预防西尼罗河病毒的重组假型杆状病毒Bac-G-prM/E及疫苗与应用的制作方法

专利名称：预防西尼罗河病毒的重组假型杆状病毒Bac-G-prM/E及疫苗与应用的制作方法
预防西尼罗河病毒的重组假型杆状病毒Bac-G-prM/E及疫苗与应用技术领域
本发明属于动物病毒学和动物基因工程技术领域。具体涉及一种表达西尼罗河病毒prM/E蛋白的重组假型杆状病毒株的构建、用该重组病毒制备的疫苗及其在预防西尼罗河病毒中的应用。
背景技术：
西尼罗河热(West Nile Fever,简称WNF)是由西尼罗河病毒(West Nile Virus, WNV)感染引起的人和多种动物共患的急性传染病。1937年，WNV首次在两尼罗河地区一个发烧的乌干达妇女血液中分离出来，并命名为西尼罗河病毒。1999年美国出现疫情，并于随后几年迅速扩散至全美大部分地区，导致两万多人感染，数百人死亡(Nash D.F等，The outbreak of West Nile virus infection in the New York City area in 1999. N. Engl. J. Med. 2001,344 :1807-1814)，一度引发世界性恐慌。目前，该病还没有有效的疫苗进行免疫预防。迄今为止，中国尚未发现WNV感染的临床病例，但是中国的气候、地里环境复杂，蚊虫种类繁多，具备传播条件，随着国际交流的日益频繁，WNV传入中国境内的可能性非常大。 因此，开展该病的疫苗研究，对于WNV的预防具有重要的意义。
WNV是不分节段的单股正链RNA病毒，是一种B群虫媒病毒，病毒核壳外面包裹着脂质双层膜，膜内镶嵌有前膜蛋白(premembrine protein, PrM)和包膜蛋白(envelope protein, E)。E蛋白是WNV重要的结构蛋白，属糖蛋白，具有血细胞凝集素活性，并介导病毒与宿主细的粘附和膜融合，是重要的毒力因子；而且具有很强的免疫原性，可诱发机体产生病毒中和抗体，逃避宿主免疫监督系统的攻击。而PrM蛋白对于E蛋白的正确折叠和切割具有重要作用(Beasley D.W 等，Identification of neutralizing epitopes within structural domain III of the West Nile virus envelope protein. J. Virol. 2002, 76:13097-13100.)。因此，prM/E基因作为WNV的主要免疫原性基因，是研制WNV新型疫苗的主要候选基因。NaohiiO Ohtaki选用CHO细胞系稳定的持续性共表达WNV的M前体蛋白(prM)和E蛋白形成VLPs (virus-like particles)，这种大量表达的VLPs蛋白作为免疫原能保护小鼠抵抗 WNV(Naohiro Ohtaki 等，Immunogenicity and efficacy of two types of West Nile virus-like particles different in size and maturation as a second-generation vaccine candidate. Vaccine. 2010，28 :6588-6596)。Arroyo J 等利用黄热病毒YFV-17D作为载体将WNV的prM/E蛋白阅读框取代黄热病毒自身的蛋白，构建嵌合疫苗(Arroyo J等，Chimer1-vax-West Nile virus live attenuated vaccinepreclinical evaluation of safety, immunogenicity and efficacy. J Virol. 2004. 78497-507.)。这种嵌合疫苗产生了很好的免疫效果，但是这种重组的病毒有可能产生未知的病原特性，不利于实时监控。徐敏等应用慢病毒载体包装表达WNV prM/E基因的假病毒，并通过转导哺乳动物细胞证明该基因可以在转导细胞中稳定表达，从而为基于慢病毒载体的 WNV新型疫苗开发奠定基础(徐敏等，慢病毒载体介导的西尼罗河病毒prME蛋白的表达，中国兽医科学，2010，40 :778-782)。
