专利名称：用于生产琥珀酸的方法
技术领域：
本发明涉及在无氧条件下通过发酵来生产琥珀酸和/或琥珀酸根离子的方法。
背景技术：
琥珀酸(或丁二酸)是一种具有两个羧基基团的有机酸，其半结构化学式 (semi-structural formula)为C00H-CH2_CH2-C00H，它在线粒体中作为一个三羧酸循环的 代谢中间产物参与了细胞代谢。它在化妆品、食品加工、药物以及纺织品领域和塑料制品中具有多种应用。因此， 例如在生产1，4_ 丁二醇、四氢呋喃以及丁内酯时它被用作塑料制品的合成中间产物。从琥珀酸得到的新产品不断地处于开发之中，包括聚酯的开发。总体上，琥珀酸酯具有成为新型“绿色”溶剂的潜力，它们能够替代对人类和环境 更加有害的溶剂。从可再生的起始材料(在这种情况下在这一点上，通过发酵工艺)生产羧酸，例如 苹果酸、琥珀酸或富马酸，对于本领域的普通技术人员是已知的。琥珀酸盐是在通过细菌生产丙酸盐的无氧发酵中的一种代谢中间产物，但是这些 发酵工艺导致产生非常低的产率和滴度的琥珀酸。近年来，已经分离出多种生产琥珀酸的微生物，例如厌氧的瘤胃细菌栖瘤胃拟杆 菌(Bacteroides ruminicola)禾口口耆淀粉拟杆菌(Bacteroidesamylophilus)。然而，来自瘤 胃的生物在发酵工艺中是高度不稳定的，并且因此不用于工业生产琥珀酸。长期以来已知几种酸(包括琥珀酸)的混合物是在葡萄糖和C02作为碳源存在 下由大肠杆菌发酵所生产的，正如1949年由JL Stokes的“Fermentation of glucose by suspensions of Escherichia coli ”，J. Bacteriol.，57 :147—158 所说明。然而，对于每摩 尔的发酵的葡萄糖，仅产生0.3至0. 4mol的琥珀酸。因此，对细菌(特别是大肠杆菌)进行了研究，这些细菌已经被遗传修饰从而使消 耗了生产琥珀酸所需要的NADH的代谢途径失活，并且从而激活了用于生产琥珀酸盐(琥珀 酸的盐)的代谢途径。确切地，这个允许草酰乙酸盐转化成苹果酸盐、然后转化成富马酸盐并且最终转 化为琥珀酸盐的发酵代谢途径要求所产生每摩尔的琥珀酸盐中具有2mol的NADH。所以，在 琥珀酸盐的生产中主要的代谢瓶颈是NADH的细胞生物利用率。作为对这个困难的一种解决方案，文件US 7，223，567说明了使用一种重组大肠 杆菌菌株，它对于相同可获得量的NADH过量地生产了琥珀酸盐。大肠杆菌菌株SBS550MG pHL 413展示了使adhE和ldhA基因的产物(参与了消 耗NADH的途径)失活以及使ack-pta基因和iclR基因的产物(激活乙醛酸途径)失活， 并且含有一个过量表达外源PYC基因的质粒载体。Sanchez 等人的 文章(题目为〃 Novel pathway engineering design of theanaerobic central metabolic pathway in Escherichia coli to increase
4succinateyield and productivity" in Metabolic Engineering 7 (2005) 229-239)、美国 专利US 7，223，567以及美国专利申请US 2005/0042736已经发展了与该菌株相关联的新 型培养和生产条件，以改进它的琥珀酸产率。本领域的普通技术人员正在不断地寻找用于生产琥珀酸的新型的改进方法。具体 而言，本领域的普通技术人员寻找优化所获得的产率和生产率。而且，常规的发酵方法导致 相当数量的二氧化碳废物被释放到空气中，这显然是不令人希望的。
发明内容
