自体生长因子鸡尾酒组合物,生产方法以及应用的制作方法

专利名称：自体生长因子鸡尾酒组合物,生产方法以及应用的制作方法
背景同大多数细胞一样，软骨细胞具有一个生命周期，该周期涉及到成熟与分化的阶段。软骨细胞可以以间质干细胞开始生命，该细胞在增殖期间成为前成软骨细胞(pre-chondroblast)。这些前成软骨细胞在分化/基质生成期间成为成软骨细胞。成软骨细胞可随后进行增生或者成熟化，从而形成软骨细胞。
发明概述本发明涉及一种组合物，该组合物包括至少一种适用于骨生成、腱生成(tenogenesis)和/或软骨生成治疗的生长因子，但不限于这些，其中该生长因子获自培养的软骨细胞。
本发明还涉及一种制造生长因子组合物的方法，该方法包括对来自受试者的软骨细胞进行培养并且从软骨细胞培养物中对至少一种生长因子进行浓缩的步骤。
另外，本发明涉及一种治疗骨、肌腱或者软骨或其缺陷的方法，该方法包括将该组织或者缺陷同至少一种生长因子相接触的步骤，其中该生长因子获自于培养的软骨细胞。


图1所示为用自体软骨植物对软骨修复的分子控制。
图2所示为软骨细胞中的生长因子和转录因子的基因表达。
图3所示为软骨细胞中的生长因子、基质蛋白和转录因子的基因表达。
图4所示为软骨细胞中的生长因子、基质蛋白和转录因子的基因表达。
图5所示为软骨细胞中的RANKL及其受体的基因表达。
图6所示为软骨细胞中的甾体类激素受体的基因表达。
图7所示为未经浓缩的对照样品与经浓缩的样品之间的生长因子的Western印迹比较。
图8所示为未经浓缩的对照样品与经浓缩的样品之间的生长因子的浓度比较。
图9所示为对人类软骨细胞培养物施用本发明的生长因子后的软骨细胞培养物。
详细描述本文所使用的术语“约”指的是某一具体数值的值±10％范围。例如，“约20”包括20的±10％或者说从18到20(含18和20)。
本文所使用的术语“基本”或者“基本上”指的是对一个较高程度或者量度的近似。
软骨细胞已经通过使用多种技术进行了培养。用于软骨细胞的单层培养、用于软骨细胞的胶原凝胶培养物、用于软骨细胞的藻酸盐凝胶培养以及用于软骨细胞的琼脂糖凝胶培养均有所描述。这些细胞被发现在琼脂糖凝胶中进行培养期间可产生细胞外蛋白。
在本发明的一个实施方案中，该培养物可具有约每75cm21百万个细胞的平铺密度。这些软骨细胞可在含有抗坏血酸的10％到20％的自体溶液中进行生长。在一个实施方案中，用于本发明的应用的软骨细胞的适当生长条件在WO 00/09179和5,989,269中有所阐明，此二者均被全文引为参考。见实施例6到10，这些实施例展示了用于本发明的典型的细胞培养方法。
如果软骨细胞产生了细胞外蛋白或者生长因子，通过软骨细胞在这些培养系统中的形态学外观来测定该细胞产生了何种类型的细胞外蛋白或者生长因子是困难的。因此，需要开发一些技术和方法以促进软骨细胞对细胞外基质蛋白和生长因子的生产。进一步，对细胞群所产生的生长因子的特征进行鉴定是必需的，该细胞群同软骨生成、腱生成以及骨生成的诱导相关联。
众多的生物化合物控制着软骨细胞的发育。这些化合物可从软骨细胞中，特别是从软骨细胞的单层培养物中进行提取和/或浓缩以形成一种生长因子组合物，一种所谓的生长因子“鸡尾酒”，该组合物可在治疗上用于治疗软骨、肌腱和/或骨组织和缺陷。例如，在一个实施方案中，本发明包括了经提取和/或浓缩的生长因子在整形外科手术中的应用，该生长因子获自本发明的一种组合物。
进一步，本发明的生长因子组合物可在重构方法和设备中具有治疗价值，该方法和设备包括用于脊椎、髋、膝、肩、腕、踝和趾以及骨折固定和不愈合骨折的治疗的方法和设备，该组合物还可在其它的产品中具有医学价值，例如，结合剂，包括骨水泥、磷酸钙、硫酸钙、羟基磷灰石以及它们的组合，但不限于这些，该产品的例子还有其它的自体生长因子。本发明的组合物以及应用的方法在此后进行描述。
1.生长因子据发现，软骨细胞，特别是单层培养的软骨细胞具有产生多种生长因子的能力，所述生长因子包括，转化生长因子(TGF-β3)、骨形态发生蛋白(BMP-2)、PTHrP、osteoprotegrin(OPG)、Indian Hedgehog、RANKL以及类胰岛素生长因子(IgF1)，但不限于这些。
在一个实施方案中，本发明的生长因子组合物，以及其它物质，根据下文描述可从软骨细胞的单层培养物中进行提取以形成本发明的组合物，该组合物可被用于治疗目的。另外，在另一个实施方案中，本发明的生长因子组合物可从一些含有适当的生长因子的组合物中进行提取以形成一些组合物，所述组合物含有一种或者多种基本上富集和/或浓缩的生长因子，这些生长因子根据下文的详尽描述可被用于治疗目的。
A)生长因子的衍生在一个实施方案中，本发明的生长因子组合物来自于一些细胞，这些细胞包括自体的软骨细胞，但不限于此。以此方式，来自于自体软骨细胞的生长因子的分布(profile)可基本上符合受试者的生长因子的天然分布。
在另一个实施方案中，可以使用在PCT申请No.PCT/IB02/02752中所描述的技术对受试者的生长因子组合物进行初始鉴定，该申请的全文在此引为参考，特别是使用在该PCT申请的实施例1、2和3中所描述的技术，这些实施例在本文中以实施例2、3和4进行重申。其它的适当技术包括，western印迹分析以及对受试者生长因子分布进行的免疫荧光表征，但不限于这些。
一旦对受试者的生长因子分布进行了适当地鉴定，可将该分布同其它的测试分布进行比较以发现一种适当的生长因子组合物，该组合物所具有的分布基本上符合的待治疗细胞或者组织的生长因子分布。在一个实施方案中，该测试分布可从通过对一些生长因子进行鉴定而产生，这些生长因子来自a)非自体细胞，b)在不同时间从受试者收取的自体细胞和/或c)具有不同于该受试者的软骨细胞的形态的自体细胞。或者，该分布可以使用重组DNA技术产生，即，使用微生物以生产生长因子蛋白并且随后将这些蛋白进行混合以产生一种蛋白混合物，该混合物所具有的分布基本上一致于该受试者的待治疗细胞或者组织的生长因子分布。