杆状病毒载体是目前应用十分广泛的病毒载体之一，它被广泛的应用于基因治疗、基因功能研究、疫苗开发等领域。杆状病毒是昆虫病毒中最大的一个科，其宿主范围主要集中在昆虫纲鳞翅目。目前，用于外源基因表达的昆虫杆状病毒仅限于核多角体病毒属，其中苜猜银纹蛾多粒包埋体核多角型病毒(Autographa californica mulltiple nucleopolyhedrosis virus,简称AcMNPV)和草地贪夜蛾细胞系统是国际上普遍采用的杆状病毒表达载体系统研究模型。长期以来研究者一直认为杆状病毒具有严格的宿主特异性，仅限用于介导外源基因在其受纳昆虫细胞内表达。而研究认为，在非受纳昆虫细胞中， 这种宿主特异性的产生并不是因为杆状病毒不能进入细胞，而是因为其基因不能在细胞内复制和表达(Frederick M 等，Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. PNAS. 1996. 93 :2348-2352)。1993年Luckow等成功地将杆状病毒系统改造成 Bac-to-Bac 系统(Luckow 等，Current Opinion in Biotechnology, 1993,4, 564-572),主要用于在昆虫细胞中大量表达外源基因。1995年，Hofmann等首次报道了将由巨细胞病毒极早期启动子(cytomegalovirus immediate early promoter, CMV-1E)驱动的萤光素酶基因重组至AcMNPV基因组，并用此重组AcMNPV感染几种不同的哺乳动物细胞，结果表明此重组AcMNPV能感染原代人肝细胞且高效地表达了报告基因，其介导的报告基因的表达效率高于用磷酸韩沉淀法和脂质体转染法(Hofmann C等，Efficient gene transfer into human hepatocytes by baculovirus vectors. PNAS. 1995. 2 :10099-10103)进一步的实验发现新鲜的血清能阻止病毒介导的基因投送至肝脏细胞系，而热灭活后的血清却无此现象。用缺乏各种补体成分的血清进行实验，也没有阻止病毒的侵入(Hofmann 等，Baculovirus-mediated gene transfer in the presence of human serum or blood facilitated by inhibition of the complement system. Gene Therapy. 1998. 5531-536)。水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatatis Virus，VSV)膜融合蛋白 G 蛋白是一种穿膜糖蛋白，它能利用其膜融合的活性介导病毒基因组从哺乳动物细胞内吞体中逃逸(Barsoum 等，Efficient transduction of mammalian cells by a recombinant baculovirus having the vesicular stomatitis virus G glycoprotein. Human Gene Therapy, 1997,8 :2011-2018) Aieroni等(2001)人研究证明直接注射到鼠四头肌的VSV-G 假型杆状病毒有一部分不被补体系统中和。并且这种假型杆状病毒作为疫苗使用可以诱发免疫动物产生高水平的体液免疫和细胞免疫应答(Pieroni等，In vivo gene transfer in mouse skeletal muscle mediated by baculovirus vectors. Human Gene Therapy, 2001. 12 :871-881)。YML等构建的VSV-G假型重组杆状病毒免疫小鼠，能够抵抗致死剂量的 JEV 感染(YML Immunization with pseudotype baculovirus expressing envelope protein of Japanese encephalitis virus elicits protective immunity in mice. J Gene Med,2009. 11 :57-65)。发明内容
本发明的任务 在于克服现有技术的缺陷。其第一个目的在于获得一种能够有效转导哺乳动物细胞和高效表达西尼罗河病毒PrM蛋白和E蛋白的重组假型杆状病毒。
本发明的第二个目的是利用该重组基因工程毒株制备用于防制西尼罗河病毒的基因工程疫苗。
本发明的第三个目的是利用该重组基因工程毒株在制备西尼罗河病毒基因工程疫苗上的应用。
本发明通过以下技术方案实现
一种由申请人制备的表达西尼罗河病毒prM蛋白和E蛋白的重组假型杆状病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrosis virus,简称 AcMNPV) Bac-G-prM/E，于2011年8月25日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO :V201130。
