专利名称：α－酮基丁酸的产生的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于积聚α-酮基丁酸的方法。本发明也涉及天然的突变体微生物和/或经提取的酶的用途，用于产生天然的α-酮基丁酸。本发明也涉及获得emoxyfurone的方法。
背景技术：
α-酮基丁酸为2-氧代丁酸的同物异名词，可由多种微生物积聚。但根椐相反的报道，也显示该分子在平衡浓度范围内产生，也因此并不适于积聚。
在JP03183476中，已知属于假单胞菌属的微生物能够将2，3-二羟基丁酸转化为α-酮基丁酸。但是，假单胞菌属不是食物级微生物，因此通过该微生物发酵获得的α-酮基丁酸不易于应用于食品。这对于将由此方法获得的α-酮基丁酸进行进一步的处理而获得的衍生物而言也同样如此。
Nakahara、Nkajima-Kambe和Sato(Biotechnol.Lett.(1994)，16(3)，263-8)已显示α-酮基丁酸可由马红球菌(Rhodococcus equi)菌株积聚。但在此生物转化中，必须向培养基中加入1，2-丙二醇，所述1，2-丙二醇对获得食物成分而言并非优选。此外，并不能确保在合成食物成分中微生物对食物成分或反应物的产生是无害的。
也存在重组微生物中积聚α-酮基丁酸的进一步报道(Kisumi、Sugiura、Takagi和Chibata，抗生物杂志(J.Antibiot).(Tokyo)1977年1月；30(1)，111-7)。但当进一步用于香料(食物成分)的合成时，仍希望从未经遗传修饰的生物体中获得α-酮基丁酸。
Sluis等(Sluis、Wolken、Giuseppin、Tramper Wijffels，″苏氨酸、cysthionine和支链氨基酸对鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxi)代谢的影响″，酶微生物技术(Enzyme Microb Technol)，2000年2月1日；26(2-4)292-300)发现在真菌菌株中并不积聚α-酮基丁酸，这是由于在此微生物中α-酮基丁酸的代谢库库容始终处于平衡状态。
也已知高水平的α-酮基丁酸可能对微生物产生毒性(Fisher，Eisenstein，鉴定ilvA突变体的有效方法揭示出来自大肠杆菌的生物合成的苏氨酸脱氨酶中的氨基端催化结构域，细菌学杂志(J Bacteriol)，1993年10月；175(20)6605-13)。总之，通过生物转化可能难以获得α-酮基丁酸的积聚。
根据现有技术，本发明的一个目的是以生物技术方法获得α-酮基丁酸。具体地说，本发明的一个目的是从天然突变体而不是遗传改造的微生物中获得α-酮基丁酸。此外，适于积聚或产生α-酮基丁酸的微生物应为食物级微生物，以确保应用于食品时不会招致反对且无害。
具体而言，α-酮基丁酸为获得特定呋喃酮的起始点，所述呋喃酮如″Maggi-lactone″(5-乙基-3-羟基-4-甲基-2(5H)呋喃酮)，具有浓烈且特殊的香味，并以低浓度用作″前调(top-note)″。本发明的一个目的在于发现化学合成的α-酮基丁酸的替代物，前述化学合成的α-酮基丁酸至今一直用作进一步合成香料的中间体。
获得易于培养的微生物也是本发明的一个目的。
本发明进一步的目的是从菌株中通过生物转化获得α-酮基丁酸，所述生物转化不包括营养可疑的反应物。
发明概述显然，应用食物级微生物是可能的，所述微生物为天然突变体且能够积聚和/或分泌足够量的α-酮基丁酸。
因此，本发明的第一个方面提供了从在发酵培养基中培养的微生物中通过生物转化苏氨酸而积聚α-酮基丁酸的方法。
本发明的第二个方面提供了通过微生物的酶提取物进行苏氨酸的生物转化而积聚α-酮基丁酸的方法。
本发明的第三个方面提供了微生物的用途，用于从苏氨酸通过生物转化而产生α-酮基丁酸。