在另一个实施方案中，一种生长因子组合物可通过添加或者除去一种或者多种生长因子蛋白以产生一种组合物而进行修饰，该组合物所具有的常规分布或者分布可基本上符合受试者的分布或者另一种所需的分布。
B)生长因子的功能上述的生长因子在软骨、肌腱和骨再生中十分重要。首先，在培养的软骨细胞的细胞增殖期间存在有TGF-β3、BMP-2、PTHrP、IndianHedgehog、OPG、RANKL以及IGF1。据信这些因子以及其它因子可以控制软骨细胞、腱细胞和成骨细胞的增殖和分化，从而影响软骨生成、腱生成和骨生成程序。因此，通过以本文所描述的生长因子对受损伤的受试者进行适当地给药，可以提高任何需要软骨细胞、腱细胞和成骨细胞参与的愈合，由此而增强了从损伤或疾病的恢复。
在基质产生期间，II型胶原和/或聚集蛋白聚糖以及其它基质物质可以控制基质产生的程度。据信这样的控制可以通过细胞反馈进行维持。具体来说，一些生长因子和细胞因子调控着一些转录因子，这些转录因子随后调控着细胞外基质蛋白的产生，例如II、IX和XI胶原、聚集蛋白聚糖、CEP-68和GP39，这些蛋白随即可调控生长因子和细胞因子的存在，即，通过降低这些生长因子和细胞因子的细胞外浓度。
图1所示为软骨细胞系的特征以及在自体软骨细胞移植之后的软骨修复的分子控制。在体外的增殖期间，软骨细胞产生了一些生长因子和细胞因子，包括，TGF-β3、BMP-2、PTHrP、Indian Hedgehog、OPG、RANKL，但不限于这些。在移植进入受试者之后，软骨细胞在基质产生之前产生。同样还产生了SOX-9、II型胶原、聚集蛋白聚糖以及其它的细胞外基质蛋白。在基质产生之后，包括维生素D3在内的多种因子可能调控着软骨细胞基质的成熟或者修饰。
图2所示为单层培养的软骨细胞中的生长因子和转录因子的表达。如图2所示，生长因子TGF-β3和BMP-2在软骨细胞中进行了表达。同样，转录因子SOX-9也被表达。
图3显示，当ROX-9被表达时基质蛋白CEP-68同样也被表达，这表明被检测的软骨细胞能够产生基质和生长因子。
图4显示，当生长因子TGF-β3被表达时基质蛋白聚集蛋白聚糖和II型胶原也被软骨细胞所表达。
使用逆转录酶PCR通过基因扩增的30个循环，图5显示检测不到RANKL的表达。但是，通过34个循环可以发现RANKL的mRNA，由此显示可以发生RANKL的表达。进一步，图5显示RANKL的细胞受体，即GADPH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)，以及OPG在软骨细胞中也有所表达。这些数据提示，RANKL对于软骨细胞生长可能是重要的。
图6显示，甾体类激素受体GADPH、GRα、GRβ以及VDR在软骨细胞中有所表达。这些数据提示软骨细胞对于一种或者多种甾体类激素的反应可能提供了一种途径，该途径调控软骨细胞对于生长因子的生产。可能的适当的甾体类激素包括维生素D3和糖皮质激素，但不限于这些。
因此，在一个实施方案中，单层培养物中的软骨细胞可产生多种生长因子，包括，转化生长因子、骨形态发生蛋白、PTHrP、osteoprotegrin、RANKL以及Indian Hedgehog，但不限于这些。这些生长因子形成了生长因子“鸡尾酒”，该鸡尾酒可通过本发明的方法进行提取并且随后被递送进入受试者体内。根据本文的描述，这些生长因子可获自受试者自身的自体软骨细胞并且被用于组织缺陷的治疗，这些组织包括，骨、肌腱和软骨缺陷，但不限于这些。
例如，通过将自体软骨细胞移植技术用于治疗软骨缺陷，软骨细胞在体外进行增殖并且产生生长因子。在移植入受试者体内之后，这些软骨细胞可以在基质产生阶段开始生产细胞外基质蛋白。通过软骨细胞进行的软骨发生过程的特征在于转录因子SOX-9的存在。
因此，通过上文描述的信息，发现在生长因子的表达和/或存在与转录因子的表达之间存在着因果关系，导致基质蛋白基质蛋白的表达和产生的这些转录因子的表达适于骨、肌腱和软骨组织和缺陷的再生和/或治愈。
2.生长因子从软骨细胞中的分离在本发明中，可以从被培养的软骨细胞的培养基之中对本文所描述的一种或者多种生长因子以及其它生长因子进行了提取和/或纯化，从而形成了本发明的组合物，这些组合物可被用于治疗目的。另外，在另一个实施方案中，可从被培养的软骨细胞的培养基之中对上文所描述的生长因子进行浓缩，从而形成了本发明的组合物，这些组合物可被用于治疗目的。
在一个实施方案中，本发明的生长因子的提取纯化和/或浓缩可通过透析过滤而完成，该方法可被用于从血清和其它的生物流体之中除去小分子量的分子。在本发明中，透析过滤，或者更常用的名称“超滤”，使用净水压代替浓度梯度从软骨细胞培养物的上清液中对上述的生长因子进行提取、浓缩和/或纯化，在优选的情况下该软骨细胞培养物为人类软骨细胞培养物。在一个实施方案中，通过将细胞培养物加载至离心过滤设备，从而导致该细胞培养物物质分相而获得含有生长因子的上清液，在典型的情况下分相成为一个液相和一个固相，该设备的例子如Millipore/Amicon所制造的Centriplus离心过滤设备。
在除去细胞碎片之后(典型情况下为固相)，可对该培养物上清液通过一个或者多个低吸附的疏水YMT膜(Millipore/Amicon)或者分子筛进行再度离心，该分子筛所具有的孔大小在优选的情况下为大约5到70kDa，更为优选的情况下为大约10到30kDa。该上清液可首先通过一个较大的滤器，典型的情况下约70到30kDa。因此，从该较大的滤器的流出液可通过一个较小的滤器，典型的情况下约5到10kDa。本发明的生长因子在典型的情况下透过该较大的滤器(70到30kDa)并且在典型的情况下为该较小的滤器(5到10kDa)所截留，因此本发明的组合物可包括的分子具有的大小为约70到30kDa和约5到10kDa，在优选的情况下为约30kDa到10kDa。
