专利名称：一种适冷性海洋酵母Bohai Sea-9145低温碱性脂肪酶基因、氨基酸序列及重组脂肪酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及海洋微生物克隆技术领域，特别是涉及一种适冷性海洋酵母(菌株) Bohai Sea-9145的低温碱性脂肪酶基因的克隆、氨基酸序列及重组脂肪酶酶学特征。
背景技术：
脂肪酶(Lipase EC 3. 1. 1. 3.)是一类能催化三酰甘油酯、二酰甘油酯及单酰甘油酯酯键水解的酶。脂肪酶的催化反应有两个显著特点。一是不需要辅酶，反应条件温和，副产物少；二是脂肪酶催化反应中的底物难溶于水，能在异相系统(即油-水界面)或有机相中发挥作用。脂肪酶来源广泛，动物、植物、微生物均能产脂肪酶。微生物所产的脂肪酶种类最多，由于具有比动植物脂肪酶更广范围的反应PH值、反应温度以及对底物的选择专一性， 它们在工业研究中的发展相当迅速。随着固定化技术、细胞工程、基因工程等新技术的兴起，脂肪酶的研究取得了日新月异的进步。目前，微生物脂肪酶己成为继蛋白酶、淀粉酶之后跃居世界工业酶制剂市场第三位的酶种，具有良好的发展和应用前景。因此各国纷纷开展脂肪酶的生产及应用研究。然而国内已经开发的脂肪酶市场占有率较低，现今世界上 80%的脂肪酶市场仍被丹麦诺维信(NOVO)公司所占有，且价格较高(600-1500美元/公斤)。分析原因主要有两个一是国内开发的脂肪酶的酶学性质并不能适应新的使用需求。 比如目前使用的脂肪酶大多都是中温酶(其最适温度基本都在50°C左右)，而在食品、洗涤、制药、脂类加工、环境修复等领域中，却需要低温脂肪酶的参与来进行；二是野生型产脂肪酶的微生物菌株代谢产物复杂，繁琐的提取纯化步骤提高了生产成本，降低了经济效益。 因此如何寻找性能更加稳定、功能更加完善的新型产酶微生物及构建高产酶水平的基因工程菌株是目前酶制剂行业关注的焦点。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术中存在的不足，发明人在长期从事海洋微生物的开发、生产及应用实践过程中，利用最新科学技术-分子克隆技术，在前期专利基础上，从已筛选得到的适冷性海洋解脂亚罗酵母中，通过简并引物PCR与cDNA末端快速扩增 (RACE)相结合的方法，开发提供一种适冷性海洋酵母Bohai ka-9145的低温碱性脂肪酶基因序列及利用该基因获得的重组脂肪酶。本发明提供的适冷性海洋酵母Bohai Sea-9145的低温碱性脂肪酶基因、氨基酸序列及重组脂肪酶，包括下列二部分一、适冷性海洋酵母Bohai ka-9145低温碱性脂肪酶基因(以下简称脂肪酶基因)的克隆1、适冷性海洋酵母Bohai Sea-9145脂肪酶基因组DNA的提取方法参照Adams等的国际标准方法(Adams et al.，1998)。
所述适冷性海洋酵母Bohai ka-9145作为脂肪酶基因的来源，分离自渤海海泥中。经鉴定该酵母为海洋解脂亚罗酵母的一个新的亚种。现保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为M203095 (NCBI登录号EU 086828 ；中国专利授权号 ZL200410096668. 7)。2、简并引物的设计根据不同种属微生物来源的脂肪酶基因的保守序列以及解脂亚罗酵母密码子偏好性设计简并引物Fl，Rl:Fl 5’-GTSTTYMGAGGHACYTT-3’Rl 5，-CC SARRGAGTCDCCRGT-3，上述简并引物Fl，Rl是在克隆编码海洋解脂亚罗酵母脂肪酶的基因序列时采用的。首先从生物信息网站GenBank (http //www. ncbi. nlm. nih. gov/)中查找有关脂肪酶的氨基酸序列信息，共选择了 5种不同菌株的脂肪酶氨基酸序列，分别来自黑曲霉 Aspergillus niger (ABG37906. 1)，出芽短梗霉 Aureobasidium pullulans (ABV03820. 1)， 假丝念珠菌 Candida deformans (CAD21428. 1)，得巴利汉逊酵母 Debaryomyces hanseni (XP_460224. 1)与解脂亚罗酵母 Yarrowia lipolytica(XP_500777. 1)。将 5 种脂肪酶氨基酸序列利用基因序列分析软件(DNAMAN 6.0)进行比对，比对结果见