本发明重组假型杆状病毒的基本构建方法是申请人所在的农业微生物国家重点实验室已成功构建得到转移质粒PCDNA3. l_prM/E(具体构建过程见具体实施方式
)和 pFastBac-G (YML 等，Immunization with pseudotype baculovirus expressing envelope protein of Japanese encephalitis virus elicits protective immunity in mice. J Gene Med, 2009. 11 :57-65) 将来源于转移质粒 pCDNA3. 1-prM/E 的完整的表达盒即CMV-prM/E，经Bgl II和EcoR I酶切后，插入上述构建的能够表达水泡性口膜炎病毒的膜蛋白G(基因登录号AJ318514.1)的转移质粒pFastBac-G和野生型转移质粒pFastBacl (购自美国Invitrogen公司)的多克隆位点中，获得重组转移质粒 pFastBac-G-prM/E 和 pFastBac-prM/E,其中重组转移质粒 pFastBac-prM/E 中表达盒 CMV-prM/E位于原始质粒pFastBacl的pH多角启动子下游的多克隆位点中。然后将上述两种重组转移质粒转化DHlOBac大肠杆菌(E. coli DHlOBac)(购自美国Invitrogen公司)细胞中，通过转座重组(吴小铎等，利用细菌转座子构建适于家蚕的Bac-to-Bac快速基因表达系统，蚕业科学，2006，32 =183-188.)，获得含有CMV-prM/E表达盒的重组杆状病毒基因组，将上述重组杆状病毒基因组Bacmid-G-prM/E和Bacmid-prM/E转染sf9昆虫细胞(购自中国科学院上海细胞库)从而获得携带CMV-prM/E-polyA表达盒的重组假型杆状病毒 Bac-G-prM/E和Bac-prM/E。其中，重组杆状病毒Bac-prM/E用来作为重组假型杆状病毒 Bac-G-prM/E的对照，验证该重组假型杆状病毒Bac-G-prM/E是否能更有效地感染哺乳动物细胞，诱导产生更强的免疫应答反应。申请人获得的重组假型杆状病毒Bac-G-prM/E (保藏号为CCTCC NO V201130)能够共表达西尼罗河病毒(WNV)的prM/E基因。
进一步，本发明还包含利用上述的重组假型杆状病毒Bac-G-prM/E用于制备预防西尼罗河病毒的疫苗，同时还包含利用上述重组假型杆状病毒Bac-G-prM/E在制备西尼罗河病毒疫苗中的应用(具体步骤请参见实施例)。
本发明的积极效果如下
1、本发明重组的假型杆状病毒Bac-G-prM/E免疫原性好，能诱导产生高的IgG抗体和细胞免疫。
2、本发明重组的假型杆状病毒Bac-G-prM/E转导哺乳动物细胞后，不会对哺乳动物细胞产生毒性作用；在小鼠模型中，安全性高。
3、本发明重组的假型杆状病毒Bac-G-prM/E作为预防西尼罗河病毒的疫苗免疫效果好，产生的体液免疫水平及细胞免疫水平明显高于对照病毒组(P < 0.01)。


序列表SEQ ID NO :1是本发明克隆的prM/E基因的的核苷酸序列，序列全长为 2058 个bp。
图1 :是本发明构建的转移质粒pcDNA3. Ι-prM/E的图谱和对转移质粒 pcDNA3.Ι-prM/E鉴定结果。其中A :是本发明构建的转移质粒pcDNA3. Ι-prM/E图谱。B是本发明的转移质粒pcDNA3. Ι-prM/E鉴定结果。图中1 DNA marker (DL5000)；
2 pcDNA3. Ι-prM/E转移质粒经BamH I和EcoR I双酶切鉴定结果
3 :DNA marker (DL15000)。
图2 :是本发明的pFastBac-prM/E和pFastBac_G_prM/E重组转移质粒鉴定结果。
图中1 DNA marker(DL5000)；
2 pFastBac-prM/E转移质粒Kpn I酶切鉴定结果；
3 pFastBac-G-prM/E转移质粒Xho I酶切鉴定结果；
4DNA marker(DL15000)。
图3 :是本发明构建的两个重组转移质粒图谱。图中
A :是本发明的pFastBac-G-prM/E转移质粒构建流程图。
B :是本发明的pFastBac-prM/E转移质粒构建流程图。
图4 :是本发明中的重组假型杆状病毒基因组Bacmid-G-prM/E和Bacmid-prM/E 的PCR扩增鉴定的电泳图谱。
图中A Bacmid-prM/E基因组PCR扩增鉴定。
I DNA marker (DL5000)
2 P2和P3为引物，Bacmid-prM/E基因组为模板扩增结果；