根据一方面，本发明涉及通过一种大肠杆菌菌株的无氧发酵来生产琥珀酸和/或 琥珀酸根离子的一种方法，该方法包括(A)在一个发酵罐中的一个碳源的一个发酵步骤，该步骤是通过提供CO2、使发酵 罐的多个通气孔关闭下进行，这样CO2的供给是由该菌株消耗的CO2来控制，在该碳源完全 耗尽之前随后进行，(B)不供给CO2的该剩余碳源的一个发酵步骤，从而消耗残余的C02。本领域的普通技术人员是熟悉发酵技术的(特别是如 Fermentation&Biochemical Engineering Handbook-principles， process design&equipment，2nd ed 1996 by Henry C. Vogel and Celeste L Todaro 中所说明)。发酵是一种生化反应，它总体上包含在微生物酶的作用下从一种有机底物中释放 能量或生产某些感兴趣的代谢产物。发酵总体上是在适合于发酵工艺的装置(发酵罐)中进行的，即适合于在所希望 的条件下(使得有可能在适当地时控制培养基的气体平衡，特别是通过气体进口和/或 出口管、通气孔、等等的装置；使得有可能引入培养基以及其他物质的装置；使得有可能控 制、调节、修饰其他类型的参数例如搅拌，温度，pH、等等的装置)培养微生物。本领域的普通技术人员还熟悉在无氧条件下的发酵。根据本发明，这是指在没有 氧的培养条件。优选地，无氧培养条件是存在二氧化碳的培养条件。根据一个实施方案，在 CO2的存在下和/或供给CO2的无氧发酵条件是CO2饱和的发酵条件。在步骤(A)过程中“在完全耗尽碳源之前”这一表达是指在步骤(A)中的一个时 刻，其中该发酵培养基含有一个剩余量的碳源，该碳源在这个时刻借助于在溶液中可以获 得的CO2 (以溶解的CO2或HCO3-的形式)可以由该菌株完全转化为琥珀酸和/或琥珀酸盐。在步骤(A)过程中，由于这个或这些发酵罐通气口是关闭的并且CO2进料到发酵 罐得以保持，分批地进行CO2的供给，根据由该菌株所消耗的CO2对其进行自动调节用于生 产琥珀酸和/或琥珀酸盐。术语“自动地调节”是指，假定在该发酵罐中(一个或多个通气孔关闭)液相(发 酵培养基)与气相(“大气”)之间热力学平衡的条件下，供给一个给定量的CO2仅仅可以 在由该菌株通过发酵(并且因此伴随着琥珀酸和/或琥珀酸盐的生产)消耗一个相同的量 之后出现。在步骤(B)过程中，不存在着CO2的供给，这意味着在步骤(A)过程中进行的CO2 供给被中断。具体而言，这可以通过切断CO2进料来进行。有利的是，根据本发明，在步骤(B)过程中的发酵消耗了存在于发酵培养基中的co2 (溶解的剩余物)和hco3_离子。根据一个优选的实施方案，在步骤(A)开始之前，通过注入进行C02的供给，其中 发酵罐通气孔是开放的，从而达到用co2使该发酵培养基饱和。提及例子，通过以0. 15-0. 40vvm的流速(每分钟每体积的培养基中的C02体积) 进行注入可以引入C02，优选地0. 3vvm.“用C02饱和发酵培养基”这一表达是指该培养基在对应的条件(温度、pH、等等) 下含有溶解于其中的最大量的C02。例如，在37°C下在pH7下这可以对应于l_2g/l的浓度， 例如1. 5g/l的数量级的浓度。根据一个实施方案，步骤(A)和/或步骤(B)是在pH处于6. 0-7. 0、优选6. 4-6. 8、 优选6. 5-6.6的范围内进行的。根据一个实施方案，该碳源是葡萄糖。根据一个实施方案，在步骤(A)开始时，该发酵培养基含有15_40g/l、优选地 15-25g/l、优选地15-20g/l的葡萄糖。根据一个实施方案，在步骤(B)开始时，该发酵培养基含有2_6g/l、优选地大约 4g/l的葡萄糖。根据一个优选的实施方案，这种大肠杆菌菌株是一个具有基因型 A adhE A ldhA A iclR A ackptaPYC的菌株。有利的是，这种基因型使得有可能在C02的存在 下通过发酵来促进琥珀酸的生成。符号A表示所讨论的基因已经被失活，例如通过突变、 缺失、中断、插入或减量调节，例如通过引入一个终止密码子、导致阅读框改变的插入或缺 失，一个点突变、等等。