具有增强的嗜热性和嗜碱性的木聚糖酶的制作方法

专利名称：具有增强的嗜热性和嗜碱性的木聚糖酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及木聚糖酶。更特别地，本发明涉及木聚糖酶及在高温和高pH条件下具有改良性能的修饰的木聚糖酶。
背景技术：
木聚糖酶是具有广泛商业用途的一组酶。木聚糖酶主要应用于造纸业中纸浆的生物漂白中。另外，木聚糖酶在果汁和葡萄酒中用作澄清剂，及在精密仪器和半导体的洗涤中用作酶制剂(例如美国专利No.5,078,802)，而且它们还用于改良家禽和猪饲料的消化性。
在造纸业的纸浆生产中，将纤维性原料在存在化学制品的情况下进行高温和高压处理。这种处理将纤维转化为纸浆，称为制浆。在制浆后，将纸浆漂白。木聚糖酶用于增强对纸浆的漂白作用。木聚糖酶处理使得随后的漂白化学制品如氯，二氧化氯，过氧化氢或者这些化学制品的组合更有效地漂白纸浆。用木聚糖酶对纸浆预处理提高最终纸制品的白度和质量，并减少必须用于漂白纸浆的基于氯的化学制品的数量。这反过来降低了通过这种方法产生的含氯污水。
最重要的化学制浆方法是牛皮纸浆。针对牛皮纸浆，在制浆之后及在用木聚糖酶处理纸浆之前，纸浆处于大约55-70℃及在高碱性pH下(例如Nissen等，1992)。许多可商购的野生型木聚糖酶的缺点是这些酶呈现酸性的最佳pH及大约55℃的最佳温度。因此，为有效利用木聚糖酶进行漂白，纸浆必须酸化为与使用的特异性木聚糖酶的最佳pH相近的pH。另外，热纸浆必须冷却至接近选择的木聚糖酶的酶活性的最佳温度。针对木聚糖酶处理而降低纸浆温度降低了随后化学漂白的效力。酸化纸浆需要使用大量酸。另外，加入酸产生侵蚀，这使加工设备的寿命降低。因此，在接近纸浆条件的温度和pH条件下活性最佳的木聚糖酶在纸浆生产中是有用及有益的。
在较高温度呈现较高活性的木聚糖酶可用于在制浆之后立即处理纸浆，而不需要将纸浆冷却。相似地，在较高pH条件下呈现较高活性的木聚糖酶很少或不需要酸中和纸浆。分离或遗传处理具有这种性质的木聚糖酶为许多工业处理提供了一些有利条件和实际的经济益处。
针对改良用于现有技术领域的纸浆漂白中的木聚糖酶的一些方法包括从在80-100℃生长的极端嗜热生物中分离热稳定的木聚糖酶，所述生物如Caldocellum saccharolyticum，Thermatoga maritima和Thermatoga sp.Strain FJSS-B.1(Luthi等1990；Winterhalter等1995；Simpson等1991)。然而，这些热稳定的木聚糖酶较大，分子量在35-120kDa(320-1100个残基)，并与呈现较好穿透纸浆纤维的其它较小木聚糖酶相比呈现穿透纸浆的能力下降。另外，一些极度嗜热的木聚糖酶，如Caldocellum saccharolyticum木聚糖酶A呈现木聚糖酶和纤维素酶双重活性(Luthi等1990)。这种额外的分解纤维素活性在纸浆漂白中是不需要的，因为其对造纸大批原料，纤维素具有不利作用。另外，在极高温度具有正常功能的超耐热木聚糖酶在最佳纸浆漂白温度范围具有低特异性活性(Simpson等1991)。
许多木聚糖酶通过蛋白质工程已经加以修饰以改良其工业应用性质。例如U.S.5,759,840(Sung等)和U.S.5,866,408(Sung等)揭示了里氏木霉(Trichoderma reesei)木聚糖酶II(TrX)的N末端区域(1-29残基)中的突变。发现在TrX的第10，27和29位残基的三个突变提高了木聚糖酶在提高的温度和碱性pH条件下的酶活性。
U.S.5,405,769(Campbell等)揭示了使用定点诱变修饰环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)木聚糖酶(BcX)以改良酶的热稳定性。位点特异的诱变包括用Cys残基置换两个氨基酸以产生分子内二硫键。另外，突变酶的N末端中特异的残基，也发现进一步改良了酶的热稳定性。在体外分析中，二硫突变物显示在62℃具有热稳定性，比天然BcX木聚糖酶提高7℃。然而，这些热稳定二硫突变物在随后的研究的实验室分析中显示未获得嗜热性(Wakarchuck等，1994)。在BcX木聚糖酶的N末端附近的突变T3G(即在第3位的苏氨酸用Gly置换；BcX木聚糖酶氨基酸编号)，D4Y(F)和N8Y(F)提供了在57℃的热稳定性，比天然BcX提高2℃(U.S.5,405,769)。然而，这些酶在工业中的应用仍需要在预处理后和加入酶之前冷却及酸化纸浆。因此，仍需要进一步提高热稳定性，嗜热性和pH最佳值。