3 P2和P3为引物，野生型基因组为模板扩增结果；
4DNA marker(DL15000)。
B :Bacmid-G-prM/E 基因组 PCR 扩增鉴定；
I DNA marker (DL5000)；
2 P1和P3为引物，野生型Bacmid为模板扩增结果；
3 P1和P3为引物，Bacmid-G-prM/E为模板扩增结果。
图5 :是本发明的重组假型杆状病毒构建流程。
图6 :是本发明中的重组假型杆状病毒在哺乳动物细胞中表达prM/E基因，间接免疫荧光检测分析图(ant1-E-DIII单抗为一抗)。
图中A Ba c-prM/E转导BHK-21细胞后prM/E在细胞中的表达；
B Bac-G-prM/E转导BHK-21细胞后prM/E在细胞中的表达；
C :Bac-EGFP转导BHK-21细胞作为阴性对照；
D :Bac-G-EGFP转导BHK-21细胞作为阴性对照。
图7 :是本发明中的重组假型杆状病毒在哺乳动物细胞中的表达prM/E基因 Western blot 分析图(ant1-E-DIII 单抗为一抗)。
图中1 Bac-G-prM/E转导BHK-21细胞后prM/E在细胞中的表达；
2 Bac-prM/E转导BHK-21细胞后prM/E在细胞中的表达；
3 :Bac-G-EGFP转导BHK-21细胞作为阴性对照；
4 :Bae-EGFP转导BHK-21细胞作为阴性对照；
5 :BHK-21细胞作为空白对照。
图8 :是本发明中的重组假型杆状病毒Bac-G-prM/E免疫小鼠后血清效价的检测结果。
图中3WeekS是初次免疫3周后小鼠血清ELISA效价水平；
6ffeeks是初次免疫6周后小鼠血清ELISA效价水平。
图9 :荧光相对定量RT-PCR方法检测免疫小鼠脾淋巴细胞被特异抗原刺激后 IFN- Y、TNF-a、IL-2、IL-6 的 mRNA 水平。
图中Bac-G-prM/EIO9 :滴度为 10lclpfu/ml Bac-G-prM/E 免疫组；
Bac-G-prM/E IO8 :滴度为 109pfu/ml Bac-G-prM/E 免疫组；
Bac-prM/E IO9 :滴度为 10lclpfu/ml Bac-prM/E 免疫组；
Bac-prM/E IO8 :滴度为 109pfu/ml Bac-G-prM/E 免疫组；
E-DIII pro. :E_DIII 蛋白免疫组;
Bac-G-EGFP IO9 :滴度为 10lclpfu/ml Bac-G-EGFP 免疫对照组；
Bac-EGFP IO9 :滴度为 10lclpfu/ml Bac-GFP 对照组；
PBS :PBS空白免疫对照组。
图10 :是重组假型杆状病毒免疫小鼠后ELISA检测脾淋巴细胞被特异抗原刺激后 IFN-Y的分泌水平。
图中Bac-G_prM/EIO9 :滴度为 10lclpfu/ml Bac-G-prM/E 免疫组；
Bac-G-prM/E IO8 :滴度为 109pfu/ml Bac-G-prM/E 免疫组
Bac-prM/E IO9 :滴度为 10lclpfu/ml Bac-prM/E 免疫组；
Bac-prM/E IO8 :滴度为 109pfu/ml Bac-G-prM/E 免疫组；
E-DIII pro. :E_DIII 蛋白免疫组;
Bac-G-EGFP IO9 :滴度为 10lclpfu/ml Bac-G-EGFP 免疫对照组；
Bac-EGFP IO9 :滴度为 10lclpfu/ml Bac-GFP 对照组；
PBS :PBS空白免疫对照组。
具体实施方式
以下结合说明书附图对本发明`的具体实施方式
作进一步的说明。
实施例1
l、pcDNA3. Ι-prM/E 转移质粒的构建
本发明选取的西尼罗河病毒(WNV)的prM/E基因片段(其核苷酸序列见SEQ ID NO :1所示，序列长度为2058bp)由上海生工生物工程有限公司合成。用BamH I和EcoR I双酶切(见图1A)后,插入到经BamH I和EcoR I双酶切的质粒pcDNA3. 1(+)(购自Invitrogen 公司，武汉生命技术有限公司代理)中。得到转移质粒PCDNA3. Ι-prM/E (见图1A)。用BamH I和EcoR I对构建的转移质粒pcDNA3. Ι-prM/E进行酶切鉴定，鉴定结果证实构健的质粒正确(见图1B)。
2、pFastBac-G-prM/E 和 pFastBac-prM/E 重组转移质粒的构建