本发明的第四个方面提供了产生5-乙基-3-羟基-4-甲基-2(5H)-呋喃酮(emoxyfurone)的方法，其中用作前体的α-酮基丁酸可由本发明的方法获得。
本发明的一个优势在于其提供了便利且廉价地获得α-酮基丁酸的方法。
本发明的另一优势是其提供了获得α-酮基丁酸的生物技术方法。
又本发明的另一优势是提供了这样的α-酮基丁酸，其可容易地且安全地用于食品中，或其可被进一步加工成适于添加到食品中的物质。
一个优势是，根据本发明产生的α-酮基丁酸可由食物级微生物产生。
本发明的其它特征和优势将在当前优选的实施方案中描述并彰显，所述实施方案在下面陈列且参照附图
图1显示随时间(小时)的延长每升发酵培养基积聚的α-酮基丁酸(OBA＝氧代丁酸)的量，单位是mg/L。两条曲线说明了二步骤发酵法，其中在第一培养基中发酵72小时后将微生物的生物量转移到适于积聚OBA的第二培养基中。两条曲线中较低的一条用作对照(培养基中不加入苏氨酸)。
发明详述在本说明书的上下文中，单词″包含″意指″包括，同时还含其它″。不应理解为″仅由其组成″。
术语α-酮基丁酸可由其同物异名词2-氧代丁酸或由其相应的共轭酸的名称替换。
表述的″天然突变体″意指突变体微生物，所述微生物由除遗传工程之外的其它方法获得。换言之，该表述指非-GMO(遗传修饰的生物体)。
本发明上下文中的突变不应理解为单一位点的突变或仅存在于特定基因编码区的突变。与之相反，突变为任意基因座的任意形式的DNA改变，所述改变影响到突变的上下文中提及的特定基因产物的活性。例如，不应认为ilv-3突变(粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)中的基因座)仅限定于ilv-3基因的编码区。
如用于″连锁群IV″中的术语″连锁群″为遗传学中使用的术语，该术语指一条染色体上具有趋向于共同遗传的不同基因座的区域。
术语″连锁群IV″是指粗糙脉孢菌的一个染色体区域，该区域掺入了ilv-3基因座。详见Kuwana H和Wagner RP，粗糙脉孢菌的iv-3突变体，I.遗传和生物化学特征，遗传学(Genetics)62479-485，1969。
本发明上下文中的ilv-3基因意指编码EC 4.1.3.18(酶命名号)的基因。Ilv-3为粗糙脉孢菌中基因的名称。但是，认为此处的术语也包括其它生物体如酿酒酵母(Saccharomyces cescerevisiae)中具有相同功能的基因，其中已知该基因缩写为ILV-2。
此处应用的EC编号指由生物化学和分子生物学国际联合会(IUBM)制定的酶分类系统。
本发明的上下文中所表述的″不同的″培养基并非意在限定为完全不同的或新的培养基。但其意指使用的培养基调节为具有特异的功能，所述功能与先前培养基之一的功能不同。可通过如加入营养物、改变pH值或替换全部培养基进行调节。因此根据上下文，术语″不同的″培养基可替换为术语″经修饰的″或″第二″培养基。
优选地，在根据本发明方法的一个实施方案中，微生物为食物级微生物。更优选地，微生物为细菌、真菌或酵母。
优选地，微生物为细菌或真菌。如果为真菌，其优选地属于子囊菌(Ascomycota)门，更优选地属于Sordariomycetidae亚纲且更优选地属于Sordariales目。在一优选实施方案中，微生物属于脉孢菌属。
在一优选的实施方案中，微生物为粗糙脉孢菌菌株。
在本发明的一优选实施方案中，微生物为天然突变体微生物。
优选地，根据本发明的微生物具有影响异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸生物合成途径的突变。
优选地，微生物为粗糙脉孢菌连锁群IV的突变体。例如，该天然突变体为iv-3突变体。