因此，A adhE A ldhA A iclR A ackptaPYC 基因型对应于- A adhE 醇脱氢酶的失活；-A ldhA 乳酸脱氢酶的失活；- A iclR 异柠檬酸裂合酶(也被称作aceA)的失活；- A ackpta 乙酸激酶-磷酸转乙酰酶的失活；-PYC 一种丙酮酸羧化酶基因的表达。这表明该菌株表达了 PYC基因，例如借助于 使用携带该基因的一个功能拷贝的质粒进行转化，或通过PYC的一个功能拷贝的基因组整 合。有利的是，PYC基因是乳酸乳球菌的pyc基因。根据一个非常优选的实施方案，该大肠杆菌菌株是SBS550MG-pHL413菌株。该 菌株说明于 Sanchez et al.，MetabolicEngineering，7 (2005) 229-239 中，以及文件 US 7，223，567 和 US2005/0042736 中。根据一个方面，本发明涉及一种用于生产琥珀酸的方法，该方法包括(a)在有氧条件下培养一种大肠杆菌菌株的一个步骤，在此过程中通过向该培养 基中加入一种镁化合物来调节PH，(b)在无氧条件下在C02存在下通过在发酵步骤(a)中培养的菌株的发酵来生产 琥珀酸根离子的一个步骤，(c)将在步骤(b)中形成的琥珀酸根离子转化成琥珀酸的一个步骤。本领域的普通技术人员还熟悉在有氧条件下的发酵和培养。根据本发明，这是指 存在氧的培养条件。根据一个实施方案，这种氧来自大气。
在步骤(a)中，由此存在着这种大肠杆菌菌株的生长和繁殖。因此，存在着生物量 的产生，即细胞群体的增加。该步骤典型地可以包括预培养的子步骤(subst印)。根据本发明，术语“调节pH”是指将这种培养基的pH值维持在一定范围或选定的 数值内的动作。根据本发明，可以通过不同的方式来调节PH -在一个范围内的调节将pH值维持在一定范围的数值内。然后，该pH值可以随 时间发生变化，然而并不偏离所考虑的范围；-“低点”调节将pH值维持在一个阈值之上。然后，该pH值可以随时间发生变 化，然而并不降到该阈值以下。-在一个单一的数值上的调节使pH值随着时间持续地保持在该数值上。术语“加入一种化合物”是指将该化合物加入到这种培养基中。可以根据不同的 方法进行加入加入一种悬浮液和/或加入一种溶液和/或加入一种固体(例如，以粉末形 式)O根据一个实施方案，步骤(a)的镁化合物是选自氧化镁、氢氧化镁以及碳酸镁。氧化镁、氢氧化镁、或碳酸镁能够以粉末的形式或以悬浮液的形式，典型地以水性 悬浮液(例如，以20%至30%重量/体积的浓度)来加入。根据一个实施方案，步骤(a)和/或(b)是在一种含有所使用的碳源(典型地是 葡萄糖)的培养基中进行的，并且特别是以10至30g/l的浓度，例如20g/l。根据一个实施方案，在步骤(b)过程中，pH是通过向该发酵培养基中加入一种选 自如下组的化合物来调节的，该组的组成为镁化合物类(例如，选自氧化镁、氢氧化镁以 及碳酸镁)、钙化合物类(例如，选自氧化钙、氢氧化钙以及碳酸钙)、钾化合物类(例如，选 自氢氧化钾以及碳酸钾)、铵化合物类(例如，选自氢氧化铵以及碳酸铵)以及钠化合物类 (例如，选自氢氧化钠以及碳酸钠)、以及它们的混合物。根据一个实施方案，步骤(b)是在pH处于6. 0-7. 0、优选地6. 4-6. 8的范围内进行 的。根据一个实施方案，步骤(c)包括一个酸化反应。特别地，这种酸化反应可以通过 加入至少一个酸来进行，这种酸选自正磷酸、草酸以及硫酸。根据一个实施方案，在步骤(b)过程中，pH是通过向该发酵培养基中加入一种选 自由镁化合物类构成的组的化合物来调节的，由此形成了琥珀酸镁。在这种情况下，步骤(c)可以包括(c-1)将在步骤(b)中形成的琥珀酸镁转化成琥珀酸钠的一个步骤，以及(c-2)通过双极电渗析将在步骤(c-1)中形成的琥珀酸钠转化成琥珀酸的一个步
