专利名称：从微藻制备与提取角鲨烯的工艺方法
从微藻制备与提取角鲨烯的工艺方法本发明是关于一种从破囊壶菌微藻通过发酵作用制成角鲨烯的优化生产工艺方法。从发明的意义上来说,“破囊壶菌微藻”属于裂殖弧菌，Aurantiochytrium和破囊壶菌下物种。角鲨烯是一种三萜类化合物，分子结构为三十碳五十氢的异戊二烯，其分子式为2,6,10，15，19，23-六甲基-2,6,10，14，18，22 二十四碳六烯。
这是一种所有高等生物，包括在人类身上(皮脂中可以找到)自然分泌的脂质。角鲨烯实际是胆固醇、类固醇激素和维生素D的一种生物合成的基础中间体(一种胆固醇代谢酶，角鲨烯单加氧酶，在氧化角鲨烯分子的其中一个链的同时，诱导环化作用并产生羊毛固醇，后者将转化为胆固醇和其他类固醇)。在工业中，角鲨烯主要用于食品、化妆品和医药等行业。作为食用添加，通常是被制成为角鲨烯胶囊或油制品。在化妆品领域，其分子可作为保湿霜里面的一种抗氧化剂，抗静电剂和润肤保湿齐U，迅速渗透进入皮肤，不留下痕迹，没有油腻感，与其它油和维生素混合使用效果良好。在这个领域使用的时候，请注意，由于角鲨烯性质极不稳定出个不饱和烃)，饱和形式的角鲨烷(加氢反应制得)是最佳的抗氧化剂，现在市场上售卖的也是这种，一般来说其纯度水平非常高(99% )。毒理学研究表明，按照目前在化妆品中使用的浓度，角鲨烯和角鲨烷并没有毒性，对人体皮肤无刺激，不致敏。在制药领域，角鲨烯可以用作疫苗辅助佐剂。这些佐剂物质能够刺激免疫系统，增加对疫苗的反应。以乳液形式添加到疫苗物质里，使疫苗具有更强免疫力，自1977年以来，角鲨烯已用于流感疫苗(FLUAD复立达，奇龙公司[CHIRON]，预防季节性流感的疫苗)，每剂加入10毫克的角鲨烯。由于所有的疫苗都含有角鲨烯，其乳液呈乳白色。角鲨烯也用作疫苗佐剂，尤其是实验性疫苗，抗疟疾药物或针对H5N1和2009年HlNl新型病毒的抗流感疫苗，如下-葛兰素史克公司所使用的佐剂系统AS03里用于对抗2009年流感大流行的Pandemrix和Arepanrix疫苗的专利成分，-诺华公司所使用的佐剂系统MF59里面的专利成分。角鲨烯也被用于添加到抗流感疫苗，通过产生记忆⑶4细胞刺激人体免疫反应。在销售中的产品中，这是对抗季节性流感的和病毒抗原联合制成的抗流感疫苗的第一种水包油助剂。角鲨烯的纯度在这一应用领域至关重要。事实上，如果内服，角鲨烯被视为完全安全的；但是作为注射剂，则备受质疑。事实上，在医疗领域，对服用人群的伤害风险将会剧增，如果角鲨烯含有杂质，因为根据其定义，这种助剂将会诱导人体对其杂质产生强烈的免疫反应。因此，必须获得高品质的、无杂质(杂质指极微量的金属，尤其是汞和其它有毒物质)的角鲨烯。文献中提出了几种制备角鲨烯的途径。人们常常在软骨鱼类的肝脏中发现这种化合物，如深海鲨鱼(角鲨烯因此得名)。因此,这成为鲨鱼被过度捕捞的原因之一，,鲨鱼已经因其珍贵的鳍而成为被猎杀的对象。此后，鲨鱼的肝脏也被用于出售，以生产出“有益健康”的优质胶囊。但是，即使售卖的角鲨烯主要是从鲨鱼肝脏中提取，也不能完全排除卫生问题。事实上，鲨鱼可能被病原体感染，可能产生对人体有害的物质。此外，其肝脏这样一个消除毒素和净化身体机能的器官，也可能含有对人体有害的毒素，例如CarChat0Xin。 这些令人忧虑的环境问题(鲨鱼的强烈严重退化)和卫生问题(鱼肝也储存着令人担忧的、对健康有害的毒素)，促使人们从植物提取角鲨烯。因此，从橄榄油、棕榈油、其他油类作物，或者从苋属植物、种籽、米糠、小麦胚芽中将其分离出来是有可能的。