一种新型猪瘟病毒e2重组杆状病毒灭活疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明提供的一种新型猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗，通过猪瘟病毒E2基因的合成、转移载体的构建、转移载体与线性杆状病毒的重组、重组杆状病毒的分子生物学和免疫学鉴定、猪瘟病毒E2蛋白的表达、猪瘟病毒E2重组杆状病毒的灭活、猪瘟病毒E2蛋白与佐剂563VG乳化制成疫苗、猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗的安全性检验、猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗的效力检验等系列的研究证明，猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗做为一种新型的亚单位疫苗，不仅具有良好的安全性，而且免疫效力与猪瘟兔化弱毒疫苗效力相当。
【专利说明】一种新型猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及猪瘟病毒E2重组杆状病毒的构建、猪瘟病毒E2蛋白的表达和猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗的效力检验，新型疫苗具有与活疫苗相当的免疫效力。
【背景技术】
[0002]目前常规的猪瘟活疫苗有两种生产方法，一是将种毒接种于健康家兔在其体内繁殖，然后采集家兔的脾脏和淋巴结研磨后冻干而成；二是将种毒接种原代细胞或传代细胞，收取上清冻干而制成。第一种生产方法需用大量的家兔来采集抗原，此外，由于受家兔个体差异的影响，导致抗原质量层次不齐，最终影响疫苗的效果；第二种生产方法在生产过程中需用牛源血清，牛源血清不仅在制品中引入异源动物蛋白而且有可能污染牛病毒性腹泻，影响了疫苗的安全性，此外，活疫苗免疫仔猪后受母源抗体的影响，导致免疫效果不佳或免疫失败。
[0003]文献检索披露:生产猪瘟活疫苗的S0P，用家兔生产猪瘟活疫苗的方法，取健康家兔通过耳源静脉将种毒接种于家兔体内，根据体温反应判定家兔脾脏和淋巴结是否合格，体温反应分为定型热反应、轻热反应、可疑反应和无反应；无菌采集体温反应为定型热反应和轻热反应家兔的脾脏和淋巴结，低温研磨、分装和冻干，检验合格，即为猪瘟兔化弱毒疫苗(脾淋源)；用原代细胞或传代细胞生产猪瘟活疫苗的方法，种毒接种于生长良好的原代细胞或传代细胞，接种，收获上清，分装和冻干后，检验合格后，即为猪痕兔化弱毒疫苗(细胞源)；因此国内有很多机构用重组杆状病毒表达猪瘟病毒E2基因，基本终止于E2蛋白的表达，未进行过一系列的靶动物(猪)效力验证。
[0004]本发明构思将猪瘟病毒的E2基因克隆到转移载体上与线性的杆状病毒重组，将重组后的杆状病毒进行分子生物学和免疫学的鉴定，正确无误后在昆虫细胞上表达猪瘟病毒E2蛋白，经灭活与佐剂乳化后制成疫苗，并与目前市场上销售的猪瘟兔化弱疫苗(传代细胞源)进行效力比较，结果表明:猪瘟病毒E2重组杆状病毒和猪瘟兔化弱疫苗(传代细胞源)免疫猪后，用猪瘟石门系血毒进行攻毒，保护效力相当，达到了设计要求。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于:研制的新型猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗，不仅具有与猪瘟兔化弱毒疫苗具有相当的免疫效力，而且提高疫苗的安全性，避免因兔体差异照成疫苗质量层次不齐或因引入源蛋白和病毒给疫苗制品带来的风险，同时为今后猪瘟病毒的净化提供物质保障。
[0006]本发明的目的是这样实现的:一种新型猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗，包括猪瘟病毒E2基因的合成、转移载体的构建、转移载体与线性杆状病毒的重组、重组杆状病毒的分子生物学和免疫学鉴定、猪瘟病毒E2蛋白的表达、猪瘟病毒E2重组杆状病毒的灭活、猪瘟病毒E2蛋白与佐剂563VG乳化制成疫苗、猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗的安全性检验、猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗的效力检验；分步实施如下:
[0007]I)猪瘟病毒E2基因优化及合成:在参考国内外经典毒株和流行毒株的E2基因基础上，按昆虫细胞内密码子偏嗜性进行猪瘟病毒E2基因的优化，将优化好的序列(命名为CSFV-HC-E2)交与基因公司合成；
[0008]2)转移载体的构建:通过TOPOli克隆将合成的猪瘟病毒E2基因克隆到
pENTR/D-T0P0K载体上，构建出含有猪瘟病毒E2基因的pENTR-E2转移载体；
[0009]3)转移载体与线性杆状病毒的重组:应用Invitrogen公司的BaculoDirect?Baculovirus Expression System试剂盒将pENTR_E2转移载体与线性的杆状病毒进行重组反应，将猪瘟病毒的E2基因重组于杆状病毒；
[0010]4)重组杆状病毒的分子生物学和免疫学鉴定:将上述重组后的杆状病毒在Sf-9细胞上增殖后取两份样本，一份提取病毒基因，用猪瘟病毒E2基因的引物扩增E2基因；另一份通过SDS-PAGE和Western-blot方法确定E2蛋白表达和免疫原性，鉴定无误后进行E2蛋白的表达。
[0011]5)猪瘟病毒E2蛋白的表达:将鉴定无误的重组杆状病毒以MOI为I接种于Sf_9细胞，培养4d，去除细胞碎片，上清即为猪瘟病毒E2蛋白(抗原)；
[0012]6)猪瘟病毒E2重组杆状病毒的灭活JfBEI加入抗原中，终浓度为lmmol/L，置37°C灭活48h，即可将重组病毒彻底灭活；
[0013]7)猪瘟病毒E2蛋白与563VG乳化制成疫苗:将定猪瘟病毒E2蛋白与563VG按质量比1:1混合，采用均质机，在12000rpm条件下,将抗原液佐剂均质，时间为IOmin,即制成猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗；
[0014]本发明获取猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗的安全性检验:将猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗2倍剂量(4ml/头)免疫猪后，未见局部与全身不良反应。
[0015]本发明通过猪瘟病毒E2基因的合成、转移载体的构建、转移载体与线性杆状病毒的重组、重组杆状病毒的分子生物学和免疫学鉴定、猪瘟病毒E2蛋白的表达、猪瘟病毒E2重组杆状病毒的灭活、猪瘟病毒E2蛋白与佐剂563VG乳化制成疫苗、猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗的安全性检验、猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗的效力检验等一系列的研究证明，猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗做为一种新型的亚单位疫苗，不仅具有良好的安全性，而且免疫效力与猪瘟兔化弱毒疫苗效力相当，此外，本疫苗免疫动物只产生针对E2蛋白产的抗体，可通过Erns抗体诊断试剂盒区分免疫疫苗产生的抗体和感染野毒产生的抗体，在应用中具有广阔的前景，彰显技术进步。
[0016] 本发明获取猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗的效力检验:取猪瘟抗体为阴性的健康猪25头，其中15头免疫3批猪瘟病毒E2重组杆状病毒，5头免疫猪瘟兔化弱毒(传代细胞源)，另5头为对照组，免疫组每头耳后颈部肌肉注射猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗2ml，一免后21d以相同剂量和方式进行二免，二免后14d，连同对照猪5头，各注射猪瘟病毒石门系血毒1.0ml/头(含IO5 tlMLD)，观察16d，对照猪应全部发病，且至少死亡3头，免疫猪应全部健活或稍有体温反应，但无猪瘟临床症状，证明了灭活疫苗的具有与活疫苗相当的免疫效力，同时为今后猪瘟病毒的净化提供物质保障，【专利附图】