马聚o步骤(c-1)可以典型地通过加入碳酸钠来进行。该碳酸盐能够以一种溶液或一种 粉末的形式，典型地以一种水性溶液的形式(例如，以1至2M的浓度)而加入。碳酸镁(它 是不溶解的)发生沉淀。碳酸镁可以在高温下在烘箱中进行处理，例如在大于700°C的烘箱 中。这生成了 MgO和C02，它们中至少有一个可以被循环使用。碳酸镁能够可替代地以此状态被回收。有利的是，琥珀酸钠可以通过双极电渗析 (这不是用琥珀酸镁的例子)进行处理，生成氢氧化钠和琥珀酸，它们是可以结晶的。而且， 这项双极电渗析技术对于本领域的普通技术人员是熟知的。所产生的氢氧化钠可以在适当
7时用之前从高温烘箱中释放的CO2进行再转化，从而形成碳酸钠。所有的步骤在图3中表示 ο根据一个优选的实施方案，这种大肠杆菌菌株是一种具有 Δ adhE Δ IdhA Δ iclR Δ ackptaPYC的基因型的菌株。根据一个非常优选的实施方案，这种大 肠杆菌菌株是SBS550MG-pHL413菌株。根据另一个方面，本发明涉及一种生产琥珀酸的方法，该方法包括(i)通过在无氧条件下在CO2存在下的一种大肠杆菌菌株的发酵来生产琥珀酸镁 的一个步骤，在该步骤的过程中通过向该发酵培养基中加入一种镁化合物来调节PH，以及(ii)将在步骤(i)中形成的琥珀酸镁转化成琥珀酸的一个步骤。“调节pH”和“加入一种化合物”这些表达如以上所定义。根据一个实施方案，步骤(i)的镁化合物是选自氧化镁、氢氧化镁以及碳酸镁。优 选地，它是氧化镁(氧化镁，化学式为MgO)。氧化镁、氢氧化镁、或碳酸镁能够以粉末的形式或以一种悬浮液的形式、典型地以 一种水性悬浮液的形式(例如，以20%至30%重量/体积的浓度)而加入。根据一个实施方案，步骤⑴是在pH处于6. 0-7.0、优选地6. 4-6. 8、优选地 6. 5-6. 6的范围内进行的。根据一个实施方案，步骤(i)和/或(ii)是在含有所使用的碳源(典型地是葡萄 糖)的培养基中进行的，并且特别是以10至30g/l的浓度，例如20g/l。根据一个实施方案，步骤(ii)包括一个酸化反应。该酸化反应能够以不同的方式 来进行。根据一个实施方案，这种酸化反应是通过加入至少一个酸来进行的，这种酸选自正 磷酸、草酸以及硫酸。这些酸能够以纯的形式或以浓缩的水性溶液的形式来加入。根据另一个实施方案，步骤(ii)包括(ii-a)将在步骤(i)中形成的琥珀酸镁转化成琥珀酸钠的一个步骤，以及(ii-b)通过双极电渗析将在步骤(ii-a)中形成的琥珀酸钠转化成琥珀酸的一个步骤。这些步骤以上针对步骤(c-1)和(c-2)进行了说明。根据一个优选的实施方案，这种大肠杆菌菌株是一种具有 Δ adhE Δ IdhA Δ iclR Δ ackptaPYC基因型的菌株。根据一个非常优选的实施方案，这种大肠 杆菌菌株是SBS550MG-pHL413菌株。根据另一个方面，本发明涉及一种用于获得琥珀酸的方法，该方法包括-一种用于生产琥珀酸和/或琥珀酸根离子的方法，例如选自如以上说明的那些；-一个将这些琥珀酸根离子酸化从而生成琥珀酸的步骤，例如通过向该葡萄汁中 加入一种强酸，-可任选地，一个纯化该琥珀酸的步骤；以及-一个结晶该琥珀酸的步骤。根据一个实施方案，在以上说明的所有方法中，该纯化步骤包括一个乙醇纯化步 骤，它如下进行-这种酸化的葡萄汁的过滤(除去一种蛋白沉淀物)，例如通过一个布氏漏斗和/ 或通过过滤用土 (filtering earth),
-可任选地，通过在真空下蒸发对该滤液的浓缩(优选地，根据在大约2至8之间 的一个浓缩因子)，-乙醇(例如95%的乙醇)以1/1至5/1的比值的加入，从而引起这些盐的沉淀 (这种琥珀酸仍然是可溶的)，-通过过滤对该盐沉淀物进行的分离，例如通过一种膜_通过在真空下蒸发对该乙醇进行的回收，-在活性碳上的处理，并接着板框压滤(platefiltration)，并且通过过滤用土的 过滤o
图1展示了随着用于调节pH的该化合物而变的、由无氧发酵来生产的琥珀酸性能 水平。图2根据是否使用MgO或NaOH来调节pH而比较了生产动力学。图3表示了一个用于生产琥珀酸的实施方案通过加入碳酸钠将琥珀酸镁转化成 琥珀酸。本发明通过以下示例性的实施方案进行说明，对它没有限制。