然而，这种方法存在一个重大缺点，角鲨烯在植物中含量极低，大约以重量计算占比为O. I到O. 7%。作为从鲨鱼肝脏或者植物中提取工艺的第一替代方法，往往由于需要实施大型的浓缩和净化工艺而成本高企，因此人们提出了第一种从微生物入手进行角鲨烯生产的工艺方法天然酵母或重组酵母，尤其是啤酒酵母(Saccharomyces)类型的。因此，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)生产角S烯的能力已被熟知，但是其产出物含量仍然非常低大概是O. 041毫克/克生物量(保罗·巴塔查尔吉BHATTACHARJEE等人，2001年，《世界微生物学与生物技术杂志》，第17期，第811-816页)。通过遗传重组，研究人员已经将其生产性能进行了优化处理。因此，重组酵母生产角鲨烯具有如下优势-享受和宿主细胞同等的GRAS(公认安全使用物质)地位，-无病原体，无传染性蛋白微粒，无毒素，和宿主细胞一样，并且-已经被用于疫苗领域(如这些酵母的表达载体含有乙肝抗原)。然而，正如第WO 2010/023551号医疗领域应用专利申请所指出的那样(生产的角鲨烯达到97%以上的纯度，可以用作疫苗佐剂)，在人们研制出超高产量的角鲨烯重组酵母以前(超过15%细胞干重)，这种第一替代方案还不能被工业化。然而，获取这些重组细胞需要通过分子生物学手段，实施许多重大、漫长而又复杂的代谢工程步骤，诱导产生角鲨烯的生物合成作用和抑制角鲨烯的分解代谢作用。的确是的，此外，正如在第WO 2010/023551号专利申请提出的那样，角鲨烯合成的相关基因有很多包括甲羟戊酸激酶，磷酸甲羟戊酸激酶，焦磷酸盐脱羧酶，异戊烯焦磷酸异构酶，HMGR(3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶)和角鲨烯合成酶。分解代谢作用后，转化为含有角鲨烯环氧化酶(ERGl)的麦角留醇，羊毛留醇合成酶，C-14位脱甲基酶，dl4-还原酶，C4-甲基氧化酶和C4脱羧酶(ERG26)，3-酮还原酶，C24-甲基转移酶，C8-异构酶，C5-去饱和酶，d22-脱氢酶和d24_还原酶的过程中，牵涉到为数众多的酶密码基因。
此外，其他代谢酶也必须加以考虑LEU2基因([测试]-异丙基苹果酸脱氢酶)，环氧化鲨烯环化酶，酵母固醇-24-甲基转移酶和麦角留醇_5，7. 24 (28)-三烯酚-22-脱氢酶。第二替代方案鲨鱼肝脏或植物提取工艺方面，人们已经提出了从破囊壶菌目科里提取微藻的角S烯制备工艺方法，这种方法颇具前景(包括破囊壶菌，Aurantiochytrium和裂殖弧菌)，尤其是Schizochytrium mangrovei或裂殖弧菌。这些微藻在异养条件下生产出角鲨烯(暗室；提供葡萄糖作为碳源)，并且行内的微生物发酵技师很容易操作。
0045]因此，通过控制发酵条件，这些工艺提供容易实现的提纯步骤，使角鲨烯的品质能够满足食品、化妆品和医疗领域的需求。从破囊壶菌科微藻身上产出的角鲨烯不过是和其它相关脂类化合物伴生的副产物，脂类举例如二十二碳六烯酸(或者DHA)，ω3多不饱和脂肪酸。因此，角鲨烯通常被描述为DHA商业用油不可皂化部分的其中一个成分(和类胡萝卜素和类固醇做比较)。在比较过程中，Schizochytrium mangrovei FBI的菌株生产出的DHA细胞干重大约为6. 2%，角鲨烯为0.017%。结论是，能够自然生产角鲨烯的这些微生物，其产量是非常低的-大约为O.I毫克/克生物量，破囊壶菌ACEM 6063 (参见勒维斯等人《新生物技术》，2001年，第439-447页。)