Turnnen等(2001)揭示了在TrX的11，38和162位的突变(N11D，N38E，Q162H)，与二硫键互补相似(S110C/N154C)，来改良木聚糖酶的热稳定性。然而，包括N11D的这些突变对木聚糖酶的嗜热性和嗜碱性也具有不利作用，导致与天然TrX II相比在较高温度和中性-碱性pH值下酶的活性降低。
现有技术领域需要获得新的适于工业应用的木聚糖酶，其在提高的温度和pH条件下呈现提高的酶活性。本发明的目的是克服现有技术领域的缺点。
上述目的通过主权利要求的特征组合而体现，从属权利要求进一步揭示了本发明有利的实施方案。
发明概述本发明涉及木聚糖酶。更特别地，本发明涉及木聚糖酶，及修饰的木聚糖酶，其在高温及高pH条件下具有改良的性能。
本发明涉及一种木聚糖酶，其包含至少一个在选自第11，116，118，144和161位氨基酸的位置上的取代的氨基酸残基，所述位置从修饰的木聚糖酶与SEQ ID NO16所示的里氏木霉木聚糖酶II氨基酸序列的对比中确定。优选地，所述木聚糖酶与相应的天然TrX木聚糖酶相比呈现改良的嗜热性，嗜碱性，更宽的有效pH范围，表达效率或其组合。
本发明还提供了上述木聚糖酶，其中所述木聚糖酶是修饰的木聚糖酶，而且至少一个取代的氨基酸残基在第116位。优选地，取代的氨基酸是Gly。
本发明还包含如上述在第116位修饰的木聚糖酶，而且其进一步包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，在第129位的Glu及在第144位的Arg。
本发明包括如上述在第116位修饰的木聚糖酶，而且其进一步包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，在第129位的Glu及在第144位的Arg。
本发明描述了如上述在第116位修饰的木聚糖酶，并且其进一步包含在第10和105位的His，在第11位的Asp，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，在第129位的Glu及在144和161位的Arg。
本发明还提供了如上述修饰的木聚糖酶，其中至少一个取代的氨基酸残基在第144位。优选所述取代的氨基酸是Arg。
本发明包含如上述在第144位修饰的木聚糖酶，并且其进一步包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala及在第129位的Glu。
本发明还提供了如上述修饰的木聚糖酶，其中至少一个取代的氨基酸在161位。优选所述取代的氨基酸是Arg。
本发明包含如上述在161位修饰的木聚糖酶，并且其进一步包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，在第129位的Glu及在第144位的Arg。
本发明还提供了如上述修饰的木聚糖酶，其中至少一个取代的氨基酸残基在第11位。优选取代的氨基酸是Asp。
本发明包含如上述在第11位修饰的木聚糖酶，并且其进一步包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，在第129位的Glu及在144和161位的Arg。
本发明还提供了如上述修饰的木聚糖酶，其中至少一个取代的氨基酸残基在第118位。优选所述取代的氨基酸是Cys。
本发明还包含如上述在第118位修饰的木聚糖酶，并且其进一步包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，在第129位的Glu及在第144位的Arg。
本发明包括如上述在第118位修饰的木聚糖酶，并且其进一步包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，在第129位的Glu及在第144位的Arg。