具体实施例方式实例1 根据两种不同的供给C02的方法通过无氧发酵来生产琥珀酸，其中发酵罐 通气口是打开或关闭的这种用于生产琥珀酸的方法包括-在锥形瓶中的一个预培养期，-在有氧条件下在一种培养基中(含有玉米浆作为氮源以及葡萄糖作为碳源)的 一个培养期，这一时期允许生物量的产生，以及-允许其本身生产琥珀酸的一个无氧期。在有氧和无氧条件下这些时期是在同一个发酵罐中进行的。所使用的菌株是 SBS550MG-pHL413 菌株。有氧期将SBS550MG-pHL413菌株在37°C下以125rpm摇动在一个锥形瓶中预培养17h。在 一个2升的具有2个隔板的锥形瓶中将该菌株接种到400ml培养基中。这种预培养培养基的组成如下
胰蛋白胨10g/l
酵母提取物5g/l
NaCl10g/l
抗生素
(氨比西林、羧苄西林、苯唑西林)67mg/l
将由此预培养的菌株放置在一个151的发酵下
葡萄糖开始时的2 g/Ι, +当第一个2 g/1被消耗时的2 g/1 玉米浆60 g/1盐类和抗生素g/1(NH4)2SO40.25K2HPO40.7KH2PO41.2KCl2CaCl20.2MgSO40.25數比西林0.067生物素0.001硫胺素0.001通过在锥形瓶中预培养所得到的接种物代表了在该发酵罐中培养的培养基的总 体积的3%。在有氧期过程中这些培养条件是温度为37°C、以500rpm搅拌、以Ivvm通气并且无 PH调节(在对该培养基进行灭菌之前将该PH简单地调节至7. 5)。无氧期ο使用连续供给CO2的科学实验方案-将以下各项加入到该培养基中葡萄糖开始时的20g/l，+在24h时的15g/l，+ 在50h时的4g/l-发酵是在pH6.4下进行的，其中以0.3^!11(1/1/1^11)的流速连续注入CO2、发酵 罐通气口打开，以250rpm进行搅拌。-在63.5h发酵结束，其中在该培养基中琥珀酸的最终滴度是30g/l。-所消耗的CO2 的全部量达到(0. 3vvmX60minX63. 5h/22. 4mol/lX44g/ mol)2245g/l，即形成了 73g/g的琥珀酸。-而且，在发酵结束时在该培养基中存在着浓度为2g/l的HCO3-(对应于1.5g/l的 CO2)。ο根据本发明的科学实验方案该发酵的科学实验方案与以上的相同，除了-在无氧期开始时，以0.3vvm的流速将CO2引入到该发酵罐中持续1分钟从而将 从有氧期中得到的剩余空气驱除，-将CO2系统的压力降低到0.4巴，-将发酵罐通气孔密封关闭从而防止CO2离开，-因此，在整个发酵中CO2的注入被精密地调节到它的消耗量，-当剩余的葡萄糖浓度达到4g/l时将CO2的注入停止，从而消耗了溶解于在培养 基中的剩余的hco3_。根据本发明的结果_在发酵结束时在该培养基中所产生的琥珀酸的终浓度为30g/l，这与连续供给 CO2得到的浓度相同；_在发酵结束时在该培养基中剩余的HC03_浓度为0. 3g/l(它代表了与连续供给
10C02所获得的浓度相比85%的降低)；-C02的消耗开始时的0. 59g/l，+键合到琥珀酸上的6g/l，即0. 2g/g的酸(它代 表了与连续供给C02所获得的浓度相比99. 7%的降低)。因此，有利的是根据本发明，在维持这种琥珀酸的产率同时避免了大量的二氧化 碳废物_在一个封闭的反应器中进行工作自然地限制了这种废物，并且-而且，在发酵结束时在该培养基中观察到一种剩余的HC03_的浓度降低。然而， 在发酵结束时在该培养基中剩余的hco3-的酸化反应导致co2被放出。实例2 通过用一种无机培养基进行无氧发酵以及用不同的化合物(其中至少一 个是基于镁的)调节PH来生产琥珀酸所使用的菌株是SBS550MG_pHL413菌株。在无氧条件下在发酵期过程中，使用不同的化合物将pH调节为6. 75:Na0H、NH3、 K0H、Ca0 或 Mg0o该科学实验方案如下_在锥形瓶中预培养；-在一个发酵罐中传代培养；-在一个发酵罐中生产2个时期o有氧期产生生物量，o无氧期在C02存在下生产琥珀酸。每一个步骤详述如下在锥形瓶中预培养 -在37°C下孵育达到小于24h；-摇动125rpm;-体积在一个21的锥形瓶中500ml。在发酵罐中传代培养