优选地，天然突变株选自以下引用的菌株，Kuwana H和Wagner RP，粗糙脉孢菌的iv-3突变体，I.遗传和生物化学特征，遗传学(Genetics)62479-485，1969。
优选地，天然突变株为可从堪萨斯医学中心的真菌遗传储存中心(Fungal genetics Stocks Centre)购买的粗糙脉孢菌菌株，其目录号为FGSC575，且具有以下的特征接合型A、基因型ilv-3、等位基因Y7110、连锁群IVR、遗传背景L、诱变剂M，标志异亮氨酸加缬氨酸-3。参考文献Barrat等，1954，遗传学进展(Adv Genet)61-93。Perkins等，1969，遗传学(Genetica)40247-278。该菌株具有位于ilv-3基因的突变。
因此，在本发明的一优选实施方案中，天然突变体包含ilv-3基因产物的功能失调、缺陷或被抑制和/或ilv-3基因的突变。
在一优选实施方案中，微生物所呈现的乙酰羟酸(acetohydroxy acid)合成酶活性非常低或缺失。
在一优选实施方案中，微生物的脱羟酸脱水酶或乙酰羟酸合成酶缺乏或受到抑制。
优选地，根据本发明的方法包括一步、两步或更多的步骤。如果包括两步或更多的步骤时，其中至少一个步骤产生微生物生物量且至少一个其它步骤积聚α-酮基丁酸。
优选地，根据本发明的方法为两步骤或多步骤的连续或不连续发酵。
在一优选实施方案中，本发明的方法包括在利于生物量产生和酶活性的第一培养基中培养微生物，以及之后在利于α-酮基丁酸积聚和/或分泌的不同培养基中培养该生物量。
优选地，产生生物量后，过滤第一培养基，收集残留物(微生物)并将其转移到不同的培养基中。
备选地，可在微生物存在下调整培养基来形成不同的培养基，即不经过过滤步骤。
在一优选实施方案中，利于积聚α-酮基丁酸的培养基(例如第二培养基)包含0-1％的缬氨酸、0.2-10％的苏氨酸(重量百分比)和/或其pH调节到7-14。优选地，培养基包含0.2-5％的苏氨酸。
第一培养基可为化学上定义的培养基，所述培养基利于生物量的形成以及合适的酶活性。
第二或不同的培养基包含额外的缬氨酸(酶触发剂)和/或苏氨酸(前体)。
优选地，第一和第二培养基的pH值不同。
例如，第二培养基包含额外的缬氨酸和/或苏氨酸。
优选地，该方法进一步包括从发酵培养基中提取、分离和/或纯化α-酮基丁酸。
例如，可用具有适宜树脂的柱子或通过HPLC从培养基中分离α-酮基丁酸。
在一备选实施方案中，α-酮基丁酸仅经过预纯化，这意味着仅在不完全的、部分分离含α-酮基丁酸的培养基后，即直接将其用于进一步的处理。例如，可仅过滤培养基以移除微生物并直接用于进一步的处理。如果emoxyfurone或sotolon(前调香料)为终产物的话，该方法可获得良好结果。完成Emoxyfurone或sotolon的合成之后可容易地对其进行分离。
为使本发明运转，必须确定适宜的菌株。可根据菌株的代谢特征对其进行筛选。通常，苏氨酸到α-酮基丁酸的生物转化在大多数生物体中普遍存在，所述生物体包括动物、高等植物和单细胞生物体。因此，可从大量的生物体中筛选出适宜的菌株。优选地，在为野生型的情况下，筛选到的微生物或细胞系具有将α-酮基丁酸转化为2-乙酰-2-羟基-丁酸的能力。换言之，如果以野生型形式出现，该微生物能够合成异亮氨酸和/或缬氨酸和亮氨酸。对高等植物和许多单细胞生物体而言该条件同样必需。如果其中缬氨酸或异亮氨酸途径经受了某种程度的负向影响，则任何种类的该生物体均可适于积聚α-酮基丁酸。
例如，筛选出由于乙酰羟酸合成酶(该酶的酶命名号为EC 4.1.3.18)缺乏、功能失调或受到抑制而积聚或分泌α-酮基丁酸的菌株，所述乙酰羟酸合成酶能够在如以上所提及的野生型生物体中将α-酮基丁酸转化为α-酮-2-羟基-丁酸。该酶也称作乙酰乳酸合成酶，这一名称与其将丙酮酸转化为α-乙酰乳酸的能力对应。因此，可筛选该酶受到抑制、缺乏、功能失调或完全不表达的菌株。例如，可应用这样的天然突变体，其中编码该酶的基因或参与其表达的转录因子中存在突变使得相应的酶不具有正常的功能。