应该注意的是，本发明的一些生长因子可以互相之间进行结合并且由此而形成较大的分子。因此，可从较大滤器的流出物和随后的较小滤器的存留物中获得的本发明的组合物可能包括一些分子，这些分子具有的大小大于该较大滤器的孔径。特别地，在通过上述的滤器对含有本发明的一种或者多种生长因子对上清液进行过滤之后，本发明的组合物可能包括一些分子，这些分子所具有的大小为约50kDa到5kDa，在一些实施方案中为约70kDa到5kDa。
为较小孔径的滤器所存留的溶质可被收集以进一步被用作为浓缩的蛋白，这些蛋白包括本发明的生长因子。如图7中的Western印迹结果所显示，通过该方法，生长因子的浓度，例如12kDa的TGF-β3的浓度，同对照(未浓缩的上清液)相比有所提高。在图7之中，用于对上清液进行过滤的两种滤器所具有的孔大小为10kDa(YK10)和30kDa(YK30)。
在典型的情况下，用于提取和/或浓缩的离心可进行约2到8小时，在优选的情况下约4小时，温度低于约15℃，在优选的情况下约为4℃，离心速度高于约2,000×g，优选的情况下约3,000×g。
在一个备选的实施方案中，一种商业化的生物反应器可被用于收集培养基，对该生长因子进行提取和/或浓缩以形成本发明的组合物。这样的生物反应器已经在题为“Bioreactor with ExpandableSurface Area for Culturing Cell”的临时专利申请中有所描述，该申请的序列号为60/406224，于2002年8月27日提交，其内容在此引为参考。在一个实施方案中，该生物反应器包括一个容器，容器中的一个载体，一个流入口、一个流出口以及一种搅拌机制。该载体可包括一种可扩展的表面积，细胞可在其上进行培养。
在该生物反应器的一个实施方案中，该载体的表面积具有可逆的可扩展性，即，该表面积被扩展并且随后回减至原先的表面积。
在该生物反应器的一个方面中，该可逆的可扩展载体为一种组织培养板，该培养板具有多重可拆的边界，这些边界任选为同心边界，从而在该表面积由于细胞的增殖而变得不理想时通过拆除这些边界使该组织培养板的表面积而有所增加。这些边界的形状可以是任何规则或者不规则的形状，例如，正方形、矩形、三角形、环形、线形或者非线形。
一旦通过上述或者另外的适当方法进行了提取和/或浓缩，该组合物可包括有，一种或者多种以下的生长因子，TGF-β3、BMP-2、PTHrP、OPG、Indian Hedgehog、IgF1以及RANKL，但不限于这些。这些生长因子可被浓缩至任何一种治疗有效的浓度。本文所使用的“治疗有效”指的是一种量，该量有效地使所需组织生长、修复组织中的缺陷以及/或者降低、消除、治疗、防止或者控制本文所描述的同特定组织或者缺陷相关联的症状和状况。
在一个实施方案中，在该浓缩上清液中的一种或者多种生长因子，例如TGF-β3，可以高于约5ng/ml，更为优选的情况下高于约15ng/ml的量存在。在一些实施方案中，这些生长因子为约1ng/ml到15ng/ml，更为优选的情况下为约5ng/ml到15ng/ml。出于进行比较的目的，浓缩之前这些生长因子在该上清液中的浓度可为约1ng/ml或更低，如图8所示。
3.治疗应用在一个实施方案中，本发明的生长因子组合物的应用包括将本发明一种生长因子组合物同受损伤的身体器官、组织或者结构相接触，并且特别地包括将本发明的一种组合物同包括骨、肌腱或者软骨在内的组织相接触，但不限于这些组织。
在另一个实施方案中，生长因子疗法涉及到将本发明的一种组合物同组织缺陷相接触，该组织包括，骨、肌腱或者软骨，但不限于这些。该缺陷可由损伤或者其它创伤以及由衰老所引发的退化所导致。通过本发明的应用，该缺陷的治愈速度可通过在缺陷部位诱导软骨生成、腱生成和/或骨生成速度的提高而有所增强。进一步，该“鸡尾酒”浓缩生长因子对于人类软骨细胞培养物的应用在体外显示出软骨细胞增殖的提高，如图9所示。特别地，对于YK10和YK30滤器存留物，1∶50的存留物稀释液被发现在约48小时后特别有效。
可通过重构设备、骨代用品、骨折固定物以及在多种整形外科条件下对骨、肌腱和软骨再生的诱导而使用本发明的生长因子组合物的。进一步，本发明的生长因子组合物可在一些重构设备以及方法中具有治疗价值，这些设备以及方法用于脊椎、髋、膝、肩、腕、踝和趾以及骨折固定和不愈合骨折的治疗的以及其它的骨、腱和软骨缺陷的治疗。
对于一种或者多种骨软骨缺陷的治疗，本发明的自体生长因子“鸡尾酒”可以同一种支架载体进行部分或者完全地混合，这些载体包括“骨支持物”材料，磷酸钙支架、羟基磷灰石、硫酸钙或者胶原复合物。与其它的传统治疗相比较，该生长因子“鸡尾酒”可以在软骨下区室诱导骨形成，这些其它的传统治疗的例子如德国Leverkusen的Verigen Transplantation Services International所产的MatrixInduced Autologous Chondrocyte Transplantation(MACITM)，该治疗可在软骨下骨上修复软骨缺陷。
对于骨缺陷的治疗，该生长因子“鸡尾酒”可根据上文描述被加载入一种支架并且通过一些技术被植入该缺陷位置，这些技术包括当缺陷位于脊椎之上或其附近时使用的气囊技术，但不限于此。
另外，本发明可同胶原支架相结合用于软骨、骨或者肌腱修复，这包括关节软骨或者回旋肌腱套修复，但不限于这些。