本发明描述了如上述在第118位修饰的木聚糖酶，并且其进一步包含在第10和105位的His，在第11位的Asp，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，在第129位的Glu及在144和161位的Arg。
本发明还涉及如上述修饰的木聚糖酶，其中所述修饰的木聚糖酶衍生自家族11木聚糖酶，优选里氏木霉(Trichoderma reesei)木聚糖酶。
本发明涉及一种修饰的木聚糖酶，其包含至少一个取代的氨基酸残基，其中所述修饰的木聚糖酶特征在于最大有效温度(MET)在大约69℃至大约84℃之间，及其中所述修饰的木聚糖酶是得自木霉(Trichoderma sp.)的家族11木聚糖酶。优选的，MET在大约70-大约80℃之间。
本发明还包括一种修饰的木聚糖酶，其包含至少一个取代的氨基酸残基，其中所述修饰的木聚糖酶特征在于最大有效pH(MEP)在大约pH5.8至大约pH8.4之间，及其中所述修饰的木聚糖酶是得自木霉的家族11木聚糖酶。优选的，MEP在大约pH6.0至大约pH8.0之间。
本发明涉及一种修饰的木聚糖酶，其包含至少一个取代的氨基酸残基，其中所述修饰的木聚糖酶特征在于最大有效温度(MET)在大约69℃至大约84℃之间，及最大有效pH(MEP)在大约pH5.8至大约pH8.4之间。优选的，MET在大约70至大约80℃之间，MEP在大约pH6.0至大约pH8.0之间。
本发明还涉及一种修饰的木聚糖酶，其选自由以下组成的一组TrX-HML-75A105H-125A129E-144R；TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R；TrX-116G；TrX-118C；TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R；TrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R；TrX-H-11D-ML-75A105H-125A129E-144R161R；TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R；TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R；和TrX-H-11D-ML-75A105H-116G118C-125A129E-144R161R。
根据本发明，还提供了一种修饰的木聚糖酶，其包含至少一个取代的氨基酸残基，特征在于最大有效温度(MET)在大约69℃至大约84℃之间，其中修饰的木聚糖酶是得自木霉的家族11木聚糖酶。另外，本发明涉及得自木霉的一种修饰的家族11木聚糖酶，特征在于具有大约70至大约80℃之间的MET。本发明还包括得自木霉的一种修饰的家族11木聚糖酶，特征在于具有大约69至大约84℃之间的MET及大约5.8至大约8.4之间的最大有效pH(MEP)。本发明还涉及如上所限定的修饰的木聚糖酶，其中MEP在大约6.0至大约8.0之间。
本发明涉及上述修饰的木聚糖酶在工业中的应用。本发明还包括一种工业处理，其中所述工业处理包括纸浆漂白，精密仪器的加工或者改良家禽和猪饲料的可消化性。
本发明的概述无必要描述本发明的全部必要特征，但本发明也可以是所述特征的亚组合。
附图简述本发明的这些及其它特征通过参考附图的以下描述更加显而易见，其中

图1示出家族11木聚糖酶的氨基酸序列对比。氨基酸编号与里氏木霉木聚糖酶II(Tr2)相比较，如在序列上方所示。在第75和105位的残基(相对于Tr2)以斜体字并用星号标示。与至少75％家族11木聚糖酶共有的氨基酸以黑体字标示。与全部家族11木聚糖酶共有的残基以下划线标示。针对具有纤维素结合结构域的木聚糖酶，只表示催化核心序列。
图2示出TrX木聚糖酶的核苷酸序列(SEQ ID NO39)，和用于在质粒pTrX中构建编码里氏木霉木聚糖酶II(TrX)的序列的合成寡核苷酸。