-大约O. 162 毫克 / 克生物量，Schizochytrium mangrovei FBI (参见江等人，《农业和食品化学杂志》，2004年，第52期，页数1196至1200)为了提高产量，看来优化发酵条件是势在必行。在钱李等人发表在《农业和食品化学杂志》2009年，第57期，第4267-4272页的文章指出，角鲨烯是在留醇生物合成的关键中间体，角鲨烯转化为类固醇的第一步关键步骤是加氧对角鲨烯进行环氧酶催化。然而，如果人们希望实现细胞内角鲨烯的蓄积，应当避免高溶氧水平。因此，在低溶氧水平(0-5%饱和度)条件下，培养破囊壶菌ACEM6063可以使角鲨烯累积到超过I毫克/克生物量，而溶氧水平的升高(40-60% )，角鲨烯的含量也不过只达到0.01毫克/克。同样,培养温度为15°C,通过破囊壶菌ACEM 6063进行角鲨烯生产，产量可以达到
I.2毫克/克，而在20°C的时候只有0.7毫克/克(参见勒维斯等人，《新生物技术》，2001年，第3期，第439-447页)。在G.陈等人发表在《新生物技术》2010年，第27-4期，第382-389页的文章中，回顾了裂殖壶菌主要产自DHA，其途径为聚酮合成方法(简称PKS)，然而角鲨烯是通过胆固醇生物合成途径合成的，这意味着生产这两种化合物的时候，破囊壶菌的营养需求是不同的。他们的工作目的是系统地寻找不同氮源对角鲨烯产量的影响。G.陈等人发现，在含有谷氨酸钠、酵母提取物和蛋白胨氮源混合物培养基中，裂殖壶菌可以快速生长，并且蓄积“高”含量的角鲨烯。
尽管这样，所谓的“高”含量角鲨烯是相对而言。事实上，和基础培养基的产出值相比较，如果这个方法的设计人能够显著提高角鲨烯含量及产量，其提升比例分别为26. 3%和10. 1%，优化后的培养条件实际上可以提供含量为O. 72毫克/克和滴定浓度为5. 90毫克/升的角鲨烯。怀着同样的优化角鲨烯产量的目标，K. W.范等人，在《世界微生物学与生物技术杂志》2010年第26-3期第1303至1309页，使用了单加氧酶角鲨烯抑制剂(留醇生物合成的关键酶)特比萘芬(氢氧基氯化物)。行内人都了解，角鲨烯的含量和产出率和微生物培养基的培养时间相关。细胞培养基的培养时间越久，可以蓄积的角鲨烯就越少；实际上，培养基通过甾醇生物合成作用消耗更多角鲨烯。
特比萘芬的作用是，防止通过固醇途径消耗角鲨烯，并刺激了角鲨烯在细胞内的蓄积，较试验组其增量达到36至40%。但是,在本文中使用的Aurantiochytrium mangrovei FB3菌株制得的角藍烯产量是最高的，甚至远高于酿酒酵母(O. 041毫克/克生物量),甚至高于鲍圆酵母Torulasporadebrueckii (O. 24毫克/克生物量)，即使这样，这种方法也不过是O. 53毫克/克的生物量。此外，即使这种代谢作用衍生方法能够生产出相对而言更高产量的角鲨烯，由于同时限制了对于同样的细胞脂膜产生来说不可缺少的甾醇，它可能会使细胞变得脆弱。在文献中报告，使用微藻生产角鲨烯的产量最高的结果中，C-JYUE和Y.姜在《生化反应》2009年第44期第923-927页，角鲨烯最大含量为I. 17±0. 6毫克/克生物量Schizochytrium mangrovei,使用的是甲基茉莉酸,通过直接作用于角S烯合成酶-代谢作用的关键酶，这种酸被用于调节角鲨烯合成代谢作用。因此，尽管人们所作的一切努力，这些值仍然远远低于橄榄油的参考值(大约为