图1。通过比对找出这5种脂肪酶的保守结构域(图中箭头所示区域)，并结合解脂亚罗酵母密码子的使用频率(图2)，去除使用频率较低的密码子，设计简并引物(Fl，Rl)用于克隆脂肪酶基因的部分序列。3、脂肪酶基因部分序列的PCR扩增反应体系
IOxPCR缓冲液 dNTPs (2.5μηιο1/ ) FI ( 50.umol/L) Rl (50[imol/L) Taq DNA聚合酶基因组DNA H2O其中所述基因组DNA为解脂亚罗酵母基因组DNA (图3. A)，PCR缓冲液、dNIPs、Taq DNA聚合酶均购自宝生物工程(大连)有限公司，引物Fl、Rl由上海生工生物技术有限公司合成。将设计好的简并引物按以下方法进行PCR扩增。反应条件预变性94°C，5分钟； 变性温度94°C，1分钟；退火温度49°C，1分钟；延伸温度72°C，1分钟；30个循环后，72°C延伸10分钟。结果见图3(B)，最终获得了大小为的一条核酸片段。4、PCR产物的回收将上述的PCR产物通过(w/v)琼脂糖凝胶电泳进行分离，电压50V，电泳20分钟。在紫外灯下切下目标带066bp)，用凝胶回收试剂盒回收。凝胶回收试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司。5汴0 产物与克隆载体( 1 19-10的连接将回收的PCR产物与pMD19-T载体连接连接体系16°C 连接 2h。其中克隆载体pMD19_T、T4DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司。6、阳性克隆的筛选将连接后产物按分子克隆实验指南(第三版，作者萨姆布鲁克)标准转化方法转入DH5ci感受态细胞中。根据α互补原理，用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷 (X-gal)与IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)对转化子进行蓝白斑初筛。其中蓝色菌落为阴性菌落，白色菌落为阳性菌落。用无菌牙签挑取白斑克隆转接于肉汤(LB)液体培养基溶液中，提取质粒并测序；最终得到了的核酸序列，见图4。绿色标注的区域分别是上下游引物。根据所获得的核酸序列利用分子生物学软件(Primer 5.0)直接推测得到了该基因片段所编码的88个氨基酸(88AA)VFRGTFSLADAITDMQFLLSPTVDDSPLWQTFSANDTTAEAQTHCEGCNHHDGFSKAFTETWYRIGHDL QKHLDANPDYQLYVTGHSL上述LB液体培养基胰蛋白胨10. Og/L，酵母粉5. Og/L，氯化钠10. 0g/L，pH7. 2到 7.5，121°C，20分钟灭菌。DH5ci感受态细胞购自宝生物工程(大连)有限公司，质粒测序由上海生工生物技术有限公司完成。7、cDNA末端快速扩增(RACE)方法获取全长脂肪酶基因1)根据上述6测序结果设计合成寡聚核苷酸引物(GSP) 1和2。GSP2 5’ -CCCAGAGAGTGGCCAGTCACGTACAG-3，GSPl 5’ -GTCTTCCGAGGAACCTTTTCGCTGG-3’2)根据上述6测序结果在合成的引物GSPl和引物GSP2内侧分别设计巢试引物 (NGSP) 1 禾口 2。NGSP2 5’ -TACAGCTGGTAGTCCGGGTTAGCGT-3，NGSPl 5’ -AGACGCGATCACGGACATGCAGTTC-3’弓丨物GSP与NGSP由上海生工生物技术有限公司合成。3)以适冷性海洋酵母(BohaiSea-91^) RNA为模板，合成cDNA第一链，然后反转录合成第二链(合成及反转录方法按分子克隆实验指南第三版标准方法进行)。以合成的 cDNA为模版，分别以GSP1(5' -RACE), GSP2 (3 ‘ -RACE)作为引物进行首轮PCR(反应条件
回收的PCR产物 T4 DNA连接酶 pMD19-T 载体 H2O
补至10 μL
3 μL 1 μL 1 μL