在一个实施方案中，本发明的生长因子组合物可通过生物材料支架进行应用，该生物材料支架的例子如Chondo-Gide(Geislich，Switzerland)、Small Intestine Submucosa(SIS)Membrane(DepuyOrthopaedics)，如美国专利申请No.10/121,449(2002年4月12日提交)中的描述，该文全文在此被引为参考。
包括本发明的组合物在内的其它的产品同样在本发明的范围内，如水泥，包括骨水泥，但不限于此。这样的组合物可具有对于增强骨生成、腱生成和软骨生成的特定用途。
4.剂量治疗所必需的本发明的生长因子组合物的量应取决于多种不同的因素，这些因素包括给药手段、目标位点、该受试者的生理状态以及进行给药的其它的生长因子和/或药物。因此，应调整治疗剂量以优化安全性和有效性。在典型的情况下，体外使用的剂量可为这些试剂的原位给药用量提供有用的指导。用于特定病症的治疗的有效剂量的动物试验将提供人类剂量的进一步预测指标。多种考虑已经有所描述，例如，Gilman et al.(eds)，Goodman and Gilman’sThePharmacological Basis of Therapeutics，8thed.，PergamonPress(1990)；以及Remington’s Pharmaceutical Sciences，7thed.，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.(1985)；此二者均在此全文引为参考。
本发明的生长因子组合物在以每天约0.001mg到约10mg/kg体重的剂量范围进行给药的情况下是有用的。或者，在某些情况下，也可以约0.0001mg到约10mg/kg进行给药。所使用的具体剂量取决于被治疗的特定组织状况、给药途径和/或根据主治医生基于诸如症状严重程度，受试者的年龄和一般状况等等此类的因素而作出的判定。
5.受试者和适应症本文所使用的受试者是任何患有整形外科状况的人，这些状况包括，骨、软骨和/或腱损伤，但不限于这些。
下列实施例的给出是为了阐释本发明。然而，应当了解，本发明并不限于这些实施例所描述的具体的条件或者细节。在整个说明书中，对公开的文件的任何和全部参考被特别引为参考，这些公开的文件包括美国专利，但不限于此。
实施例1-骨代用品同本发明生长因子组合物的组合有效量的本发明的浓缩生长因子可同下文所描述的一种材料在以该材料和生长因子对受试者给药之前进行组合，该组合通过在一种适于该材料的混合器中进行混合而完成。
第一种骨代用品材料包括Biomet Merck制造的Endobon，这是一种特别适用于骨移植代用品的羟基磷灰石陶瓷(HA陶瓷)，BiometMerck的地址为Fruiteninersstraat 23，Postbus 1138，3330 CCZwijndrecht，The Netherlands。该材料来源于生物并且是ostoeconductive。植入时，新骨由于陶瓷的相互连通的孔系统而可直接生长进入该陶瓷。Endobon可被用于对骨折、骨囊肿、关节固定术以及骨肿瘤所造成的骨缺陷进行包封。
第二种骨代用品材料包括同样由Biomet Merck制造的Biohon，这是一种可被再吸收的合成微晶磷酸钙水泥，它在体温之下由于内源热而硬化。该材料可被用于对骨缺陷进行填充或者重构。在将磷酸钙粉末同盐进行适当的混合之后，所产生的糊状物可应用于受试者，并且Biohon可硬化成该骨缺陷的形状。在成型之后，其化学组成和晶体结构可同天然骨的磷酸钙组分表现的基本相同。
实施例2-使用RT-PCR对软骨细胞进行的鉴定对软骨分化的多种标记物进行了RT-PCR，并且使用这些标记物的核苷酸序列开发了一些PCR引物，这些标记物包括胶原I(GenBank编号XM012651)、胶原II(GenBank编号L 10347)、聚集蛋白聚糖(GenBank编号XM083921)、SOX-9(GenBank编号XM039094)、BMP-2(GenBank编号NM001200)、TGF-β-3(GenBank编号NM003239)、Cbfa-1、PTHrP(GenBank编号M57293，M32740)、碱性磷酸酶(GenBank编号XM001826)以及Indian Hedgehog。这些引物和PCR条件分别见表1和表2。
根据制造商(Ambion Inc.，Austin，TX)的指导使用RNAzol溶液从软骨细胞培养物中分离出总RNA。为进行RT-PCR，使用逆转录酶(Promega，Sydney Australia)以一种寡聚-dT引物从2μg总RNA中制备出单链cDNA。将各个cDNA各取两μL用于30个循环的PCR，该PCR使用1.0单位的Taq聚合酶(Promega，Sydney Australia)，含有0.4mMol/L的引物、125Mol/L的dNTP的1×PCR缓冲液以及水，总体积为25μl(见表2)。该扩增在一台DNA热循环仪中进行(Model 2400；Perkin-Elmer)。
特异性的引物序列选自于目的基因的分离外显子，从而避免了基因组DNA信号的污染。使用位于http//genzi.virus.kyoto-u.ac.jp/cgi-bin/primer3.cgi的软件程序对引物进行设计并且使用位于http//www.gensetoligos.com/australia的Genset Oligos(Australia)进行合成(见表1)。作为内部对照，该单链cDNA使用一种管家基因，甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的特异性引物进行PCR扩增。在1.5％的琼脂糖凝胶上对这些PCR产物进行电泳，用溴化乙锭进行染色。
表1