当然，其它突变体也能够积聚α-酮基丁酸。特别是，可应用包含影响缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸生物合成途径的一个或多个突变的菌株。例如，也可筛选乙酰羟酸还原异构酶(EC 1.1.1.86)、二羟酸脱水酶(EC 4.2.1.9)或支链氨基酸转氨酶(EC 2.6.1.42)等缺失而具有积聚α-酮基丁酸能力的菌株，且因此前述菌株可成为本发明的适宜菌株。但是，其它突变体也可积聚α-酮基丁酸。
例如，应用优选地选自子囊菌亚门(ascomycotina)的真菌菌株。但是，特定细菌也是适宜的。例如可应用酵母菌株。但是，也可应用来自脉胞菌属、特别是来自粗糙脉孢菌种的菌株。在本发明的一个实施方案中，可应用以上提及的来自堪萨斯大学医学中心的粗糙脉孢菌菌株。该特定菌株已经在下文中被描述为Y7110-菌株Kuwana和Wagner，粗糙脉孢菌的iv-3突变体，I.遗传和生物化学特征，遗传学(Genetics)62479-485，1969。
通常，食物级微生物为优选。
为获得α-酮基丁酸，必须选择适宜的培养基。根据所选择的菌株，也可制备预培养物。通常，用于预培养物或主发酵的最佳培养基的选择以及所有发酵参数高度取决于所选择的菌株。技术人员通常明晓特定菌株的最佳生长或培养条件。
例如，如果应用真菌如粗糙脉孢菌，获得孢子悬液用作起始材料即足够，前述悬液在处理的较后阶段允许进行同步且快速的生物量生产。对大多数真菌菌株而言，利于形成孢子的特定发酵参数(温度、pH、光、营养补给)为公知。例如，在粗糙脉孢菌菌株中，可应用称作Horowitz的培养基(琼脂)(参见Deutsch，″Das ExperimentSporenmusterbildung beimSchlauchpilz N.crassa″，Biologie in unserer Zeit，1993，23(4)259-264)。将粗糙脉孢菌菌株划线到琼脂-锥形瓶上并在光下25℃生长120小时。通常，选择已知可利于孢子形成(有性或无性产生)的条件。当已积累起足够的生物量时，即可将无菌水加到琼脂平板上，在轻轻振动时前述的无菌水可悬浮孢子。由此获得的孢子悬液可用作起始培养物。在选择细菌或细胞系进行本发明的情形下，起始材料的制备有所不同，这要考虑特定细菌菌株或细胞系的特殊性。
可应用起始培养物接种培养基，所述培养基利于营养生长、生物量产生和/或α-酮基丁酸的积聚，同时不降低或降低孢子的形成。如果选择粗糙脉孢菌进行本发明，可将起始材料加到液体培养基如Vogel-蔗糖培养基中，如前所述(Deutsch，″Das ExperimentSporenmusterbildung beimSchlauchpilz N.crassa″，Biologie in unserer Zeit，1993，23(4)259-264)。实验室规模生产时，可将孢子加到锥形瓶中的液体培养基内，置于25℃并于100-200转/分钟振荡。
开始发酵后，例如接种后8到40小时，优选地为接种后8到30小时，可将苏氨酸加至培养基以使每升培养基中苏氨酸的浓度达到0.1-5％(重量百分比)，优选地为0.2-4％，更优选地为0.5-3％。
如果应用的菌株缺乏乙酰乳酸合成酶，也可将异亮氨酸和缬氨酸加到培养基中，这是由于该菌株不能合成这些氨基酸。当然，对具有影响异亮氨酸/缬氨酸途径的任何突变或缺陷的菌株而言也是如此。但是，由于反向或正向反馈调节机制，这些氨基酸应以精确调节的量加入。具体而言，高水平的异亮氨酸抑制或下调苏氨酸脱水酶(粗糙脉孢菌中的ilv-1基因产物)的活性，且因此减少α-酮基丁酸的积聚。有趣的是，缬氨酸是粗糙脉孢菌的ilv-1基因产物的激活剂，也不能以大剂量加入。因此，加入到培养基的缬氨酸的起始数量为0.005到1.5％的总培养基重量。优选地，加入到培养基的缬氨酸量为占0.01到1％的重量，更优选地为占0.01-0.5％的重量。
