐 -3.4%，蛋白胨-0.15%,酵母提取物-0. 1%，葡萄糖_2%， KH2P0r 0.025%, pH 7)琼脂平板上培养5天。破嚢壶菌在平板上形成克隆/ 层。在新鲜的含有抗生素的MV培养基中接种这些破囊壶菌。生长3 天后，获得纯培养物。培养破嚢壶菌5天，对细胞进行GC-MS分析， 检测总脂肪酸含量。
篩选破嚢壶菌鉴定产生大量DHA的菌林。
利用Folch提取法使用2:1 v/v的氯仿甲醇从培养物中提取总 脂。为了总脂和个别脂肪酸的定量，在提取前加入内标物(十七酸或 十五酸)。提取脂肪酸，酯化，并用Agilent 6890 N气相色谱仪-Agilent 5973质谮仪联用进行GC-MS分析，在装备有FID检查器的HP 6850 Series气相色镨仪进行GC分析。在EI模式下，70 eV(m/z 50-550; 源source温度为230"，并且四极杆(quadruple)为150°C)，使用 毛细管柱(30 m， HP-5ms， WC0T， i.d. 0.25 mm,膜厚度0.25 pm, 烘烤为150。C中2min、6t: min_1到300X:、在300X:中20 min， Helium 载气流，1.0ml/min，分流比50:1)进行GC-MS检测。对于GC-FID, 使用毛细管柱DB-23 (30m， WCOT， i.d. 0.25 mm,膜厚度0.5 nm)。 烘烤温度程序设计为在160X:中2分钟，6X: mirT1到180X:,在180 。C中2分钟，4X: miif1到230C和230X:中10分钟，使用N2栽气流， 1.5ml/min,并且进样器温度为230^ ，检测器温度为250"C，分流比 50: 1。
分离的10个菌林的脂肪酸镨见图1。
这些菌林的脂肪酸镨表明，AVE5、 AVE7和SC-1产生的DHA量相
当。AVE1也是一种相当的DHA生产者。但是，其它菌株无法生产大量 的DHA。
破囊壶菌的18s rRM序列
使用针对保守区的引物从基因组中扩增高DHA含量的SC-1、 AVE5 和AVE7的1.7kb 18s rRNA序列。对扩增出的片段进行测序。序列见 序列列表。这三种菌抹-SC-1、 AVE5和AVE7被看作为DHA生产者。 这些菌林已经保持于印度昌迪加尔的微生物技术研究所(IMTECH)典 型孩史生物菌种保藏中心和基因库(MTCC)中(Microbial Type Cuiture Collection and Grene Bank (MTCC))。
这些有待于进一步研究的有机体能够证明在大量DHA商业生产中
是非常有效的。
权利要求
1.选自破囊壶菌属的生产二十二碳六烯酸(DHA)和其它ω-3脂肪酸/脂肪酸中间体的微生物。
2. 根据权利要求1的生产w-3脂肪酸的微生物，其包含SEQ ID 1所描述的18S RNA序列。
3. 根据权利要求2的生产(0 -3脂肪酸的微生物，其生产超过30°/。 的二十二碳六烯酸。
4. 根据权利要求2的生产co -3脂肪酸的微生物，其生产超过25% 的二十二碳六烯酸。
5. 根据权利要求2的生产(0-3脂肪酸的微生物，其生产超过20% 的二十二碳六烯酸。
6. 根据权利要求2的生产w -3脂肪酸的微生物，其生产超过15% 的二十二碳六烯酸。
7. 根据权利要求2的生产w -3脂肪酸的微生物，其生产超过10% 的二十二碳六烯酸。
全文摘要
发明涉及筛选一种未报道的破囊壶菌菌株-SC1，其产生明显数量的二十二碳六烯酸(DHA)，并且除了DHA以外还积累其各自的中间体脂肪酸。已经通过花粉饵诱法从果阿的死水中分离出这种有机体。已经揭示了每个这种有机体的脂肪酸谱和18S核糖体序列，显示了其分子系统发生。通过进一步的研究该有机体可在DHA的商业生产应用中有非常重要的意义。
文档编号C11C1/00GK101370929SQ200580052523
公开日2009年2月18日 申请日期2005年12月16日 优先权日2005年12月16日
发明者K·R·拉伊亚什里, V·M·帕特尔 申请人:阿维沙基因有限公司