图3示出与TrX-HML-75A105H-125A129E相比，在pH5.5、30分钟温育期间，温度对修饰的木聚糖酶TrX-HML-75A105H-125A129E-144R的酶活性的作用。数据相对在40℃观测到的活性进行标准化。
图4示出与天然TrX相比，在pH5.0、30分钟温育期间，温度对修饰的木聚糖酶TrX-116G和TrX-118C的酶活性的作用。数据相对在40℃观测到的活性进行标准化。
图5示出与天然TrX，TrX-HML，TrX-HML-75A105H-125A129E和TrX-HML-75A105H-125A129E-144R相比，在pH5.5、30分钟温育期间，温度对修饰的木聚糖酶TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R和TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R的酶活性的作用。数据相对在40℃观测到的活性进行标准化。
图6示出与TrX-HML-75A105H-125A129E-144R相比，在pH6.0、30分钟温育期间，温度对修饰的木聚糖酶TrX-H-11D-ML-75A105H-116G118C-125A129E-144R161R，TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R，TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R，TrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R和TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R的酶活性的作用。数据相对在40℃观测到的活性进行标准化。
图7示出与TrX-HML-75A105H-125A129E-144R相比，在pH6.0、30分钟温育期间，温度对修饰的木聚糖酶TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R和TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R，TrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R和TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R的酶活性的作用。数据相对每种酶的最大活性进行标准化。
图8示出与TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R相比，在pH6.0、30分钟温育期间，温度对修饰的木聚糖酶TrX-H-11D-ML-75A105H-125A129E-144R161R的酶活性的作用。数据相对在40℃观测到的活性进行标准化。
图9示出与TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R和TrX-HML-75A105H-125A129E相比，在pH5.0-8.0、65℃、30分钟温育期间，修饰的木聚糖酶TrX-H-11D-ML-75A105H-116G118C-125A129E-144R161R，TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R，TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R和TrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R的pH/活性概况。数据标准化为每种酶呈现最佳活性的pH。
图10示出与天然TrX相比，在pH4.5-7.0、50℃、30分钟温育期间，修饰的木聚糖酶TrX-116G和TrX-118C的pH/活性概况。数据标准化为每种酶呈现最佳活性的pH。
图11示出本发明一些修饰的酶的最大有效温度(MET)和最大有效pH(MEP)值。MET和MEP分别是木聚糖酶呈现其至少80％的最佳活性(使用可溶的桦木木聚糖作为底物；详见分析方法)时的最高的温度和pH。这些数据点得自在图3-10中呈现的数据。