表2方案，1×反应混合物10×PCR缓冲液2.5μldNTP(5mM)2.0μl有义引物(约15-25μM) 0.5μl(终浓度为0.3-0.5μM)反义引物(约15-25μM) 0.5μl双蒸水 17.0μlDNA聚合酶0.5μlcDNA2.0μl总计 25.0μl
所使用的循环条件
实施例3-使用Western印迹分析进行的软骨细胞鉴定包括II型胶原、聚集蛋白聚糖和S-100蛋白以及其它蛋白在内的多种标记物可被用于对培养的软骨细胞使用Western印迹分析进行鉴定。针对这些标记物的抗体可购自，例如，Sigma(St.Louis，MO)、Dako(澳大利亚)以及R&D System(Minneapolis，MN)。
用于软骨细胞的Western印迹分析的材料和方法在此进行详细描述。
通过收集约103-104的培养的软骨细胞并且将之离心成为沉淀而对细胞进行裂解。倒去上清液并将沉淀重悬浮于250μL的NET-gel裂解缓冲液(Quagen Gmbh，Germany)之中并且在冰上温育20分钟。使用微移液吸头将细胞碎片和裂解缓冲液转至一个1.5毫升的EppendorfTM管中并且在4摄氏度下以12000g离心2分钟。将上清液取至新的管中并且对该上清液进行SDS-PAGE凝胶电泳。使用MiniTrans-blot电泳转移槽(Bio-Rad，California，USA)将该凝胶对一个Hybond TMC 0.45μm的硝酸纤维素膜(Amersham，Piscataway，NJ)在30V下进行转移过夜。该转移在转移缓冲液中进行，该缓冲液在2升水中含有7.57克甘氨酸、369克Tris以及400毫升甲醇(Sambrooket al.1989，InMolecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York)。用于Western印迹的标准方案可见，例如，Sambrook et al.(1989，InMolecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork)以及Ausubel et al.(1997，InCurrent Protocol in MolecularBiology，Green & Wiley，New York)，这些均在此引为参考。
变性和复性步骤对浓度为6M、3M、1M和0.4M的四种盐酸胍(G-HCl)溶液进行了制备。表3提供了用于在该步骤中使用的G-HCl溶液制备的细节。
当制备该G-HCl溶液之时，所有的成分应当新鲜制备。将奶粉溶于水中，随后加入至其它成分中从而在该G-HCl中产生终浓度为2％的奶。将该膜在室温下洗涤四次，每次30分钟，6M G-HCl、3M G-HCl、1M G-HCl和0.4M G-HCl各一次。随后在4摄氏度下以加入了2％奶粉的亲和层析(AC)缓冲液洗涤该膜过夜。
AC缓冲液如下制备50mL甘油(最终为10％的甘油)10mL 5M的NaCl(最终为100mM NaCl)10mL 1M Tris，pH7.6(最终为20mM Tris)1mL 0.5M EDTA(最终为0.5mM EDTA)5mL 10％的Tween-20(最终为0.1％的Tween-20)置于冰上表3用于变性/复性步骤的盐酸胍溶液
洗涤和封闭步骤随后使用1×TBS-Tween洗涤该膜两次，每次5分钟，随后使用AC缓冲液洗涤5分钟。随后在室温下以封闭溶液对该膜温育一小时，该封闭溶液使用2％的脱脂乳和1×TBS-Tween进行制备，随后使用1×TBS-Tween进行两次洗涤，每次5分钟。
对目的蛋白的探测将探测反应混合物(20 1×TBS-Tween中含有2％脱脂乳、50μL的蛋白探针以及20L 1M DTT)加至该膜并且在4摄氏度下温育2小时，随后在4摄氏度下使用1×TBS-Tween进行两次洗涤，每次5分钟。该蛋白探针为抗目的蛋白的抗体。在本情况下，该蛋白探针为TGF-β-3。随后在4摄氏度下使用10mL含2％脱脂乳的1×TBS-Tween再度进行15分钟的洗涤，随后在4摄氏度下使用1×TBS-Tween进行20分钟的第二次洗涤。
一抗的加入使用一种摇动设备对该膜再洗涤两次，每次5分钟。
制备含有1×TBS-Tween和1％脱脂乳(0.2g)的20mL试管，并且分装成为两个10mL试管以用于一抗和二抗。将1μL抗V5抗体加入该一抗管以获得1/10000的最终抗体稀释度，并且温和地混匀。将该一抗溶液倒入该膜之上并且在摇动设备上在室温下温育2小时。或者，该抗体溶液可在4摄氏度下温育过夜。
二抗的加入在温育之后使用1×TBS-Tween进行三次洗涤，每次5分钟。
将5μL的二抗(抗小鼠IgG-Fab)吸入该二抗溶液中以达到1/2000的二抗稀释度，并温和地混匀。将该二抗溶液倒至该膜之上并且在室温下在摇动设备上温育45分钟。
检测溶液的加入在以二抗溶液进行温育之后，使用1×TBS-Tween进行两次洗涤，每次在摇动设备上进行5分钟。仅仅使用1×TBS再进行两次洗涤，每次在摇动设备上进行5分钟。
检测溶液通过将2mL的Lumigen检测溶液A和50μL的Lumigen检测溶液B(ECL plus，Sydney，Australia)进行混合而制备并且被加之于该膜之上，确保该膜被该检测溶液均匀地覆盖。摇动去除多余的检测溶液并且将该膜封闭于塑料套之中，确保该套中无任何皱褶。将该膜置于胶片架中的一张胶片之上并且进行约30分钟的曝光(曝光时间可变)，随后进行显影。
通过使用上文所述的方法，显示了在培养的软骨细胞中对TGF-bete-2的检测。
实施例4—免疫组织化学和免疫荧光分析同Western印迹分析类似，用于软骨细胞的多种标记物，包括II型胶原、聚集蛋白聚糖和S-100蛋白在内，可被用于通过免疫组织化学和免疫荧光对培养的软骨细胞进行鉴定。这些方法可被直接用于MACI(基质诱导的自体软骨细胞植入物)的软骨细胞。