_ 接种物 6%;-37°C，搅拌450rpm，通气lvvm ；-用5N NaOH 将 pH 调节至 6. 75 ；-持续时间大于20h。在发酵罐中生产2个时期有氧期产生生物量培养基葡萄糖开始时的10g/l，+当第一个10g/l被消耗时的10g/l -痕量元素和维生素相同的传代培养；_ 接种物 13%;-37°C，搅拌450rpm，通气lvvm ；-通过加入5NNaOH、对应地28%重量/体积的NH3、对应地5NK0H、对应地20%重 量/体积CaO、对应地20%重量/体积MgO将pH调节至6. 75。无氧期通过提供CO2生产琥珀酸-加入葡萄糖20g/l;-在0. 2vvm 下注入 CO2 ；-37°C，搅拌250rpm ；-通过加入5NNaOH、对应地28%重量/体积的NH3、对应地5NK0H、对应地20%重 量/体积的CaO、对应地20%重量/体积的MgO将pH调节至6. 75。对于每一个科学实验方案，通过HPLC来测量所生产的琥珀酸的量值。结果示于图1中，其中在整个短生产期中所获得的生产率和产率对应于20g/l的葡萄糖的消耗。根据本发明出人意料地并且有利的是，为了在无氧发酵过程中调节pH，使用MgO 产生了最佳的性能水平，其中与使用最为有效的其他碱类(NaOH)所获得的相比产率高 100%并且生产率以体积计算高2. 5倍。以下表格通过展示使用MgO也生成最佳的生物量产率、以及最低的共生物合成而 完成了该比较。 Sa=琥珀酸生产动力学通过加入MgO并且通过加入NaOH来比较pH的调节图2比较了在氢氧化钠或氧化镁的存在下通过延长生产时所获得的琥珀酸滴度 方面的变化。该项比较显示了使用MgO的另一种未预期的优势在琥珀酸的积聚过程中低程度 地减缓了该动力学。有利的是，与使用NaOH相比，使用MgO使得有可能增加琥珀酸的生产 率和生产速率。此外，使用MgO使得有可能达到大于50g/l的琥珀酸浓度(滴度)。实例3 生产琥珀酸并且在有氧生长期使用一种镁化合物调节pH所使用的菌株是SBS550MG-pHL413菌株。对于预培养和传代培养所使用的科学实验方案与实例2中所说明的相同。对于发酵罐中的生产，根据本发明，在有氧培养期(该菌株进行生长，产生生物 量)使用MgO进行pH调节，而在无氧条件下在琥珀酸盐生产期使用氢氧化钠进行pH调节。其他工作条件与实例2的那些相同。通过“MgO然后NaOH”这一表达方式对此进行归纳，它表明使用加入MgO来进行该 有氧培养步骤，之后跟随使用加入NaOH来进行一个无氧发酵步骤。以下表格比较了在这些pH调节条件下(“MgO然后NaOH”)所获得的结果与在这 两个时期中(“MgO然后MgO”或“NaOH然后NaOH”)仅仅使用MgO或仅仅使用NaOH时所获 得的结果。 Sa=琥珀酸这些结果表明可能的是在生长期过程中通过仅使用MgO调节pH而获得对在生产 期中性能水平的一种阳性作用。实例4 通过无氧发酵和酸化获得琥珀酸所使用的菌株是SBS550MG-pHL413菌株。实例2的用于生产琥珀酸的方法(使用 MgO作为pH调节剂)之后跟随一个通过加入不同酸的酸化反应的步骤-正磷酸通过磷酸镁三碱式盐(magnesiumphosphate tribasic)的(高度不溶 解的)的形成和沉淀来纯化。在水相中每摩尔琥珀酸加入ImolH3PO4这导致了形成高度可 溶性的磷酸镁一碱式盐(magnesium phosphatemonobasic)。-草酸通过高度不溶解的草酸镁的形成和沉淀来纯化。不存在琥珀酸的损失。很 快地获得了不含其平衡离子的琥珀酸。