5如上述3所示)。将首轮扩增的5' -RACE与3' -RACE产物用无菌水稀释50倍作为模板， 利用巢试引物NGSP进行第二轮PCR扩增(反应条件如上述3所示)，结果见图5。使用巢试引物进行PCR扩增后，分别得到了大小为M^p (5' RACE产物)与880bp(3' RACE产物) 左右的两组产物(图幻，将得到的核酸序列送上海生工生物技术有限公司测序并进行序列拼接，拼接后最终得到一条大小为1206bp的编码脂肪酶的核酸序列(图6)。以上所述RACE试剂盒购自美国Clon tech公司。8、脂肪酶编码基因的生物信息学分析通过cDNA末端快速扩增(RACE)方法获得了一条完整编码脂肪酶的的基因序列(1206bp)，共编码 401 个氨基酸(图 7)。利用 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ Structure)保守区域数据库(Conserved Domain Database)分析所获得的脂肪酶氨基酸序列，显示其属于脂肪酶超家族(图8)。对所获得的脂肪酶基因序列和它编码的氨基酸序列的生物信息学分析主要检索了附表1中的网站和数据库。表1生物信息学分析网址
权利要求
1.一种适冷性海洋酵母Bohai ka-9145的低温碱性脂肪酶基因，其特征在于如附图6 的脂肪酶基因序列。
2.一种适冷性海洋酵母Bohai ka-9145低温碱性脂肪酶氨基酸序列，其特征在于如附图7的氨基酸序列。
3.—种适冷性重组低温碱性脂肪酶，其特征在于适冷性重组低温碱性脂肪酶分子量为 44KDa，该酶为单体蛋白；重组脂肪酶的最适作用PH为8. 5，该重组脂肪酶在pH7. 5-9. 5范围内保持良好的稳定性，在pH 9. 5，4°C保温浊后酶活力始终保持在91. 0%以上；重组脂肪酶在35 °C时活力最高，30°C时酶活力仍保持在91.9%，20°C时保持在 75. 1%，6(TC孵育120分钟，重组脂肪酶活性仍保持在86. 0%以上，重组脂肪酶在20-40°C 之间可以维持一个高的催化活性，在0-50°C之间具有良好的稳定性，该重组脂肪酶属于低温脂肪酶；当溶液中有Na+、Li+、Ca2+、狗3+、Si2+以lmmol/L存在时，重组脂肪酶活力有一定程度的增加，Ca2+在浓度为5mmol/L能使脂肪酶的活力增加22% ；而当酶液中有Ba2+、Co2+、Hg2+与 Ag+以5mmol/L存在时，重组脂肪酶的活力受到抑制，分别下降到最大酶活力的91 %，92%， 74%与 88% ；丝氨酸特异性抑制剂苯甲基磺酰氟在浓度为lmmol/L时对重组脂肪酶活性有轻微抑制作用，但在浓度lOmmol/L时抑制作用明显，脂肪酶的活性降低了 55% ；钙离子螯合剂乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸，在浓度为lmmol/L与lOmmol/L时，分别使重组脂肪酶的活性降低了 13%与27%，脂肪酶活性受到金属离子螯合剂乙二氨四乙酸的抑制，但不会完全丧失活性，而二硫苏糖醇与十二烷基磺酸钠对脂肪酶有保护作用；以对硝基苯基月桂酸酯为作用底物，重组脂肪酶的动力学常数Km和最大反应速度Vmax 分别为 0. 565 μ mol/L 和 0. 132mmol/min/mg。
全文摘要
本发明涉及从渤海海泥中筛选到的一株能够分泌低温碱性脂肪酶的适冷性海洋酵母菌株(Bohai Sea-9145)中，利用简并引物聚合酶链式反应(PCR)与cDNA末端快速扩增(RACE)相结合的方法克隆得到了一条编码低温碱性脂肪酶(LipY)的基因。该基因含有一个1206bp的开放阅读框(ORF)，编码401个氨基酸，在氨基端含有一个28个氨基酸的信号肽。编码的氨基酸含有脂肪酶的保守序列(G-X-S-X-G)和1个潜在的N-糖基化位点。将此脂肪酶基因克隆到真核表达载体(pIC9K)上，在巴斯德毕赤酵母(GS115)中进行异源表达。以甲醇作为诱导剂，发酵96小时后在上清液中获得了高活力的重组脂肪酶。利用镍离子亲和柱对重组脂肪酶进行纯化，得到了电泳纯的脂肪酶样品。该重组脂肪酶具有低温催化活力高、碱性条件下性能稳定等一系列优点，在日化、纺织及食品加工等低温催化领域有着广阔的应用前景。
文档编号C12N15/55GK102363786SQ201110314848
公开日2012年2月29日 申请日期2011年10月17日 优先权日2011年10月17日
发明者刘均忠, 孙谧, 王跃军, 盛军, 郝建华 申请人:中国水产科学研究院黄海水产研究所