但是，发酵时间取决于进行发酵的类型。
经过最佳发酵时间后，由以上描述的粗糙脉孢菌所发酵的培养基中α酮基丁酸的积聚可达到较高的量。开始发酵20到200小时后，优选地为40到150小时后可达到最大量。
如以上描述的用于获得α-酮基丁酸的生物量的培养通常是指连续的发酵过程。例如，发酵开始后可不向培养基中加入任何物质。另外，可仅在特定时间如培养基接种10到40小时后加入苏氨酸或营养物。根据另一变更，发酵开始后在不同的时间间隔加入苏氨酸，例如在8、16、24、48和72小时后加入苏氨酸。此外，可根据此模式加入其它代谢物或营养物。
如以上所描述的连续处理或具有过渡特性的分批处理的特征通常表现为生物量的形成基本上与关键代谢物的积聚同时实现。同时，除了通常在发酵中出现的pH降低外，并不导致pH的显著改变。
备选地，可应用更为复杂的连续两步(或更多)步骤的方法。人们惊异地发现，此类发酵生成的α-酮基丁酸的浓度要高得多，这是由于培养基组分已根据特定步骤的特定效果进行了优化。例如，可设计第一步骤为针对生物量积聚以及随后的步骤如第二步为实质上进行生物转化。
令人惊异地是，两(或更多)步骤发酵方法被证实特别适于α-酮基丁酸的积聚。可进行两步骤方法。首先，可进行连续两步骤发酵方法。相应地，在特定的pH可产生生物量。当积聚起足够量的生物量时(例如0.01g湿重/ml)，改变pH(或菌株特异的其它参数)，且任选地，不丢弃初始培养基并加入另外的培养基成分。
当然，根据所应用的经筛选微生物，pH和其他参数可显著不同。具体而言，用于生物量形成和α-酮基丁酸合成的最佳pH可能不同于以下给出的数值。甚至也有可能的是，菌株的两步骤中生物量形成和α-酮基丁酸合成的最佳pH相同或类似。
如果用以上描述的粗糙脉孢菌菌株生产α-酮基丁酸，用于生物量积聚的起始pH可低于7，优选地为4到6，更优选地为4.5到6。在此pH和20到30℃温度下，开始发酵并进行1到10天，优选地进行2到5天，例如前述发酵应用以上提及的Vogel-蔗糖培养基并进行振荡或搅动。
当积聚到足够的生物量后，可通过加入NaOH将pH调节到7到14，优选地调节到9到11，以开始生物转化过程。此外，可在此阶段加入苏氨酸、缬氨酸和/或异亮氨酸。
根据本方法，以上鉴定的粗糙脉孢菌菌株在每升培养基中可生产2到10g的α-酮基丁酸。此外，由于仅改变pH基本上足以启动α-酮基丁酸合成的增加，因此本方法简单且快速。
另一方面，在本发明的上下文中，不连续的两步骤方法也是可能的。因此，积聚生物量后，将其从培养基中分离，例如通过过滤完成前述分离。之后，将生物量置入新培养基，所述培养基调整为可促进α-酮基丁酸的积聚。
在应用真菌粗糙脉孢菌菌株积聚α-酮基丁酸的情形中，促进其积聚的培养基的pH为7到14，优选地为9到11。与连续两步骤方法类似，该方法生产大量的α-酮基丁酸(3-10g/L)。通过进一步具体调节培养基甚至可获得更高的浓度。
例如，可在同样用于连续两步法的Vogel-蔗糖培养基中进行生物量形成。例如，可在轻轻振荡或搅拌下，于10℃到45℃，优选地于22℃到30℃进行1到7天，优选地进行1到42天的生物量的积聚。
对于生物转化，可从适于产生生物量的第一培养基中通过例如过滤来分离生物量，并置入适于生物转化的缓冲液中。该缓冲液或培养基的特征通常为其pH和氨基酸浓度利于靶分子的积聚。技术人员知晓加到培养基中的因子以及为此目的而调节的参数。选择的因子通常激活所需的生物转化中的酶。