以Bgl II和EcoR I双酶切含有西尼罗河病毒(WNV) prM/E基因的真核表达质粒P⑶NA3. Ι-prM/E (插入了 prM/E基因片段，其核苷酸序列见SEQ ID NO :1，序列长度为2058bp)，回收含有完整的表达盒即CMV-prM/E的片段。并插入到经BamH I和EcoR I双酶切的转移质粒pFastBac-G (在pFastBacl质粒基础上插入VSV-G-BGH ployA基因，见文献YML 等，Immunizationwith pseudotype baculovirus expressing envelope protein of Japanese encephalitis virus elicits protective immunity in mice. J Gene Med, 2009. 11 :57-65)和原始质粒pFastBacl (购自Invitrogen公司，武汉生命技术有限公司代理)中，获得本发明的重组转移质粒pFastBac-G-prM/E和pFastBac-prM/E质粒(见图3)。 用Xho I对pFastBac-G-prM/E质粒进行酶切鉴定，鉴定结果证实所构建的质粒正确(见图 2)，同时用Kpn I对pFastBac-prM/E质粒进行酶切鉴定结果证实构建质粒正确(见图2)。 具体构建流程如图3中A，B所示。3、利用同源重组的方法获得重组假型杆状病毒的基因组 Bacmid-G-prM/E 和 Bacmid-prM/E
具体步骤如下
在本实施例中，用pFastBac-G-prM/E和pFastBac-prM/E重组转移质粒转化大肠杆菌DHlOBac (购自美国Invitrogen公司(武汉生命技术有限公司代理)的Bac-to-Bac 表达系统附带的菌株；按照Bac-to-Bac表达系统的说明书操作)感受态细胞，通过转座重组方法(方法见吴小铎等，利用细菌转座子构建适于家蚕的Bac-to-Bac快速基因表达系统，蚕业科学，2006,32 :183-188)，将 pFastBac-G-prM/E 和 pFastBac-prM/E 重组转移质粒中CMV-prM/E-PolyA表达盒重组入假型杆状病毒基因组中，从而获得重组假型杆状病毒基因组Baemid-G-prM/E和Bacmid-prM/E，运用常规报道的PCR方法(参照J.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京)分别对基因组Bacmid-G-prM/E和Bacmid-prM/E进行鉴定。以Bacmid-G-prM/E基因组为摸板， 以 Pl (引物序列AAGGGAACAACCTATGG)和 P3 (引物序列AGCGGATAACAATTTCACACAGG)为引物进行PCR扩增，鉴定结果证实Bacmid-G-prM/E构建正确(见图4的B);以Bacmid-prM/ E基因组为模板，以P2(引物序列CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG)和P3 (引物序列 AGCGGATAACAATTTCACACAGG)为引物进行PCR扩增，鉴定结果证实Bacmid-prM/E构建正确 (见图4的A)。上述分别进行的PCR反应的总体积均为30ul，其中包括基因组模板各为2ul， 弓丨物各Iul，dNTTP和PCR反应Buffer各3ul，taq酶各O. 5ul，上述PCR反应采用宝生物工程(大连)有限公司生产的PCR反应试剂盒，该试剂盒包括反应缓冲液(PCR反应buffer)、 dNTP、Mgcl2及Taq酶，操作方法按该试剂盒的说明书进行)，其余用蒸馏水补齐体系。扩增的条件均为93°C,3min ;紧接着35个循环94°C，45s ;55°C，45s ；72°C,5min ;最后72°C延伸至 IOrnin0
4、重组假型杆状病毒Bac-G-prM/E的获得
应用脂质体介导转染技术(周复春等，伪狂犬病病毒鄂A株gG /LacZ+突变株的构建，畜牧兽医学报，2001，32 (2)，129-133)将重组假型杆状病毒基因组 Bacmid-G-prM/E转染sf9昆虫细胞(购自中国科学院上海细胞库，操作方法参考樊惠英报道的方法樊惠英，猪圆环病毒2型0RF2基因在昆虫细胞中的表达及其特性，生物工程学报，2005，Vol. 21 :975-978.),于 2 7°C 下用 Grace’s 培养基(购自 Invitrogen 公司，武汉生命技术有限公司代理，按照美国Invitrogen公司提供的Bac-to-Bac杆状病毒使用说明书进行操作)培养，72h后收毒，盲传三代。受重组假型杆状病毒感染的细胞能观察到细胞病变，主要表现为细胞变圆，停止分裂，折光率增强，直到细胞裂解，而且会有很明显的细胞融合现象，正常细胞则没有这种变化。将获得的重组假型杆状病毒Bac-G-prM/E在哺乳动物细胞BHK-21细胞(购自中国科学院上海细胞库)中进行表达实验，发现该重组假型杆状病毒Bac-G-prM/E和对照病毒Bac-prM/E均能介导外源基因(prM/E)进入BHK-21细胞中，并能在人巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)的驱动下高效表达西尼罗河病毒(WNV)的prM蛋白和E蛋白(见图6，7)。获得重组假型杆状病毒Bac-G-prM/E的操作过程见图5。