【附图说明】
[0017]下面将结合附图对发明作进一步说明。
[0018]附图1为猪瘟病毒E2重组杆状病毒E2基因的PCR鉴定图；
[0019]如图所示:I:阴性对照;2:阳性对照;3:DNA Marker; 4:猪瘟病毒E2重组杆状病毒；证明了构建的重组杆状病毒含有猪瘟病毒E2基因。
[0020]附图2为猪瘟病毒E2重组杆状病毒免疫学鉴定Western-blot图；
[0021]如图所示:1、2、3、4、5均为猪瘟病毒E2重组杆状病毒表达的E2蛋白；证明了构建的猪瘟病毒E2重组杆状病毒接种Sf-9细胞后能够正确有效表达猪瘟E2蛋白。
【具体实施方式】
[0022]下面将结合实施例对发明作进一步说明。
[0023]1、猪瘟病毒E2基因优化及合成
[0024]从Genebank下载了已发表的猪瘟病毒E2序列作参考，在C株E2基因基础上进行了优化，将优化后的E2基因与各亚群的参考株进行比对，结果显示优化后的E2基因确定为1.1群，将优化后的序列(CSFV-HC-E2)交与基因合成公司合成。鉴定猪瘟病毒E2基因的引物 BacE2Fl:5’ -CACCATGGCATTTCTCATCTGCTTG GTA-3’，BacE2_Rl: 5’ -AAATTCTGCGAAGTAATCTGA GTG-3’。
[0025]2、转移载体的构建
[0026]试验方法参考Invitrogen手册，具体操作如下:
[0027]首先配制TOPO R clone反应混合液，其成分:0.5~4 μ I合成的Ε2核苷酸，I μ I盐溶液(1.2mol/LNaCl,0.06mol/LMgC12) )，I μ I pENTR/D-TOPO"载体，再加入双蒸水使总体积为6μ I ;Τ0Ρ0?克隆反应的步骤:轻拍离心管管壁，使反应混合液混合均匀，置室温(22~23°C )感作15min后，将反应管置冰上，取2μ I TOPO? clone反应液加至感受
态细胞中，轻拍管壁使其混合均匀，置冰上感作30min，再置42°C水浴槽30s进行热休克作用，之后立刻将反应管放回冰上冰浴，然后于反应管中加入已回温的250 μ I SOC培养液，放入37°C恒温振荡培养箱中，在200rpm条件下振荡培养60min，取50 μ I菌液均匀涂抹于LB-kana培养板(含50 μ g/ml卡那霉素)，剩余菌液则全部取出并均匀涂抹于另一LB-kana培养板上，置37 °C培养箱中培养过夜，挑取单个菌落，通过PCR方法，进行猪瘟病毒E2重组转移载体的初步筛选。首先配制PCR反应液并分装成24管，每管PCR反应液中含BacE2-Fl与BacE2-Rl引物(与上述鉴定猪瘟病毒E2基因的引物相同)各0.5 μ 1，2.5 μ IdNTPs (2.5mM), 2.5 μ 110XPCR buffer, 0.5 μ I Pfu DNA聚合酶，18.5 μ I 双蒸水，先以 95°C加热3min，再于94°C 30s,57 °C 30s,72 °C Imin的程序下进行35个循环，最后72 °C延伸IOmin,反应后以1%琼脂凝胶于100伏特电压进行电泳分析，若出现预期产物，则选取4~5个相对应的菌落接种至3ml LB-kana中，于37°C恒温振荡培养箱中，在200rpm条件下振荡培养过夜，用QIAprep? Spin Plasmid Kit进行重组载体的提取,组载体经限制内切酶NotI切割后，以1%琼脂糖凝胶于100伏特电压进行电泳分析，若与预期产物大小相符，则选取其中2个已提取的重组载体与线性的杆状病毒重组。
[0028]3、转移载体与 线性杆状病毒的重组将提取的重组载体，用分光度计于波长260nm处测重组载体的核酸浓度，再按Invitrogen公司提供的《BaculoDirectTM Baculovir μ sExpression System》操作手册进行LR重组反应。具体操作:无菌操作将I μ I重组转移载体(100 ~300ng)、4 μ 15XLR C I onase!<.reaction buffer 及 I μ I 双蒸水分别加入 10 μ I
BaculoDirect? 线性 DNA(300ng)中，自-70°C冰箱中取出 LR G I onase'、enzyme mix 置冰