例如，如果应用以上定义的粗糙脉孢菌菌株，应用pH为7-14且优选地为9-11的磷酸盐缓冲液(0.1M)或甘氨酸缓冲液(0.1M)。缓冲液可补充以苏氨酸，例如其浓度为0.1-10％，优选地为0.1-5％，更优选地为0.2-4％，以及补充以缬氨酸，例如其浓度为0.005-1.5％，优选地为0.01-0.5％，以使苏氨酸转换为α-酮基丁酸。磷酸盐缓冲液中用于生物转化的发酵可进行12小时到3天，优选地进行18小时到48小时，发酵温度为10到45℃，优选地为23到30℃。
通常，可应用与所描述的用于以上列出的连续一步法相同的起始和液体培养基以及相同地添加特定氨基酸的额外补充物。
当然，除了应用完整的微生物进行发酵外，也可应用该微生物的酶提取物或可商业获得的酶分离物进行从苏氨酸到α-酮基丁酸的生物转化。例如，可从此处提到的粗糙脉孢菌菌株中提取酶。然后制备包含最佳pH、酶激活剂和前体的培养基用以积聚α-酮基丁酸。
根据α-酮基丁酸进一步的用途，可通过例如带有适宜树脂的柱子或通过HPLC从培养基中分离α-酮基丁酸。
但是，如果α-酮基丁酸用作合成其它终产物的中间体，前述终产物如香料emoxyfurone(5-乙基-3-羟基-4-甲基-2(5H)-呋喃酮)或sotolon(3-羟基-4，5-二甲基-2(5H)-呋喃酮)，那么纯化或分离处理即已足够。这两种香料一般构成″前调″，其应用浓度非常低。
例如，emoxyfurone的产生可通过从培养基中过滤真菌菌丝实现，任选地进一步纯化培养基以及通过改变条件以促进内酯化反应。
在第一步骤中，确定培养基中α-酮基丁酸的浓度即足够。向培养基中加入与α-酮基丁酸相同浓度的K2CO3有利于α-酮基丁酸的烯醇互变异构体的形成。此后，可将pH调节到8并加入磷酸盐缓冲液。然后，例如将培养基于120℃加热4小时。任选地，可在此阶段加入沸石以防止沸腾溅出。在此步骤，形成了emoxyfuone(5-乙基-3-4-甲基-2(5H9-呋喃酮)，其由最初的两分子α-酮基丁酸组成，其中的一个分子为烯醇形式。此后，可将培养基冷却到低于10℃并加入10％HCl(每份α-酮基丁酸加入10份的10％HCl)。随后，可再次加热培养基1/2到3小时以降低酮水解。可在40-90℃应用真空器(10到100毫巴)以最终形成环，前述真空器导致水和(1/2)CO2从分子中分离并导致形成emoxyfuran。
通过醚萃取可容易地从培养基中分离出emoxyfurone(一种内酯)，例如通过在水系统中应用3个循环的甲基四丁基醚并加入硫酸钠。
以下给出的实施例仅用于例证的目的且绝不可理解为对本申请主题的限制。除非另外指出，百分比和份为重量计数。
实施例1通过生物转化粗糙脉孢菌中的苏氨酸积聚α-酮基丁酸材料和方法具有ilv-3(-)基因型的粗糙脉孢菌菌株的孢子从堪萨斯医学中心购买，目录号为FGSC 575，接合型为A，涂布在锥形瓶中的琼脂上用于起始材料的制备。用于此目的的″Horowitz″培养基的组分在以下的表1中给出。
表1用于培养粗糙脉孢菌以获得孢子的″Horowitz″培养基
*总盐溶液25gK-Tartrat(半水合酒石酸二钾，Merck)20g硝酸钠5gKH2PO42.5gMgSO4×7H2O0.5gCaCl2×2H2O0.5gNaCl用蒸馏水调至1000ml。
**生物素溶液将5mg生物素溶解在100ml的50％乙醇中。
光下于25℃培养菌株120小时。
然后，将10ml的蒸馏水加到锥形瓶中以悬浮孢子。取4ml的悬液并置入含液态“Vogel-蔗糖”培养基的锥形瓶中，所述培养基在下表2中给出。该培养基从开始即强化以L-缬氨酸和L-异亮氨酸。此外，“Vogel-蔗糖-培养基”包含经改进的″Vogel-盐溶液″，其成分在以下的表3中给出。于25℃、100转/分钟条件下发酵168小时(7天)。开始发酵24小时后加入L-苏氨酸(10g/L)。
表2用于粗糙脉孢菌发酵的″Vogel-蔗糖″培养基
表3用于″Vogel-蔗糖″发酵培养基中的经改进″Vogel-盐″溶液
