一种囊酵母及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物技术领域，具体而言，涉及一株利用橙子皮粉产果胶酶的囊酵母(Zygoascus sp.)及其应用。
【背景技术】
[0002]果胶是植物中由一系列包含部分甲基酯化的半乳糖醛酸亚单位通过a-1，4-糖苷键连接的复杂结构多糖。果胶物质是植物细胞壁成分之一，存在于相邻细胞壁间的胞间层中，起着将细胞粘在一起的作用。柑橘、柠檬、柚子等果皮中约含30%果胶，是果胶的最丰富来源。
[0003]果胶酶是能分解果胶物质的复合酶类的总称。果胶酶按其对果胶底物作用的方式可分为四类:原果胶酶，聚半乳糖醛酸酶，裂解酶和果胶酯酶。多年来，果胶酶已应用于几种传统的工业生产过程，例如果汁提取，纺织加工和棉纤维的生物煮练，植物韧皮纤维脱胶，废水处理，咖啡和茶发酵，动物饲料，植物病毒的纯化，石油开采，饮料和葡萄酒。
[0004]果胶酶可以从植物或从诸如细菌和真菌的微生物中分离，但植物天然来源的果胶酶产量低且提取困难，难以大规模制备。目前微生物已成为生产果胶酶的优良生物资源，主要包括 Aspergillus Niger、Rhizopus oryzae、Rhizomucor meihei 等，黑曲霉是工业生产果胶酶最为安全常见的真菌菌种，但果胶酶的产量和质量均不能满足食品工业的需求。选育新的高产果胶酶优良菌种，是果胶酶工业化生产的关键。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种产果胶酶的囊酵母(Zygoascus sp.)及其应用。
[0006]为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验反复进行菌种选育研宄，并最终从武汉纸坊宁港柑橘总场的土壤中筛选到一株产果胶酶的囊酵母(Zygoascus sp.)，通过对其进行培养条件及培养基优化，提高了该菌株的产酶水平，为果胶酶的工业化生产和应用提供了基础。
[0007]具体地，本发明获得了一株产果胶酶能力较强的囊酵母，命名为囊酵母(Zygoascus sp.)XHV25，已于2015年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉，保藏编号为:CCTCC NO:M 2015183。
[0008]本发明涉及的产果胶酶的囊酵母(Zygoascus sp.)XHV25具有如下生物学特征:
[0009]形态学特征:菌落呈椭圆形，乳白色，表面光滑，边缘较圆整。
[0010]生理特性:利用葡萄糖、果糖、鼠李糖、鹿糖、木糖醇、山梨糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇以及半乳糖等等。
[0011]代谢特性:代谢过程能产果胶酶。
[0012]最优的发酵培养条件为:发酵时间48h，温度31°C，接种量4%，初始pH5.5，装液量25mL/250mL ;培养基成分:碳源橙子皮粉含量为20g/L，氮源蛋白胨含量为6g/L，NaCl Ig/L，MgSO41g/L, K2HPO4.3H20 lg/L，KH2PO40.5g/L，pH 自然。
[0013]与现有技术相比，本发明所获得的囊酵母(Zygoascus sp.)XHV25不仅能产果胶酶，更重要的是能利用橙子皮粉作为碳源，有效地解决了农业废弃物的再生利用，降低生产成本，减少环境污染，提高产品附加价值。
【附图说明】
[0014]图1为初始pH对酶活的影响柱形图；
[0015]图2为摇床转速对酶活的影响柱形图；
[0016]图3为接种量对酶活的影响柱形图；
[0017]图4为装液量对酶活的影响柱形图；
[0018]图5为温度对酶活的影响柱形图；
[0019]图6为发酵时间对酶活的影响柱形图；
[0020]图7为碳源种类对酶活的影响柱形图；
[0021]图8为碳源添加量对酶活的影响柱形图；
[0022]图9为氮源种类对酶活的影响柱形图；
[0023]图10为氮源添加量对酶活的影响柱形图。
【具体实施方式】
[0024]以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0025]实施例一:菌种的选育
[0026](I)培养基
[0027]每IL所述富集培养基含有:牛肉膏5g，蛋白胨5g，葡萄糖3g，NaCl lg, MgSO4Ig,K2HPO4.3H20 lg，KH2PO40.5g，所述液体培养基 pH 自然;
[0028]每IL所述选择性分离培养基含有:果胶5g，NaN0s3g, NaCl lg, MgSO4Ig,K2HPO4.3H20 lg, KH2PO40.5g，溴酚蓝0.lg，琼脂20g，所述平板固体培养基pH自然；
[0029]每IL所述摇瓶种子培养基含有:葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母提取物10g，所述液体培养基PH自然；
[0030]每IL所述固体斜面培养基含有:葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母提取物10g，琼脂20g，所述斜面固体培养基pH自然；
[0031]每IL所述摇瓶上复筛发酵培养基含有:桔皮粉20g，蛋白胨5g，NaCl lg,MgSO4Ig,K2HPO4.3H20 lg, KH2PO40.5g，所述液体培养基 pH 自然。
[0032](2)实验中所用溶液
[0033]无菌生理盐水:取8.0g氯化钠溶于IL的蒸饱水中溶解，0.1MPa灭菌20min。
[0034](3)实验步骤
[0035]从武汉纸坊宁港柑橘总场的土壤、腐烂的水果和咸宁精华苎麻纺织厂的废水、淤泥等处采集样品。取样品约1g置于适量无菌生理盐水中，充分搅拌静置后吸取4mL接种于10mL富集培养基，30°C摇床震荡培养24h。取0.5mL富集培养后的菌悬液进行适当梯度稀释，再取0.1mL不同稀释度的菌悬液涂布于初筛培养基上，30°C培养箱培养48h后，挑选出能使溴酚蓝平板生成黄色圈的单菌落进行菌株划线分离纯化；将纯化好的菌株接种于初筛平板上培养60h后，测量其变色圈(Dp)及菌落(Dc)直径，挑选Dp/Dc值较大的菌株作为复筛的出发菌株。取初筛得到的Dp/Dc值较大的菌株接种于液态初筛培养基中，30°C摇床震荡培养24h后，再取3mL培养液接种于50mL/250mL发酵培养基中，30°C摇床震荡培养48h。取发酵液9000r/min离心15min，吸取上清液适当稀释后作为稀释粗酶液，采用DNS法测定粗酶液中果胶酶活力，筛选出酶活力较高的菌株。
[0036]通过摇瓶发酵试验验证，获得了一株利用橙子皮粉产果胶酶的囊酵母，命名为囊酵母(Zygoascus sp.)XHV25，于2015年3月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为:CCTCC M 2015183。
[0037]实施例二:囊酵母(Zygoascus sp.)XHV25的发酵条件优化
[0038](I)菌株:实施例一筛选出的囊酵母(Zy