实例5 通过无氧发酵并且转化成琥珀酸钠来获得琥珀酸所使用的菌株是SBS550MG-pHL413菌株。实例2的用于生产琥珀酸的方法(使用 MgO作为pH调节剂)之后跟随一个通过碳酸钠的加入来形成碳酸镁和琥珀酸钠的步骤。碳酸镁(它是不溶解的)发生沉淀。不存在琥珀酸的损失。碳酸镁可以在高温下 在烘箱中进行处理，例如在大于700°C的烘箱中。这生成了 MgO和CO2，它们中至少有一个 可以被循环使用。然后，有利的是，可以将碳酸镁回收。可以通过双极电解对琥珀酸钠进行处理，生成氢氧化钠和琥珀酸，它们是可以结 晶的。氢氧化钠可以使用之前从高温烘箱中发出的CO2进行再转化，从而形成碳酸钠。所有的步骤示于图3。实例6 通过无氧发酵、乙醇纯化和结晶获得琥珀酸在实例1中用于生产实琥珀酸的方法(使用NaOH作为pH调节剂)之后跟随一个 如以下所说明的乙醇纯化步骤-将发酵培养基(葡萄汁)离心(5000g，15min,20°C )(消除生物量)，-将95%的硫酸加入到清液中直至获得pH1. 5，-将该葡萄汁过滤通过一个布氏漏斗，该布氏漏斗具有SeitzEK板和FW20过滤用 土(消除一种蛋白沉淀物)，-通过在真空下蒸发将该滤液浓缩(浓缩因子在大约2至8之间波动)，
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-加入95%的乙醇，每体积浓缩滤液中具有2体积的乙醇，从而引起盐类的沉淀 (琥珀酸仍然是可溶的)，-通过过滤通过一个3微米的微孔膜过滤来分离该盐沉淀物，-通过在真空下蒸发来回收乙醇，-用活性炭进行处理(2%的PureflowC (基于干重)_80°C _1小时)，然后过滤通 过Seitz EK板和FW20过滤用土，-蒸发-结晶(Tp水浴75°C-剩余压力60mbar-晶态的处理物质(crystalline cooked mass)的干物质为大约50% ),-冷却该晶态的处理物质，在20°C下搅拌，-通过过滤通过一个3微米的微孔膜将这些晶体分离，-用软化水使这些晶体澄清，-在真空下在60°C下将这些晶体干燥过夜。
权利要求
通过在无氧条件下的一个大肠杆菌菌株的发酵来生产琥珀酸和/或琥珀酸根离子的一种方法，该方法包括(A)在一个发酵罐中的一个碳源的一个发酵步骤，该步骤是通过提供CO2、使发酵罐的多个通气孔关闭下进行，这样CO2的供给是由该菌株消耗的CO2来控制，在该碳源完全耗尽之前随后进行，(B)不供给CO2的该剩余碳源的一个发酵步骤，从而消耗残余的CO2。
2.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(A)开始时，该发酵培养基是用CO2饱和的。
3.如权利要求1和2之一所述的方法，其中步骤㈧和/或步骤⑶是在pH处于 6. 0-7. 0，优选地6. 4-6. 8的范围内进行的。
4.如权利要求1至3中任何一项所述的方法，其中该碳源是葡萄糖，并且其中 在步骤(A)开始时，该发酵培养基含有15-40g/l的葡萄糖，并且在步骤(B)开始时，该发酵培养基含有2-6g/l的葡萄糖。
5.如权利要求1至4中任何一项所述的方法，其中该大肠杆菌菌株具有 Δ adhE Δ IdhA Δ iclR Δ ackptaPYC基因型；优选地该大肠杆菌菌株是SBS550MG_pHL413菌株。
6.一种用于获得琥珀酸的方法，包括一种如权利要求1至5中任何一项所述的用于生产琥珀酸和/或琥珀酸根离子的方法；适当时，将这些琥珀酸根离子酸化以便生成琥珀酸； 一个纯化该琥珀酸的步骤，优选是一个乙醇纯化步骤；并且 可任选地，一个使该琥珀酸结晶的步骤。
7.一种用于生产琥珀酸的方法，该方法包括(a)在有氧条件下培养一个大肠杆菌菌株的一个步骤，在该步骤的过程中通过向该培 养基中加入一种镁化合物来调节PH，(b)在无氧条件下在CO2存在下通过使步骤(a)中培养的菌株发酵来生产琥珀酸根离 子的一个步骤，(c)将在步骤(b)中形成的这些琥珀酸根离子转化成琥珀酸的一个步骤。