4.24毫克/克)，离工业规模所需要的数值差距甚远。为了研制出一种比现存技术更有效和更廉宜的方法，申请人自身已经进行了开发，其研究主要集中在优化破囊壶菌微藻发酵条件。本发明是一种能够从一百克生物量(干重)中提取以克计算重量的角鲨烯的工艺方法，也就是说，比该领域的文献中通常描述的含量高出一千倍。本发明还涉及这种方法制备发酵培养基，并从中提取和提纯角鲨烯的工艺方法。通过裂殖壶菌发酵生产角鲨烯首先，申请人的功绩在于它发现在所有的发酵控制参数，仅仅其中两个参数能够显著增加微藻的角鲨烯产出率。这两个关键参数是培养基温度和维生素添加剂，更明确地说，是维生素BI，B6和尤其是维生素B12。本发明是关于一种从破囊壶菌微藻通过发酵取得角鲨烯的生产工艺方法，其特点是包括以下步骤-在25_35°C之间，在28_32°C之间更好，最好是在大约30°C左右，培养破囊壶菌微藻，并且-按每升培养基1-1000微克的比例向培养基添加维生素B12。
更好的做法是，正如下面所述，申请人建议添加〇每升培养液O. I毫克至200毫克的维生素BI，和/或〇每升培养液O. I毫克至200毫克的维生素B6。当然，该方法还包含一个高角鲨烯生物量回收步骤和/或者角鲨烯的回收和提取步骤。具体来说，下列市面上销售的菌株经过我们的测试-裂殖壶菌。参考号ATCC20888，-Aurantiochytrium。参考号 ATCC PRA 276， 此外，申请人还拥有自己的生产菌株，裂殖壶菌菌株，裂殖壶菌，2011年4月14日于法国向法国国家微生物保藏中心提交的第CNCMI-4469号菌种(裂殖壶菌R0Q425 (Schizochytrium sp. R0Q425)),以及于2009年6月2日向武汉大学(中华人民共和国武汉，邮政编码430072)的中国典型培养物保藏中心提交的号码为M 209118的菌种(裂殖壶菌 080129 (Schizochytrium sp. 080129))。还有一种Schizochytrium mangrovei菌株进行了试样测试,例证如下。特别值得一提的是，本发明使用的工艺方法，可以使每100克生物量干重生产出含量大于或等于2克的角鲨烯，倾向于每100克干重产出介于2和12g之间的角鲨烯。特别是，根据详细的实验方法，可以实现角鲨烯量化生产。根据本发明，该工艺的首要基本特点是温度的选择，温度的选择将根据微藻的培养和角鲨烯的产量一并决定。温度范围为25至35°C，28至32°C时更好，最好是维持在大约30°C左右。申请人:首先克服了技术偏见，这种偏见认为微藻培养基不应超过25°C。事实上，在大部分上面引用的使用破囊壶菌生产角鲨烯的文章中，生产温度被设定为先前的研究微藻生长温度，即15°C，22°C或25°C的温度。根据本发明的工艺方法，申请人提出了相反的建议，在28_32°C之间培养这些微藻，因为申请人注意到-如果产出的角鲨烯细胞生物量浓度随温度增加到33°C而增加，超过30°C时的生物量显著降低，从而限制了角鲨烯的滴定浓度，-在25°C的温度，角鲨烯的浓度检测不到或非常低。这个温度范围是微藻培养的最佳温度和角鲨烯有效生产的最佳温度之间的一个折中范围。因此，高于25°C的温度并不和目前普遍实施的技术背道而驰，这个温度是有利于
角鲨烯产量的最佳温度。根据本发明，其工艺方法的第二个基本特征是，为了生产角鲨烯而添加到裂殖弧菌的维生素B12的数量，每公升培养基添加大约1-1000微克的维生素B12。更好的做法是，除了添加维生素B12以外，还补充添加〇每升培养液0. I毫克至200毫克的维生素B 1，和/或〇每升培养液0. I毫克至200毫克的维生素B6。在上述有关通过微藻生产角鲨烯的文献中，维生素的作用未被考虑在内。供给维生素的传统做法是添加酵母提取物。