这些材料和方法在此进行描述。
使用5％的低聚甲醛溶液对MACI膜上的软骨细胞进行固定并且将其用于直接免疫荧光。或者，这些软骨细胞可在固定之后进行石蜡包被。随后在0.2M的Tris缓冲地盐水(TBS)中对这些细胞进行洗涤，并且通过在35％的过氧化氢(H2O2)中进行温育以对内源过氧化物酶进行封闭。随后以20％的正常马血清对这些细胞进行预温育，并且使用一抗进行温育。使用TBS洗涤这些细胞并且使用二抗(该二抗可以是偶联地)进行温育。使用诸如3’3’-二氨基联苯胺这样的用于检测与链亲合素偶联的过氧化物酶的颜色反应检测系统对软骨细胞标记物进行检测。
使用上述方法根据通过免疫荧光的检测而证明了TGF-β-3在培养于胶原膜上的软骨细胞中的表达。
实施例5为使Surgicel根据本发明而被用于防止血管在自体移植的软骨或者软骨细胞内发育，首先使用某种固定剂，例如戊二醛对Surgicel进行处理。简言之，使用0.6％的戊二醛对Surgicel进行1分钟的处理，随后进行多次洗涤以除去戊二醛残余物，否则该残余物可对组织具有毒性。或者，根据实施例2的描述，在以戊二醛进行处理之前使用名为Tisseel的纤维蛋白粘合剂处理Surgicel。据发现，在使用诸如戊二醛这样的固定剂进行固定，以无菌生理盐水(0.9％)进行洗涤并且在冰箱中进行保存的情况下，Surgicel在1到2个月内不会溶解。一般情况下，Surgicel在7到14天的期间内被再吸收。这一时间过于短暂，因为在被植入的软骨细胞生长形成固体软骨层之前，需要较长时间以防止从骨结构到被植入的软骨的血管生成或者血管化。换句话说，需要对血管化进行较长时间地充分抑制，例如，一个月时间。因此，该产品在这一时间之前应不被显著地吸收。或者说，最后才需要再吸收。因此，被用作为抑制性屏障的有机材料应当具有这些能力，并且据发现经如此处理的Surgicel提供了这种功能。
实施例6该Surgicel还使用一种有机胶水进行了包被。在本实施例中，所使用的胶水为Tisseel，但其它胶水也可使用。这种产品同Surgicel一起产生了一种用于本发明的特定目的的可用屏障。可以使用任何其它的止血剂或者血管抑制屏障。Tisseel如下文所描述进行混合。随后通过将Tisseel喷涂于该Surgicel材料的两侧直至浸透而对Surgicel进行包被。随后使该Tisseel(纤维蛋白胶水)在室温下固化。就在固化即将完成之前，该被包被的Surgicel被随即置于0.6％的戊二醛之中一分钟，并且随后使用无菌生理盐水(0.9％)进行洗涤。随后使用PBS和/或NaOH调节pH直至pH稳定于7.2到7.4。此后将由此进行处理的Surgicel在组织培养基中进行洗涤，如，含有15mM Hepes缓冲液的基本必需培养基/F12。
正如本实施例所提及，我们已经使用了Tisseel作为纤维蛋白粘合剂以包被Surgicel。进一步，该纤维蛋白粘合剂或者胶水还可以直接用于朝向骨的伤口的底部，Surgicel在其上被粘合。代替体内测试所使用的体外系统由一种用于细胞研究工作的NUNCLONTMDelta六孔无菌一次性平板(NUNC，InterMed，Rockilde，Denmark)组成。各孔的直径约为4cm。
在本发明中该纤维蛋白粘合剂可以为任何粘合剂，该粘合剂同纤维蛋白成分一起可产生一种为人类所能耐受的胶水(Ihara，N，et al.，Burns Incl.Therm.Inj.，1984，10，396)。本发明预计可使用任何其它可用于代替纤维蛋白粘合剂的胶水成分。在本发明中我们使用了Tisseel或者Tissucol(Immuno AG，Vienna，Austria)。该Tisseel试剂盒由以下成分组成Tisseel，一种冻干的灭活病毒的封闭剂，该封闭剂含有可凝的蛋白质纤维蛋白原、血浆纤连蛋白(CIG)和因子XIII，以及纤溶酶原。
抑肽酶溶液(牛)凝血酶4(牛)凝血酶500(牛)氯化钙溶液该Tisseel试剂盒含有一种DUPLOJECT应用系统。该纤维蛋白粘合剂或者使用了双组分封闭剂的Tisseel试剂盒可按照Immuna AG产品插页的方式进行组合。
实施例7软骨细胞在基本必需培养基中在37℃下的CO2温育箱中进行生长，该培养基中含有HAM F12和15mM的Hepes缓冲液以及5-7.5％的自体血清，并且在位于Verigen Europe A/S，Symbion Science Park，Copenhargen，Denmark的100级实验室中进行操作。其它培养基组成可被用于该软骨细胞的培养。使用胰蛋白酶EDTA对这些细胞进行5到10分钟的消化并且在Burker-Turk室内使用台盼蓝存活力染色进行计数。将细胞计数调整至7.5×105细胞/ml。在该100级实验室中暴露NUNCLONTM平板。
将该Surgicel止血屏障切成匹配该NUNCLONTM组织培养平板中的孔底的适当大小。在这种情况下，在无菌的条件下切出一个大约直径为4cm的圆形(但可为任何可能的大小)并且置于用于细胞研究工作的NUNCLONTMDelta六孔无菌一次性平板(NUNC，InterMed，Rockilde，Denmark)的孔底。置于该孔底部的止血屏障根据实施例1中的描述进行预处理。该处理显著地延缓了Surgicel的吸收。随后在蒸馏水中洗涤该止血屏障数次直至未反应的戊二醛被洗净。含有血清的少量细胞培养基被用于吸收进入该止血屏障，从而保持位于该孔底部的止血屏障的湿润。
