一种检测线粒体基因1555位a-g与1494位c-t突变的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种检测线粒体基因1555位A-G与1494位C-T突变的试剂盒，试剂盒包括含有SEQ?ID?NO.1所示的正向扩增引物、SEQ?ID?NO.2所示的反向扩增引物的PCR反应液，SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.4所示的测序引物1和测序引物2。采用PCR结合焦磷酸测序技术，用于检测患者血液DNA中线粒体基因突变。本发明的试剂盒可实时监测反应进程，反应时间短，PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序，操作简单，反应时间短，高通量，比传统的毛细管电泳测序灵敏度高，更适合于突变的分析。
【专利说明】—种检测线粒体基因1555位A-G与1494位C-T突变的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及体外核酸检测领域，采用PCR结合焦磷酸测序技术，用于检测患者血液DNA中线粒体基因突变，具体涉及检测线粒体基因1555位A-G与1494位C-T突变的试剂盒。
【背景技术】
[0002]线粒体12SrRNA基因是氨基糖苷类抗生素导致的非综合征型听力损失的一个突变热点区域。由于A1555G和C1494T突变在12SrRNA基因形成G-C和U-A配对使得与氨基糖苷类抗生素的结合更加容易，这就是为何携带这些突变的人在接触了氨基糖苷类抗生素时会出现或加重耳聋的原因。因此对这两个点突变的检测，对于预防氨基糖苷类抗生素中毒性耳聋有着重要的临床意义。目前关于线粒体耳聋基因的检测方法有多种，文献已报道的方法有:酶切法、直接测序法、基因芯片法、实时荧光定量Taqman探针法等。检测的突变热点主要是1555、1494、961等。
[0003]目前这些方法只能定性检测是否有基因突变，而且只能检测出突变细胞比率在10%-20%以上的外周血，相比于 传统测序等方法，焦磷酸测序灵敏度更高，成本更低，不仅可以定性检测是否有基因突变，而且可以获得突变的比例。
[0004]焦磷酸测序技术是一种基于聚合原理的DNA测序方法，是新一代DNA序列分析技术。它是有4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由Pyrogram转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。通过分析出峰情况，达到测定DNA序列的目的。焦磷酸测序技术产品具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行单核苷酸多态性研究和临床检验提供了非常理想的技术操作平台。
[0005]目前市场上还没有利用焦磷酸测序技术进行线粒体基因突变检测的产品。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种检测线粒体基因1555位A-G与1494位C-T突变的试剂盒，是具有特异性高、成本低、定量、准确检测线粒体基因突变的试剂盒。
[0007]为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种检测线粒体基因1555位A-G与1494位C-T突变的试剂盒包括含有SEQ ID N0.1所示的正向扩增引物、SEQ ID N0.2所示的反向扩增引物的PCR反应液，SEQ ID N0.3、SEQID N0.4所示的测序引物I和测序引物2。
[0008]正向扩增引物SEQ ID N0.1:5’ -GGCCCTGAAGCGCGTACACA-3’ (mtDNAntl463-1482)。[0009]反向扩增引物SEQ ID N0.2:5’ -biotin-TGGGTTTGGGGCTAGGTTTA-3’ (mtDNAntl673-1692)。
[0010]测序引物I SEQ ID N0.3:5，-GCCCTGAAGCGCGTACACAC-3，(mtDNA ntl464_1483)。
[0011]测序引物2SEQ ID N0.4:5，-TACGCATTTATATAGAGGAG-3’ (mtDNA ntl535_1554)。
[0012]所述试剂盒中含有空白对照品，所述空白对照品为水。
[0013]试剂盒含有A1555G与C1494T突变的阳性对照品。
[0014]测序引物I的序列与正向扩增引物SEQ ID N0.1相同。
[0015]所述的PCR反应液中其他组分为常规的10 X PCR Buffer、dNTPs和H2O,各组分按常规体积比配制:10 X PCR Buffer、dNTPs和H2O和反应液中引物的体积比为5: 3: 36:10
[0016]试剂盒中其他试剂及溶液为PCR和DNA焦磷酸测序的常规试剂，其中包含有DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、荧光素酶和双磷酸酶组成的酶混合物，由5’ -磷酰硫酸和荧光素组成的底物混合物，尿嘧啶DNA糖基化酶，Taq聚合酶。
[0017]其中，反向扩增引物SEQ ID N0.2的5’端进行生物素标记。正向扩增引物SEQ IDN0.1在纯度较好的情况下，也可以替代测序引物I使用。
[0018]本发明的优点及有益效果:
本发明提供的一种检测线粒体基因突变的焦磷酸测序试剂盒，定性、定量准确，具有灵敏度高、特异性强的优点，样品处理简单，测序速度快，高通量，半个小时完成一次上机反应，直接给出检测位点的频率分 析，结果直观。
[0019]由于设计了灵敏度高，特异性好的引物，并且选择了合适的方法，本发明的试剂盒能够对线粒体基因突变进行快速检测。本发明的试剂盒可实时监测反应进程，反应时间短，PCR产物简单处理即可上焦磷酸测序仪测序，操作简单，反应时间短，高通量，比传统的毛细管电泳测序灵敏度高，更适合于突变的分析。
[0020]【专利附图】
【附图说明】
图1野生型线粒体基因1555位点焦磷酸测序结果。
[0021]图2突变型型线粒体基因1555位点焦磷酸测序结果。
[0022]图3野生型线粒体基因1494位点焦磷酸测序结果。
[0023]图4突变型线粒体基因1494位点焦磷酸测序结果。
【具体实施方式】
[0024]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0025]实施例1试剂盒的制备