将上述得到的表达西尼罗河病毒prM蛋白和E蛋白的重组假型杆状病毒 Bac-G-prM/E于2011年8月25日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO :V201130。
5、重组假型杆状病毒Bac-G-prM/E基因工程疫苗的制备
将上述获得的保藏号为CCTCC NO V201130的重组假型杆状病毒Bac-G-prM/E 按照常规方法进行扩大培养，收集培养上清，运用超速离心方法(35000rpm)，离心Ih (仪器为 BECKMAN COULTER 公司生产的 Optima LE-80K Ultracentrifuge)离心后弃上清， 沉淀用 phosphate-buffered saline 憐酸盐缓冲液(即 PBS,含 NaCl 8. 0g, KCl O. 2g, Na2HPO4 · 12H20 2. 9g，KH2PO4O. 2g，补充蒸馏水至 IOOOmL,经 121 °C 高压蒸汽灭菌 30min, pH7. 4)溶解,用空斑的方法(参照上述Invitrogen公司的Bac-to-Bac表达系统提供的说明书)进行滴度测定后，将所述的重组假型杆状病毒Bac-G-prM/E稀释至lO'fu/ml， 置_80°C保存备用，即得到本发明制备的重组假型杆状病毒基因工程疫苗。
6、重组假型杆状病毒Bac-G-prM/E基因工程疫苗对小鼠的免疫效力检验
将上述制备的重组假型杆状病毒Bac-G-prM/E基因工程疫苗(设计四个实验组包括(I)注射滴度为109pfu/ml重组假型杆状病毒Bac-G-prM/E基因工程疫苗组；(2)1010pfu/ml重组假型杆状病毒Bac-G-prM/E基因工程疫苗组；(3) 109pfu/ml重组杆状病毒Bac-prM/E基因工程疫苗组；(4) 1010pfu/ml重组杆状病毒Bac-prM/E基因工程疫苗组) 分别经后腿肌肉注射6周龄的Balb/c小鼠(购自湖北省疾病预防控制中心)，每组6只， 每只小鼠注射剂量为100 μ 1，共免疫2次，首免后间隔3周。同时用PBS(配方与制备同上所述)作为免疫的阴性对照，用原核表达WNV E-DIII蛋白，经提取包涵体纯化得到的蛋白 (June Liu Characterization and application of monoclonal antibodies specifi c to West Nile virus envelope protein. Journal of Virological Methods,2008. 15420-26)作为阳性对照用，每只小鼠后退肌肉注射50ug(剂量参照Byron E. Martina等发表的方法，Byron E. Martina 等，Immunization with West Nile virus envelope domainIII protects mice against lethal infection with homologous andheterologous virus. Vaccine. 2008,26 :153-157)。重组假型杆状病毒 EGFP (YML 等，Immunization with pseudotype baculovirus expressing envelope protein of Japanese encephalitis virus elicits protective immunity in mice. J Gene Med. 2009,11 :57-65)作为假型杆状病毒野毒对照。于首免后3、6周经尾静脉负压采血，分离血清 ，检测中和抗体；于首免后6周，通过颈椎处死所有免疫Balb/c小鼠，无菌取出脾脏，利用淋巴细胞分离液(购自天津TBD公司)分离脾淋巴细胞，进行细胞免疫如IFN-Y的mRNA转录、分泌水平等检测(方法见:Xiao 等,Comparison of immune responses and protective efficacy of suicidal DNA vaccine and conventional DNA vaccine encoding glycoprotein C of pseudorabies virus in mice. Vaccine. 2004，22 :345-351)。Balb/c 小鼠首免后 3 周和 6周分别尾静脉采血，分离血清进行ELISA效价测定。用纯化的E-DIII蛋白作为抗原，检测血清效价。结果显示本发明构建的共表达西尼罗河病毒(WNV)的prM基因和E基因的重组假型杆状病毒Bac-G-prM/E基因工程疫苗诱导产生的血清效价明显高于对照组，展示了本发明重组假型杆状病毒基因工程疫苗能够更好地诱发免疫动物产生更高的血清效价(见图8)。