将1ml培养基中的约106个细胞直接置于该止血屏障的顶部，散布于该止血屏障的表面，该屏障根据前述经过0.4％的戊二醛的预处理。随后在37℃下的CO2温育箱中将该平板温育60分钟。小心地将2到5ml含5到7.5％的血清的组织培养基加至含有细胞的孔中，同时在排出培养基时通过将微量移液吸头同孔壁相切而避免溅起细胞。该培养基的pH显得过低(pH约为6.8)。随后将该pH调节至7.4到7.5。第二天一些软骨细胞开始在该止血屏障上生长，排列成簇。一些细胞由于在pH调节之前的低pH暴露而死。将该平板温育三到七天，在第三天换培养基。
在温育期末，将该培养基倒出并且冷冻。含有0.1M二甲砷酸的钠盐(亦称为二甲砷酸钠，使用HCl将pH调节至7.4)的2.5％的戊二醛作为固定剂被加入以用于对该细胞和支持物(止血屏障)进行制备以进行电子显微照相。
实施例8软骨细胞在最低必需培养基中在37℃下的CO2温育箱中进行生长，该培养基中含有HAM F12和15mM的Hepes缓冲液以及5-7.5％的自体血清，并且在位于Verigen Europe A/S，Symbion Science Park，Copenhargen，Denmark的100级实验室中进行操作。其它培养基组成可被用于该软骨细胞的培养。使用胰蛋白酶EDTA对这些细胞进行5到10分钟的消化并且在Burker-Turk室内使用台盼蓝存活力染色进行计数。将细胞计数调整至7.5×105细胞/ml。在该100级实验室中暴露NUNCLONTM平板。
根据实施例1的描述，使用0.6％的戊二醛对该Surgicel(用作为止血屏障)进行一分钟的处理，并且以0.9％无菌氯化钠进行洗涤或者在优选的情况使用诸如PBS这样的缓冲液或者诸如MEM/F12这样的培养基进行洗涤，这是因为进行戊二醛处理后的pH为6.8而在优选的情况下应为7.0到7.5。使用DUPLOJECT系统将Tisseel应用于该Surgicel的两侧，由此以纤维蛋白粘合剂将该Surgicel，即，要使用的贴片的两侧均进行了包被。在无菌条件下使该胶水干燥至少3到5分钟。将该“经包被”的止血屏障置于细胞研究工作的NUNCLONTMDelta六孔无菌一次性平板(NUNC，InterMed，Rockilde，Denmark)的孔底。含有血清的少量组织培养基被用于吸收进入该止血屏障。将1ml组织培养基中的约106个细胞直接置于该止血屏障的顶部，散布于该止血屏障的表面。随后在37℃下的CO2温育箱中将该平板温育60分钟。小心地将2到5ml含5到7.5％的血清的组织培养基加至含有细胞的孔中，同时在排出培养基时通过将微量移液吸头同孔壁相切而避免溅起细胞。3到6天之后，显微镜检查显示这些细胞粘附于该Surgicel并且令人满意地在其中生长，这表明Surgicel并未对软骨细胞显示出毒性并且这些软骨细胞令人满意地生长进入该Surgicel。
将该平板温育三到七天，在第三天换培养基。在温育期末，将该培养基倒出并且冷冻。含有0.1M二甲砷酸的钠盐(亦称为二甲砷酸钠，使用HCl将pH调节至7.4)的2.5％的戊二醛作为固定剂被加入以用于对该细胞和支持物(止血屏障)进行制备以进行电子显微照相。
实施例9软骨细胞在基本必需培养基中在37℃下的CO2温育箱中进行生长，该培养基中含有HAM F12和15mM的Hepes缓冲液以及5-7.5％的自体血清，并且在位于Verigen Europe A/S，Symbion Science Park，Copenhargen，Denmark的100级实验室中进行操作。使用胰蛋白酶EDTA对这些细胞进行5到10分钟的消化并且在Burker-Turk室内使用台盼蓝存活力染色进行计数。将细胞计数调整至7.5×105-2×106细胞/ml。在该100级实验室中暴露NUNCLONTM平板。
已经发现Bio-Gide可被用作为一种可再吸收的双层膜，该膜将被用作为覆盖关节缺陷的贴片或者绷带，该关节中被移植入培养的软骨细胞以及止血屏障。Bio-Gide为一种通过标准化的受控制造程序(E.D.Geistlich Sohne AG，CH-6110 Wolhusen)而获得的纯胶原膜。该胶原提取自兽医认证的猪，并且经小心纯化以避免抗原性反应，并且在双隔仓(double blisters)中经过伽马照射灭菌。双层膜具有一个多孔表面和一个致密表面。该膜由I型和III型胶原制成，未经进一步交联或者化学处理。该胶原在24周内被再吸收。该膜甚至在润湿的情况下仍然保持结构的完整性并且可通过缝合线或者固定钉进行固定。该膜还可使用诸如Tisseel这样的纤维蛋白粘合剂同邻近的软骨或者组织进行粘合，该粘合可代替缝合或者与之共用。
在100级实验室中暴露该Bio-Gide并且在无菌条件下置于用于细胞研究工作的NUNCLONTMDelta六孔无菌一次性平板(NUNC，InterMed，Rockilde，Denmark)的孔底，该双层膜的多孔表面或者致密表面均可朝上。将1ml组织培养基中的约106个细胞直接置于该Bio-Gide的顶部，散布于该Bio-Gide的多孔或者致密表面。随后在37℃下的CO2温育箱中将该平板温育60分钟。小心地将2到5ml含5到7.5％的血清的组织培养基加至含有细胞的孔中，同时在排出培养基时通过将微量移液吸头同孔壁相切而避免溅起细胞。
在这些软骨细胞被置于含有Bio-Gide的孔中之后的第二天，在一台尼康反相显微镜下检查这些细胞。一些软骨细胞被注意到已经粘附于该Bio-Gide的边缘。使用该显微镜通过该Bio-Gide本身进行观察当然是不可能的。
将该平板温育3到7天，在第3天换培养基。在温育期末，将该培养基倒出并且冷冻。含有0.1M二甲砷酸的钠盐(亦称为二甲砷酸钠)的2.5％的戊二醛作为固定剂被加入以用于对该细胞和在多孔表面或者致密表面上培养有细胞的Bio-Gide支持物进行制备，使用HCl将pH调节至7.4。该Bio-Gide贴片随即被送至Department ofPathology，Herlev Hospital，Denmark进行电子显微照相。