上回温2min后，振荡2次,每次2s,取4 μ ILR G I onase " enzyme mix加入上述混合液中，
轻拍管壁数次使其混合均匀，不可剧烈振荡以免杆状病毒DNA断裂，于25°C感作18h后，加Λ2μ I蛋白酶K，置37°C作用lOmin，中断LR重组反应；然后取6孔细胞培养板，每孔接种
1.5 X IO6个活性良好(细胞存活率大于95%)的Sf-9细胞，重复2孔，将细胞置26~28°C培养lh，使细胞完全附着于培养板底部，转染前需先配制下列混合液，转染混合液A:20μ ILR重组反应液(含已重组的杆状病毒DNA)与200 μ 1SF900II无血清昆虫细胞培养液；转染混合液B: 12 μ I Ge I I feet i onK reagent与200 μ I SF900II无血清昆虫细胞培养液，将转染混合液B加入转染混合液A中，轻拍管壁使其混合，置室温感作45min，先以SF900II无血清昆虫细胞培养液小心清洗已附着的Sf-9细胞，接着将A、B混合液分成两管，每管各加入800 μ I SF900II无血清昆虫细胞培养液，上下翻转数次，最后将6孔板中培养液尽量抽干，再沿管壁缓慢加入Α、Β混合液于2孔中，将细胞培养板密封后，26~28°C培养5h，抽掉混合液，于每孔中加入3ml含有抗生素与100 μ M ganciclovir的Sf_900 II SFM,最后以透明胶带密封，置26-28°C恒温培养箱中培养5d。
[0029]4、重组杆状病毒的分子生物学和免疫学鉴定
[0030]分子生物学鉴定:根据猪瘟病毒E2基因设计如下鉴定引物BacE2_Fl与BacE2_Rl引物(序列附表)提取上述6孔板内上清中的DNA，用上述引物进行PCR鉴定，PCR反应条件与“转移载体的构建”中反应条件相同，反应后以1%琼脂凝胶于100伏特电压进行电泳分析，重组成功的杆状病毒可在1119bp位置获得特异性的条带(见附图1)。免疫学鉴定:通过Western免疫印迹(Western-blot)验证猪瘟病毒E2蛋白的表达及免疫原性。首先进行SDS-PAGE,然后将SDS-PAGE胶上的蛋白条带转移到PVDF膜上，置含5%的脱脂奶粉的PBST中，室温封闭30min，清洗5次，加入一抗猪瘟阳性血清，室温作用lh，清洗5次，加入含辣根过氧化物酶标记的兔抗猪的二抗，室温作用lh，清洗5次，于暗室内进行DAB显色，在约48KDa附件出现特异性条带(见附图2)。
[0031]5、猪瘟病毒E2蛋白的表达:取悬浮培养的Sf-9细胞，用无血清培养基SF900II将Sf-9细胞密度调整到1.0X IO6个细胞/ml (细胞存活率不低于95%);取鉴定好的猪瘟病毒E2重组病毒液接种到Sf-9细胞中(接毒剂量MOI为I)，置26~28°C恒温振荡培养箱中，在ISOrpm条件下，振荡培养4d，4d后取出细胞摇瓶，将细胞液摇匀后倒入离心瓶中离心，以转速3000rpm离心20min，收取上清液即为猪瘟病毒E2蛋白液。
[0032] 6、猪痕病毒E2重组杆状病毒的灭活:制备0.lmol/L的BEI灭活溶液，称量0.2mol的NaOH溶液溶解到IL的注射用水中，再加入0.1mol的2-bromoethylaehydrobromide (BEA),置 37°C水浴中反应 Ih,即制得 0.lmol/L 的 BEI 溶液，将0.lmol/L的BEI溶液加入猪瘟病毒E2重组杆状病毒液，终浓度为lmmol/L，置37°C中灭活48h，每隔2h均匀搅拌lOmin，灭活完毕后加入lmol/L的硫代硫酸钠，终浓度为IOmmol/L，37°C反应lh，用于后续的疫苗制备。[0033]7、猪瘟病毒E2蛋白与563VG乳化制成疫苗:佐剂的准备，563VG油质佐剂(121°C、15pa、20min)进行灭菌,将蛋白抗原与佐剂1:1 (质量比)混合，以转速3000rpm乳化IOmin,停止IOmin,在3000rpm条件下,再乳化IOmin,即制得猪痕病毒E2重组杆状病毒。