8.如权利要求7所述的方法，其中在步骤(a)中该镁化合物是选自氧化镁、氢氧化镁以 及碳酸镁。
9.如权利要求7和8之一所述的方法，其中，在步骤(b)过程中，pH是通过向该发酵培 养基加入一种选自下组的化合物来调节的，该组的构成为镁化合物类、钙化合物类、钾化 合物类、铵化合物类以及钠化合物类，以及它们的混合物。
10.如权利要求7至9中任何一项所述的方法，其中步骤(b)是在pH处于6.0-7. 0、优 选6. 4-6.8的范围内进行的。
11.如权利要求7至10中任何一项所述的方法，其中步骤(c)包括一个酸化反应。
12.如权利要求11所述的方法，其中该酸化反应是通过加入至少一种酸来进行的，这 种酸选自正磷酸、草酸以及硫酸。
13.如权利要求7至12中任何一项所述的方法，其中在步骤(b)的过程中，pH是通过 向该发酵培养基加入选自由镁化合物类构成的组中的一种化合物来调节的，从而形成琥珀酸镁，并且步骤(C)包括(c-1)将在步骤(b)中形成的琥珀酸盐转化成琥珀酸钠的一个步骤，以及(c-2)通过双极电渗析将在步骤(c-1)中形成的琥珀酸钠转化成琥珀酸的一个步骤。
14.如权利要求7至13中任何一项所述的方法，其中该大肠杆菌菌株具有 Δ adhE Δ IdhA Δ iclR Δ ackptaPYC基因型；优选地该大肠杆菌菌株是SBS550MG_pHL413菌 株。
15.一种用于获得琥珀酸的方法，包括一种如权利要求7至14中任何一项所述用于生产琥珀酸的方法； 一个纯化该琥珀酸的步骤，优选地是一个乙醇纯化步骤；并且 可任选地，一个使该琥珀酸结晶的步骤。
16.一种用于生产琥珀酸的方法，包括(i)通过在无氧条件下在CO2存在下一个大肠杆菌菌株的发酵来生产琥珀酸镁的一个 步骤，在该步骤的过程中通过向发酵培养基中加入一种镁化合物来调节PH，并且 ( )将步骤(i)中形成的琥珀酸镁转化成琥珀酸的一个步骤。
17.如权利要求16所述的方法，其中在步骤(i)中该镁化合物是选自氧化镁、氢氧化镁 以及碳酸镁。
18.如权利要求16和17之一所述的方法，其中步骤(i)是在pH处于6.0-7. 0、优选地 6. 4-6.8的范围内进行的。
19.如权利要求16至18中任何一项所述的方法，其中步骤(ii)包括一个酸化反应。
20.如权利要求19中所述的方法，其中该酸化反应是通过加入至少一种酸来进行的， 这种酸选自正磷酸、草酸以及硫酸。
21.如权利要求16至20中任何一项所述的方法，其中步骤(ii)包括 (ii-a)将在步骤(i)中形成的琥珀酸镁转化成琥珀酸钠的一个步骤，以及(ii-b)通过双极电渗析将步骤(ii-a)中形成的琥珀酸钠转化成琥珀酸的一个步骤。
22.如权利要求16至21中任何一项所述的方法，其中该大肠杆菌菌株具有 Δ adhE Δ IdhA Δ iclR Δ ackptaPYC基因型；优选地该大肠杆菌菌株是SBS550MG_pHL413菌 株。
23.一种用于获得琥珀酸的方法，包括一种如权利要求16至22中任何一项所述用于生产琥珀酸的方法； 一个将该琥珀酸纯化的步骤，优选地是一个乙醇纯化步骤；并且 可任选地，一个使该琥珀酸结晶的步骤。
24.用于纯化来自一种发酵的葡萄汁的琥珀酸和/或琥珀酸根离子的一种方法，该方 法包括一个通过将硫酸加入该葡萄汁将该琥珀酸离子酸化从而生成琥珀酸的步骤， 一个通过加入乙醇使该琥珀酸纯化的步骤；并且 可任选地，一个结晶步骤。
全文摘要
本发明涉及通过在无氧条件下发酵用于生产琥珀酸和/或琥珀酸根离子的方法。
文档编号C07C51/43GK101896613SQ200880121078
公开日2010年11月24日 申请日期2008年12月15日 优先权日2007年12月13日
发明者劳伦·塞格伊尔哈, 卡罗琳·瓦尔拉莫弗, 奥利弗·卡朗德, 弗雷德里克·德艾 申请人:罗盖特公司