电子显微照相显示，在该Bio-Gide的致密表面上进行培养的软骨细胞并未生长进入该Bio-Gide的胶原结构，而该Bio-Gide的多孔表面上进行培养的软骨细胞实际上生长进入了该胶原结构并且更进一步还显示出了蛋白聚糖的存在并且没有纤维原细胞结构的迹象。这些结果表明，当该胶原贴片，例如Bio-Gide贴片，被当作覆盖软骨缺陷的贴片进行缝补时，该多孔表面应当面向下对着将受到培养软骨细胞注射的缺陷。这些细胞将能够穿过该胶原，并且产生符合完整表面的光滑的软骨表面，并且在这一区域可建立一层光滑的蛋白聚糖。然而，当该胶原的致密表面朝下面对该缺陷处时，被植入的软骨细胞将不会同该胶原进行融合，并且这些细胞将不会产生与上述相同的光滑表面。
实施例10软骨细胞在基本必需培养基中在37℃下的CO2温育箱中进行生长，该培养基中含有HAM F12和15mM的Hepes缓冲液以及5-7.5％的自体血清，并且在位于Verigen Europe A/S，Symbion Science Park，Copenhargen，Denmark的100级实验室中进行操作。使用胰蛋白酶EDTA对这些细胞进行5到10分钟的消化并且在Burker-Turk室内使用台盼蓝存活力染色进行计数。将细胞计数调整至7.5×105-2×106细胞/ml。在该100级实验室中暴露NUNCLONTM平板。
根据产品插页，被用作为可再吸收双层膜的Bio-Gide还可以同一种有机胶水共同使用，例如Tisseel，其中使用了额外的显著高于Tisseel所含抑肽酶的含量。通过将抑肽酶的含量增加至约25,000KIU/ml，该材料的再吸收将延迟几个星期而非通常的几天跨度。
为在体外对该特征进行测试，该Tisseel应用于NUNCLONTM平板的孔底并且进行不完全的固化。随后将诸如Bio-Gide的胶原贴片用于该Tisseel之上并且粘至该孔底。Bio-Gide和Tisseel的这一组合被设计用作为止血屏障，该屏障将抑制或者阻止血管向软骨细胞移植区域的发育或者浸润。这一杂合胶原贴片现在既可在伤口的底部(最接近待修复的表面)被用作为止血屏障，亦可被用作为软骨形成的支持物，这是因为该远端表面可以是该胶原贴片的多孔侧并且由此而促进了软骨细胞以及软骨基质的浸润。因此，这种杂合胶原贴片也可以被用于覆盖该移植物的顶部，其中该胶原多孔表面向下朝向被植入的软骨细胞并且该屏障形成顶部。具有提高的抑肽酶含量的该杂合胶原贴片也可在无任何诸如Tisseel这样的有机胶水的情况之下使用并且被直接置于该缺陷处，通过自然力进行粘附。因此，该胶原贴片既可被用作为止血屏障，亦可被用作为该修复/移植位点的无细胞覆盖物，其中该贴片的多孔表面朝向该移植软骨细胞/软骨。另一个变例使用了一种胶原贴片，该贴片由II型胶原组成(即，来自于Geistlich Sohne AG，CH-6110 Wolhusen)。
因此，本发明提供了一种杂合贴片，其中该贴片是一种具有提高水平的抑肽酶成分的胶原基质，在优选的情况下约25,000KIU/ml，该胶原基质同一种有机基质胶水联合使用，其中该胶原成分类似于Bio-Gide可再吸收双层材料或者II型胶原，并且该有机胶水类似于Tisseel材料。在另一个实施方案中，该杂合胶原贴片并未使用任何有机胶水以对该修复位置进行粘附。
尽管上文具体描述的仅仅是本发明的特定实施方案，应当认为，在不偏离本发明的精神以及范围的情况下对本发明进行修改或者变化。
权利要求
1.一种组合物，该组合物含有至少一种被提取的生长因子，该生长因子适用于选自骨生成、腱生成、软骨生成以及它们的组合的治疗，其中该生长因子获自培养的软骨细胞并且大小为约70kDa到10kDa，并且该生长因子的浓度为约5ng/ml到15ng/ml。
2.权利要求1的组合物，其中该生长因子为选自TGF-β、BMP、PTHrP、RANKL、IgF1和OPG的一种或者多种生长因子。
3.权利要求1的组合物，其中该生长因子获自软骨细胞的单层培养物。
4.权利要求1的组合物，其中该生长因子以一种治疗有效浓度存在。
5.权利要求1的组合物，该组合物进一步含有一种或者多种材料，该材料选自骨水泥、磷酸钙、硫酸钙、羟基磷灰石以及其它自体生长因子。
6.一种制造生长因子组合物的方法，该方法包括的步骤有提供软骨细胞的单层培养物；以及从该软骨细胞单层培养物中提取至少一种生长因子。
7.权利要求6的方法，该方法进一步包括对该生长因子进行浓缩的步骤。
8.权利要求6的方法，其中该生长因子为选自TGF-β、BMP、PTHrh、RANKL、IgF1和OPG的一种或者多种生长因子。
9.权利要求6的方法，其中对软骨细胞进行培养的步骤包括对自体软骨细胞进行单层培养。
10.权利要求7的方法，其中该生长因子被浓缩至治疗有效浓度。
11.权利要求6的方法，该方法进一步包括将该浓缩的生长因子同一种或者多种材料进行组合的步骤，该材料选自骨水泥、磷酸钙、硫酸钙、羟基磷灰石以及其它自体生长因子。
12.一种治疗骨、肌腱或者软骨缺陷的方法，该方法包括将骨、肌腱或者软骨缺陷同至少一种生长因子进行接触的步骤，其中该生长因子获自培养的软骨细胞。
13.权利要求12的方法，其中该生长因子为选自TGF-β、BMP、PTHrh、RANKL、IgF1和OPG的一种或者多种生长因子。
14.权利要求12的方法，其中该生长因子同一种或者多种材料进行组合，该材料选自骨水泥、磷酸钙、硫酸钙、羟基磷灰石以及其它自体生长因子。
全文摘要
一种组合物，该组合物包括适于骨生成、腱生成或者软骨生成治疗的一种或者多种生长因子，其中该生长因子获自于培养的软骨细胞。
文档编号C12N5/08GK1592635SQ02823309
公开日2005年3月9日 申请日期2002年9月24日 优先权日2001年9月24日
发明者M·H·曾, S·S·阿斯库莱 申请人:维里根股份公司