[0034]本发明的猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗的安全性检验:用4~5周龄健康易感仔猪(猪瘟病毒抗体为阴性)10头，5头耳后颈部肌肉注射猪瘟病毒E2重组杆状病毒4ml (2倍剂量)，另设5头不注射作为阴性对照。连续观察14d，并每日测温，体温应不超过40 °C，所有仔猪应不出现任何不良反应和死亡。
[0035]本发明的猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗的效力检验:用25头4~5周龄健康易感仔猪(猪瘟病毒抗体为阴性)，将制备的3批猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗进行效力检验。试验分五组:第一组至第三组各5头，分别免疫3批疫苗(批号:201301、201302、201303)，免疫剂量2ml/头；第四组5头，免疫猪瘟兔化弱毒疫苗(传代细胞源)，免疫剂量7500兔体感染量/头；第五组5头，作为对照组，在同等条件下隔离饲养，一免后21d，以相同途径与相同剂量进行二免，二免后14d，连同对照猪5头各注射猪瘟石门系血毒Iml (含IO5MLD)进行攻毒，连续观察16d，攻毒后16d，将接种猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗和猪瘟兔化弱毒疫苗(传代细胞源)4组试验猪剖检，扁桃体、喉头、淋巴结、肾脏、脾脏、回肠均未见出血点和其他异常病理状况，对照组试验猪攻毒后，扁桃体、喉头、淋巴结、肾脏、脾脏、回肠均有出血点或出血斑，脾脏边缘梗死，淋巴结切面呈大理石样花纹，肾脏表面有大量出血点，呈现典型“雀斑肾”病理变化，统计结果见附表。
[0036]表免疫攻毒后各试验组试验猪组织病理变化剖检情况
[0037]
【权利要求】
1.一种新型猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗及其制备方法，其特征在于:分步实施； 步骤1猪瘟病毒E2基因优化及合成:昆虫细胞内密码子偏嗜性进行猪瘟病毒E2基因的优化，将优化好的序列交与基因合成公司合成； 步骤2转移载体的构建:通过TOPO?克隆将合成的猪瘟病毒E2基因克隆到pENTR/D-T0P0?载体上，构建出含有猪瘟病毒E2基因的pENTR-E2转移载体； 步骤3转移载体与线性杆状病毒的重组:应用Invitrogen公司的BaculoDirect?Baculovirus Expression System试剂盒将pENTR_E2转移载体与线性的杆状病毒进行重组反应，将猪瘟病毒的E2基因重组于杆状病毒； 步骤4重组杆状病毒的分子生物学和免疫学鉴定:将上述重组后的杆状病毒在Sf-9细胞上增殖后取样，一份提取病毒基因，用猪瘟病毒E2基因的引物扩增E2基因；另一份通过SDS-PAGE和Western-blot方法确定E2蛋白表达和免疫原性，进行E2蛋白的表达； 步骤5猪瘟病毒E2蛋白的表达:将重组杆状病毒以MOI为I接种于Sf-9细胞，培养4d，去细胞碎片，上清即为猪瘟病毒E2蛋白； 步骤6猪痕病毒E2重组杆状病毒的灭活:将BEI加入抗原中，终浓度为lmmol/L,置37°C灭活48h，即使重组病毒灭活； 步骤7猪瘟病毒E2蛋白与563VG乳化制成疫苗:将猪瘟病毒E2蛋白与563VG按质量比1:1混合，采用均质机，在12000rpm条件下,将抗原液佐剂均质，时间为IOmin,即制成猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗。
2.按照权利要求1所述方法，其特征在于:新型猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗是灭活疫苗，只产生针对E2蛋白的抗体，通过检测Ems抗体，区分是疫苗产生的抗体还是感染野毒产生的抗体。
3.按照权利要求1所述方法，其特征在于:试验选用制剂均为市售产品。
【文档编号】A61P31/14GK103908663SQ201310704744
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2013年12月19日 优先权日:2013年12月19日
【发明者】李俊辉, 刘宏, 王尊宝, 李延涛, 贺笋 申请人:新疆天康畜牧生物技术股份有限公司