实际上这早已经是业内人士所熟知的，维生素在酵母提取物中自然存在，其比例如下-50至120毫克/公斤的维生素BI (硫胺素)-40至80毫克/公斤的维生素B6 (吡哆醇)-I至5. 5毫克/公斤的维生素B12 (氰基钴胺素cyanocobalamin)这里仅列出这三种B族维生素。然而，放入培养基作为营养物的酵母提取物，其比例每100毫升培养基只有I到2克(参见上述科学论文)，对应的维生素剂量极其低(例如，维生素B12，通过酵母提取物提供的维生素B12含量仅相当于O. 07毫克/升)。总而言之，所有这些文件既未描述也未建议在使用微藻进行角鲨烯生产的时候， 控制维生素BI，维生素B6和B12的含量。由于未受任何理论的约束，申请人发现，在角鲨烯生产中维生素B12决定性作用(如下面举例所示)，显示其是参与角鲨烯生物合成的某些关键酶的辅助因子。至于维生素BI，它会促进亮氨酸降解作用，这会增加细胞内的角鲨烯前驱物数量，而维生素B6，会改变细胞色素的作用，避免角鲨烯降解。申请人:发现，供给维生素B12，并且将温度调整到28-30°C，是大幅提高角鲨烯产量的关键(达到每一百克干重制取出克重级的规模)，并且供给维生素BI和B6，实际上可以增加角鲨烯的生产效率，如下显示。根据本发明，其工艺方法的另外一个特点是，供给维生素是在整个发酵过程实施的，或者在某些阶段，而不仅仅是在生产阶段。但是，在整个发酵工艺过程中，应该遵守介于I和1000毫克/升的维生素B12的
添加量。传统上来说，在使用微藻进行角鲨烯生产的实验室条件优化工作相关的文献里，研究人员是在接种程序和传统微生物生产的基础上进行发酵，这些生产条件也是最普遍研究的方向。使用破囊壶菌生产角鲨烯实际上分为三个连续的阶段从琼脂平板上将菌落分离出来，预培养使菌株成活，最后是真正意义上的培养(=生产)。举例说，在上述G.陈的文章中，我们发现他的方法包括以下连续的步骤-在含有葡萄糖、谷氨酸钠、酵母提取物和各种微量兀素的琼脂营养培养基上培养的菌株，-在放置在轨道式振荡器的锥形烧瓶里进行预培养，pH值6，温度为25°C，以获得成活的生物量。-从培养中的锥形烧瓶里接种另外一个系列，使用和预培养基同样的培养基，拿取约O. 5% (v/v)的上一个步骤得到的生物量，维持温度为25°C。但是，正如人们可以从这篇文章中读到的那样(可以通过本领域其他文章证实)，在培养的最后阶段，专家们采取行动，优化发酵条件。换句话说，现有技术下的优化研究，主要变换一个或者多个培养基养分，以此研究其对角鲨烯产量的影响。然而，正如下面将要讨论的，申请人提出了相反的建议，即从最早期阶段的发酵条件就开始进行控制，即使这样做似乎会使实施工业规模生产更复杂。在这个规模上，实事求是地说，接种程序可以由生产本身步骤之前的数个预培养系列步骤组成。本发明使用的工艺方法的最佳实施方式可以包括以下的步骤序列-破囊壶菌科属微藻在锥形烧瓶里面预培养大约24至36小时，温度为28°C，使用琼脂平板上分离出来的菌落，-在锥形烧瓶里面的第二个预培养阶段为时24至36小时，温度为28°C，接种体浓度1% (v/v)，从第一预培养基里接种，-在30°C下培养60至150小时，在空气调节发酵装置里面，以满足最大为45毫摩尔/升/小时氧气传输，接种浓度为O. 5至2% (v/v选择)，从第二预培养基里接种。 在这个程序链中，根据作业条件，如下所述，添加维生素在预培养阶段一次性完成，或者在两步预培养程序中完成，或者整个培养程序中一直添加。