***痕量元素溶液5g柠檬酸×H2O5gZnSO4×H2O1gFe(NH4)2(SO4)×6H2O0.25gCuSO4×5H2O0.05gMnSO4×H2O0.05gH3BO30.05gNa2MoO4×2H2O(二水合钼酸钠)用蒸馏水调至100ml。
24、48、72小时后采取培养基样本并通过HPLC(高效液相色谱)进行分析。
结果在培养基中，积聚的α-酮基丁酸高达400mg/L(HPLC-分析)。
总之，通过发酵天然突变体微生物，有可能获得α-酮基丁酸在培养基中的积聚。在本实施例中，证明天然ilv-3突变体子囊菌亚门真菌(粗糙脉孢菌)是有效的。
实施例2两步发酵法提高了α-酮基丁酸的积聚材料和方法应用与实施例1中引用的相同的菌株、培养基和设备。
在首次发酵中，生物量的产生通过接种培养基实现，根据实施例1中的数据所述培养基包含强化的Vogel-盐溶液、L-缬氨酸和L-异亮氨酸(稍后加入苏氨酸)。发酵开始时pH为5.8，于26℃轻度振摇(200转/分钟)72小时后降至4.4。
然后过滤(0.22μm)菌丝细胞并将其转移到不同的培养基中，所述培养基为额外包含苏氨酸(2％)和缬氨酸(0.03％)的磷酸盐缓冲液(0.1M)。用NaOH(10N)将pH调节到10。
于25℃和200转/分钟的条件下反应总共110小时后，通过过滤培养基移除生物量来打断生物转化，并4℃储存滤出液用于进一步的分析。
结果应用粗糙脉孢菌进行两步发酵后在培养基中获得了高含量的α-酮基丁酸(＞8g/l)。图1表明在总发酵过程中α-酮基丁酸随时间的积聚。苏氨酸到α-酮基丁酸的生物转化高达90％。
总之，应用食物级的天然突变体微生物以适宜培养基进行两步骤发酵生成了足够量的由苏氨酸转化而来的α-酮基丁酸，使工业生产成为可能。
权利要求
1.通过在发酵培养基中培养微生物来生物转化苏氨酸而积聚α-酮基丁酸的方法。
2.通过微生物的酶提取物生物转化苏氨酸而积聚α-酮基丁酸的方法。
3.根据权利要求1或2的方法，其中微生物为食物级微生物。
4.根据权利要求1到3中任意一项所述的方法，其中微生物为粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)菌株。
5.根据权利要求1到4中任意一项所述的方法，其中微生物为天然突变体微生物。
6.根据权利要求1到5中任意一项所述的方法，其中微生物显示出非常低的或没有乙酰羟酸合成酶活性。
7.根据权利要求1到6中任意一项所述的方法，所述方法包括在利于微生物生物量产生的第一培养基中培养微生物，以及其后在利于α-酮基丁酸积聚和/或分泌的不同培养基中培养该生物量。
8.根据权利要求7的方法，其中利于α-酮基丁酸积聚和/或分泌的培养基包含重量百分比为0.1-10％的苏氨酸、0-1％的缬氨酸和/或其pH调节至7-11。
9.根据权利要求1到7中任意一项所述的方法，所述方法进一步包括从发酵培养基中提取、分离和/或纯化α-酮基丁酸。
10.微生物的用途，用于通过生物转化苏氨酸而产生天然的α-酮基丁酸。
11.用于产生5-乙基-3-羟基-4-甲基-2(5H)-呋喃酮(emoxyfurone)的方法，其中用作前体的α-酮基丁酸为根据权利要求1到10中任意一项所述的方法产生。
全文摘要
公开了通过生物转化获得α－酮基丁酸的方法。该分子在培养基中积聚并易于随后加工成食物组分如前调香料。适宜的菌株为粗糙脉孢菌的天然ilv－3突变体菌株，所述菌株能够在发酵培养基中积聚α－酮基丁酸。通过调节特定的培养基参数，每升培养基中可积聚高达8g的α－酮基丁酸。
文档编号C12R1/645GK1592788SQ02823306
公开日2005年3月9日 申请日期2002年11月8日 优先权日2001年11月29日
发明者B·D·祖尔布里根, N·雷克黑夫, M·梅尔曼－德－凯姆普斯, K·勒奇 申请人:雀巢产品有限公司