1、引物和探针的设计与合成
研究表明，目前与药物性耳聋密切相关的突变位点为1555、1494。使用PyroMark AssayDesign2.0软件设计引物；其中扩增引物和测序引物先经过PAGE纯化，再经HPLC纯化，其中SEQ ID N0.2的5，端为生物素标记。
[0026]扩增引物与测序引物序列为:正向扩增引物 SEQ ID N0.1:5，-GGCCCTGAAGCGCGTACACA-3，(mtDNA ntl463_1482)；反向扩增引物 SEQ ID N0.2:5’-biotin-TGGGTTTGGGGCTAGGTTTA-3’(mtDNAntl673-1692)，扩增产物为 230bp ；
测序引物 I SEQ ID N0.3:5，-GCCCTGAAGCGCGTACACAC-3，(mtDNA ntl464_1483)，用于检测线粒体基因C1494T突变；
测序引物2 SEQ ID N0.4:5，-TACGCATTTATATAGAGGAG-3，(mtDNA ntl535_1554)，用于检测线粒体基因A1555G突变。 [0027]实施例2试剂盒的使用
1、样本检测
溶解引物干粉(引物溶解后有效期为I个月)。按照模板数配制体系:取PCR反应液，加入溶解好的引物、UNG酶、Taq DNA聚合酶，分装体系，加入样品DNA、空白对照为模板，组成PCR反应体系。按照PCR反应程序进行PCR扩增。50 μ L反应体系各主要成分如下:PCR反应液45 μ L、UNG酶0.05 μ L、Taq酶0.5 μ L、正反向扩增引物各I μ L、模板2 μ L，其余为超纯水。
[0028]该体系PCR 反应程序:(l)95°C，5min，l 个循环；(2) 95 °C, 30s, 50 °C, 30s, 72 °C,30s, 30 个循环；(3) 72°C,7min, I 个循环；(4) 4 °C, holding, I 个循环。
[0029]扩增完成后，琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，以进行下一步程序。
[0030]2、焦磷酸测序
按照焦磷酸测序标准操作规程进行测序操作。
[0031]2.1在PCR板中,准备微珠预混液配制(每管)，Beads:2μ I,Binding Buffer:20 μ 1，模板:10-20 μ 1，用超纯水补足至60 μ I ;震荡20min。
[0032]2.2测序样品准备:清洗探头2-3次，最后一次将探头竖直举起，抽出残余水分，将70%乙醇、变性液、洗液倒入相应的位置；加入碱基和酶、底物，将Cartridge放入仪器，在酶标板中，准备预混液(每管):Aneal Buffer: 40 μ I,测序引物(IOOpmol):0.2 μ I ;探头吸附微珠预混液:探头放置70%乙醇，看到液体从管中出来，探头竖直举起；探头放置变性液，看到液体从管中出来，探头竖直举起；探头放置洗液，看到液体从管中出来，探头竖直举起直至水抽干；将探头对准酶标板，关闭真空，停留3S后，探头置入酶标版，轻轻晃动探头；将酶标板80°C 2min,室温直至手感不热,放入仪器。打开software,运行即可。
[0033]3、结果判断
质控品碱基检出率为100% ;空白对照检测不到碱基频率。
[0034]4、结果报告
样本结果的判断标准为:1555位点A≥90%，G ^ 10%，为正常的野生型；1494位点C≥90%, T ( 10%,为正常的野生型；1555位点G≥90%, A ( 10%,为A1555G突变型；1494位点T≤90%, C ( 10%,为C1494T突变型。
[0035]以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用来限定本发明的实施范围；如果不脱离本发明的精神和范围，对本发明进行修改或者等同替换，均应涵盖在本发明权利要求的保护范围当中。
【权利要求】
1.一种检测线粒体基因1555位A-G与1494位C-T突变的试剂盒，其特征在于:试剂盒包括含有SEQ ID N0.1所示的正向扩增引物、SEQ ID N0.2所示的反向扩增引物的PCR反应液，SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4所示的测序引物I和测序引物2。
2.根据权利要求1所述的检测线粒体基因A1555G与C1494T突变的试剂盒，其特征在于:正向扩增引物 SEQ ID N0.1:5’ -GGCCCTGAAGCGCGTACACA-3’ mtDNA ntl463_1482 ；反向扩增引物 SEQ ID N0.2:5’-biotin-TGGGTTTGGGGCTAGGTTTA-3’ mtDNA ntl673_1692 ；测序引物 I SEQ ID N0.3:5，-GCCCTGAAGCGCGTACACAC-3，mtDNA ntl464_1483 ;测序引物 2SEQ ID N0.4:5’ -TACGCATTTATATAGAGGAG-3’ mtDNA ntl535_1554。
3.如权利要求1所述的检测线粒体基因1555位A-G与1494位C-T突变的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中含有空白对照品。
4.如权利要求6所述的检测线粒体基因1555位A-G与1494位C-T突变的试剂盒，其特征在于:所述空白对照品为水。
5.如权利要求1所述的检测线粒体基因1555位A-G与1494位C-T突变的试剂盒，其特征在于:试剂盒含有A1555G与C1494T突变的阳性对照品。
6.如权利要求1所述的检测线粒体基因1555位A-G与1494位C-T突变的试剂盒，其特征在于:测序引物I的序列与正向扩增引物SEQ ID N0.1相同。
7.根据权利要求1所述的检测线粒体基因1555位A-G与1494位C-T突变的试剂盒，其特征在于:所述的PCR反应液中其他组分为常规的IOXPCR Buffer、dNTPs和H2O,各组分按常规体积 比配制:10XPCR Buffer、dNTPs和H2O和反应液中引物的体积比为5: 3: 36:10
【文档编号】C12Q1/68GK103540676SQ201310540246
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年11月5日 优先权日:2013年11月5日
【发明者】林文津, 郭舜民, 徐榕青, 张亚敏 申请人:福建省医学科学研究院