正如下文将显示；在预培养步骤里面一次性添加维生素已经取得了显著的效果，优化后的模式要求在所有步骤里实施添加。 微藻生长所必需的碳源最好是葡萄糖。申请人:则建议，控制葡萄糖的添加量，使得所提供的葡萄糖总量大约相当于重量的 15 到 22. 5%0不管怎么说，正如下文举例说明的那样，针对选择出来的裂殖弧菌菌株，首要的工作是使残糖含量非零，以重量计最多可以达到8%。至于氮源性质，申请人发现它是可以选择的，从酵母提取物，尿素，谷氨酸钠，硫酸铵这个组合里面选择单独一项或者选择组合。可能你倾向于选择酵母提取物，传统上现有技术所实施的工艺方法，尿素+维生素混合物，例如由西格玛公司销售的BME混合物试剂(β -巯基乙醇)，用量比例为5毫升/升。同样地，可以全部或者部分使用谷氨酸钠取代尿素，或使用谷氨酸钠和硫酸铵的混合物。申请人:建议切勿使用硝酸盐形式的碳源。至于培养基pH值，如下例所述，将保持在5. 5和6. 5，最好是固定在pH值6。pH值的调节可以使用业内人士所了解的任何方式，例如，通过添加2N的硫酸，然后添加8N氢氧化钠最后，溶氧率可以调节到20和0%之间的值，最好保持在5%作用，最初的阶段维持24至48小时，最好是36小时，然后任其下降到0%。关于氧的传输，可以使用业内人士所了解的任何方式调节使之不超过45毫摩尔/
升/小时。正如下文所举例证，这些作业条件下发酵后，生物量超过50克/升，最好是50至100克/升，约80克/升。每100克生物量干重的角鲨烯含量大于I克，更好的是每100克生物量干重2至15克，最好是每100克生物量干重5至10克。发酵培养基上提取和提纯角鲨烯
生物量的回收是使用行内人士了解的任何方法从发酵培养基中回收的，例如，生物量可以从发酵装置中提取，仅仅需要微滤浓缩或离心浓缩，连续地使用水溶剂浓缩-稀释法清洗。提取脂类进行细胞破碎可以通过各种不同的途径，这些途径包括机械、化工、酶作用。通过几个连续的提取过程，向细胞裂解液添加正己烷/乙醇提取。正己烷馏分是单独的步骤，等正己烷蒸发后，将原油分离出来。最后，本发明还涉及到使用本发明的其中任意一个工业方法生产出来的角鲨烯的利用，如何将其用于医疗、化妆品和食品领域产品组成成分的制备。这样，本发明还涉及到使用本发明的任意一种工艺方法，应用于医疗、化妆品和食品领域产品组成成分的角鲨烯制备方法，这种方法包含应用本发明的任意一种工艺进行角鲨烯生产，以及应用于医疗、化 妆品和食品领域产品的组成成分的制备。为了更好的理解本发明，以下举例其性质是说明性的，而不是限定性的。例I :研究添加维生素BI，B6和B12及温度对角鲨烯产量的影响预培养某和培养某这里所说的微藻发酵分为两个连续预培养阶段，之后是培养/生产本身的阶段。在这个实验中，在第一个预培养阶段必须添加维生素，但在第二个预培养阶段和生产阶段中是可选的。预培养基的组成成分如下表一和下表二所示表一
第一个预培养阶段的培养基％
葡萄糖__3_
—酵母提取物O. 4
谷氨酸钠__6.42
'氯化钠1.25
1 酸镁O. 4
氯化钾__O. 05
—氯化钙O. 01
I氢酸钠O. 05
磷酸二氢钾__O. 4
维生素混合物^ O. 14
微量元素I 0.8 '表二
第二个预培养阶段的培养基％
葡萄糖__8.57
I母提取物6. 42
'谷氨酸钠O. 64
^氯化钠2
_硫酸镁O. 64
氯化钾__2. 29
—氯化钙O. 03
I氢酸钠O. 03
_硫酸钠O. 03
添加维生素混合物^ O. 14
微量元素I 0.2 —