7、ELISA方法检测免疫Balb/c小鼠脾淋巴细胞分泌的IFN- Y水平
采用鼠IFN-Y检测试剂盒(platinum ELISA试剂盒购自ebioscience公司，按照该试剂盒说明书操作)检测小鼠脾淋巴细胞被特异抗原(E-DIII蛋白)刺激后分泌IFN- Y 的能力。结果本发明重组假型杆状病毒Bac-G-prM/E基因工程疫苗免疫小鼠组的分泌 IFN-Y水平要显著高于对照组和E-DIII蛋白免疫组(P < O. 01，t-test)。试验结果如图 10。
8、荧光相对定量RT-PCR方法检测免疫小鼠脾淋巴细胞被特异抗原刺激后 IFN- Y、TNF- a、IL-2、IL-6 的 mRNA 水平
采用荧光相对定量RT-PCR方法(方法参见章静波等，细胞生物学实验技术，化学工业出版社，2006年版)检测小鼠脾淋巴细胞被特异抗原刺激后IFN- Y、TNF- a、IL-2、 IL-6的mRNA水平。小鼠脾淋巴细胞在体外经特异抗原(E-DIII蛋白)刺激后，提取脾细胞总 RNA,利用购自上海 ToYoBo 公司提供的 2X SYBRGreen Realtime PCR Master Mix 试剂盒(按照试剂盒的说明书操作)中oligo dT将mRNA体外转录成eDNA,利用β-actin 的特异性引物扩增小鼠看家基因β-actin基因(登录号NM_007393)，并将其作为相对定量RT-PCR的内参；用IFN-Y、TNF-α、TL_2、IL-6特异性引物(见附录2)扩增小鼠 IFN-Y基因(登录号NM_008337)、TNF-α基因(登录号NM_013693)、IL-2基因(登录号 NM_008366)、IL-6基因(登录号NM_031168)。荧光定量PCR反应体系(总体积为25 μ I) 包括target gene和β-actin上下游引物各O. 5 μ I (引物浓度为10 μ M), PCR Master Mix 12. 5μ 1，双蒸水ΙΙ.Ομ l，cDNA样品0. 5μ I。每个样品做三个重复。反应扩增条件为 500C 2min，94°C预变性IOmin紧接着40个循环的94°C变性15s和60°C退火与延伸Imin0 整个反应过程中的荧光信号的变化由ABI Prism 7500实时荧光定量PCR仪(购自美国 Applied Biosystems公司，按照该仪器的说明书操作)检测。结果显示本发明的重组假型杆状病毒基因工程疫苗免疫组中IFN-Y、TNF-a、IL-2、IL-6基因的mRNA水平要明显高于其他免疫组(P < 0. 01，t-test)。试验结果参见图9。
附录I
术语 定义
权利要求
1.一种表达西尼罗河病毒prM蛋白和E蛋白的重组假型杆状病毒Bac-G-prM/E，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO :V201130。
2.一种预防西尼罗河病毒的基因工程疫苗，其特征在于，包含权利要求1所述的重组假型杆状病毒Bac-G-prM/E。
3.权利要求1所述的重组假型杆状病毒Bac-G-prM/E在制备预防西尼罗河病毒疫苗中的应用。
全文摘要
本发明属于动物病毒学和动物基因工程技术领域，具体涉及一种表达西尼罗河病毒prM蛋白和E蛋白的重组假型杆状病毒Bac-G-prM/E的构建、疫苗制备及应用。本发明得到一种表达西尼罗河病毒prM蛋白和E蛋白的重组假型杆状病毒Bac-G-prM/E，该重组假型杆状病毒保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏号为CCTCC NOV201130。本发明还公开了重组假型杆状病毒的制备及在制备预防西尼罗河病毒疫苗中的应用。本发明为预防西尼罗河病毒提供了新型基因工程疫苗。
文档编号C12N7/01GK103045544SQ20111031471
公开日2013年4月17日 申请日期2011年10月17日 优先权日2011年10月17日
发明者曹胜波, 朱碧波, 徐敏, 叶静, 杨晓红, 陈龙, 陈焕春, 钱平, 肖少波 申请人:华中农业大学