通常使用Clerol消泡剂“FBA3107”，浓度为I毫升/升。最后，使用50毫克/升的青霉素G “钠盐“，防止细菌生长，防止污染。葡萄糖与磷酸二氢钾一起消毒，和剩余培养基的消毒分开，这样可以避免沉淀物(磷酸镁铵)的形成。维生素混合物和微量元素进行无菌过滤后添加。培养基/生产成分如表三所不。表三
权利要求
1.从属于破囊壶菌目的微藻生产角鲨烯的方法，其特征在于所述方法包含以下步骤-在25至35°C，优选在28至32°C，更优选在大约30°C的温度，培养属于破囊壶菌目的微藻，以及 -在预培养基或培养基中添加每升预培养基或培养基I到1000微克的维生素B12。
2.根据权利要求I的方法，其特征在于添加 〇每升培养基中O. I毫克至200毫克的维生素BI，和/或 〇每升培养基中O. I毫克至200毫克的维生素B6。
3.根据权利要求I或2的方法，其特征在于破囊壶菌目的微藻选自裂殖弧菌(Schizochytrium sp.), Aurantiochytrium sp·，和破囊壶菌(Thraustochytrium sp.)。
4.根据权利要求I到3任一项的方法，其特征在于破囊壶菌目的微藻选自保藏编号为ATCC 20888的裂殖弧菌，保藏编号为ATCC PRA276的Aurantiochytrium sp.和在法国国家微生物保藏中心保藏的保藏编号为CNCM 1-4469的裂殖弧菌菌株。
5.根据权利要求I到4任一项的方法，其特征在于所获得的角鲨烯含量为每100克干重的生物质大于或者等于2克，优选为每100克干重的生物质2至12克。
6.根据权利要求I到5任一项的方法，其特征在于属于破囊壶菌目的微藻经以下连续的步骤进行培养 -使用锥形烧瓶从琼脂平板上分离出来的菌落在28°C的温度下进行24至36小时的第一预培养， -使用锥形烧瓶用第一预培养物的I % (v/v)接种物，在28°C的温度下进行24至36小时的第二预培养， -用第二预培养物的O. 5至2% (v/v)接种物在调节到维持至多45毫摩尔/升/小时氧气传输的发酵器中，在30°C下进行60至150小时的培养。
7.根据权利要求6的方法，其特征在于维生素B12的添加是在两个预培养步骤期间进行的，使维生素的总含量为I至10微克/升培养基。
8.根据权利要求7的方法，其特征在于也在两个预培养步骤期间添加维生素BI和维生素B6，使维生素总含量为100至200微克/升培养基。
9.根据权利要求6的方法，其特征在于维生素B12的添加如下进行 -在两个预培养步骤期间，使维生素的总含量为I至10微克/升培养基， -在生产步骤期间，使维生素的总含量为大约1000微克/升培养基。
10.根据权利要求9的方法，其特征在于也添加维生素BI和B6 -在两个预培养步骤期间，使维生素的总含量为100至200微克/升培养基， -在生产步骤期间，使维生素的总含量为150至200毫克/升培养基。
11.根据权利要求I至10任一项的方法生产的角鲨烯在制备用于医疗、化妆品或食品工业的组合物中的应用。
全文摘要
本发明是关于应用破囊壶菌微藻生产角鲨烯的工艺方法，每100克生物量干重产出的最佳角鲨烯含量为2-12克，其特点包含了以下步骤在25至35℃温度之间，培养破囊壶菌微藻，28至32℃之间更佳，大约30℃最佳，在每升预培养基或培养基中添加1到1000微克维生素B12。
文档编号A61Q19/00GK102787140SQ20111014705
公开日2012年11月21日 申请日期2011年5月20日 优先权日2011年5月20日
发明者伯纳德·波拉, 伯纳德·考利尔, 劳伦特·塞盖拉, 塞吉·科米尼, 菲利皮·卢腾, 钱云 申请人:罗盖特兄弟公司