优选实施方案的描述本发明涉及木聚糖酶。更特别地，本发明涉及木聚糖酶及修饰的木聚糖酶，其在高温和高pH条件下具有改良的性能。
以下描述是优选的实施方案，只是例证了本发明而不限制进行本发明必备的特征组合。
木聚糖酶漂白纸浆的机制还未完全明了。已有观点认为有色的木质素通过木聚糖与晶体状纤维素相连接，木聚糖酶通过水解木聚糖而促进纸浆漂白，释放纸浆中的有色木质素。在此所描述的木聚糖酶和修饰的木聚糖酶可用于漂白纸浆或者用于需要在高于野生型酶的温度和pH之上时具有活性的其它应用。针对生物漂白纸浆，优选的木聚糖酶衍生自家族11木聚糖酶(见表1)，然而，在此所揭示的修饰不需要仅限于家族11木聚糖酶，还可包括其它木聚糖酶。另外，在此所描述的修饰可见于天然木聚糖酶蛋白质中，这些天然木聚糖酶可呈现如在此所述希望的特征，并包括在本发明内。
家族11木聚糖酶是一组分子量相对较低的小型酶(大约20kDa，及大约200个氨基酸残基)。家族11木聚糖酶的小尺寸使其可以迅速穿透纸浆。另外，家族11木聚糖酶没有纤维素酶活性。
本发明的一方面涉及得自木霉的修饰的家族11木聚糖酶，其包含至少一个取代的氨基酸残基，特征在于具有在大约69℃至大约84℃之间的最大有效温度(MET，见以下解释)。优选地，所述修饰的木聚糖酶特征在于具有在大约70℃至大约80℃之间的MET。本发明还包括修饰的木聚糖酶，其包含至少一个取代的氨基酸残基，特征在于具有在大约5.8至大约8.4之间的最大有效pH(MEP，见以下解释)。优选地，所述MEP在大约6.0至大约8.0之间。
本发明还涉及得自木霉的一种修饰的木聚糖酶，其包含至少一个取代的氨基酸，特征在于具有在大约69℃至大约84℃之间的最大有效温度(MET)，及在大约5.8至大约8.4之间的最大有效pH(MEP)。优选地，MET在大约70℃至大约80℃之间，而且MEP在大约6.0至大约8.0之间。
本发明还涉及一种天然家族11木聚糖酶，特征在于具有在大约69℃至大约84℃之间的最大有效温度(MET)，及在大约5.8至大约8.4之间的最大有效pH(MEP)。优选MET在大约70℃至大约80℃之间，MEP在大约6.0至大约8.0之间。
“最大有效温度”或者“MET”是指木聚糖酶呈现其至少80％的最佳活性的最高温度。这个试验典型地使用可溶的桦木木聚糖作为底物，在pH5.5或6.0进行30分钟。用于研究修饰的木聚糖酶性质的分析结果示于图3至图8，其包括在pH5.5或6.0孵育30分钟。从图3至图8中确定的本发明一些酶的MET概况示于图11。实验证明木聚糖酶的MET针对不同的底物而不同。因此可知使用不同的底物，将获得不同的MET值(数据未示出)。为评价本发明的木聚糖酶，使用可溶的桦木木聚糖底物(见实施例3)。
“最大有效pH“或”MEP”是指木聚糖酶呈现其至少80％的最佳活性的最高pH。这个试验使用可溶的桦木木聚糖作为底物，在65℃进行30分钟。用于研究修饰的木聚糖酶性质的分析结果示于图9和10，其包括在65℃进行30分钟孵育。本发明的一些酶的MEP概况示于图11。实验证明木聚糖酶的MEP针对不同的底物而不同。例如，对从软木或硬木中制备的牛皮纸浆，观测到MEP为9.2(数据未示出)。因此可知用不同的底物，将获得不同的MEP值。为评价本发明的木聚糖酶，使用可溶的桦木木聚糖底物(见实施例4)。
表1家族11木聚糖酶微生物木聚糖酶SEQ ID NO

家族11木聚糖酶共有广泛的氨基酸序列相似性(图1)。对一些家族11木聚糖酶的结构研究表明源自细菌和真菌的家族11木聚糖酶呈现相同的一般分子结构(U.S.5,405,769；Arase等1993)。另外，迄今鉴别的大多数家族11木聚糖酶呈现三种类型的二级结构，包括β折叠，转角和一个单一α螺旋。里氏木霉木聚糖酶II的螺旋包含了从151位至162位氨基酸的区域(Torronen等1995)。
一种木聚糖酶如果包含与其它家族11木聚糖酶共有的氨基酸，包括可作为催化残基的两个谷氨酸(E)残基，则将其分类为家族11木聚糖酶。所述谷氨酸残基位于86和177位(见图1，基于Tr2(里氏木霉木聚糖酶II)氨基酸编号)。
迄今鉴别的大多数家族11木聚糖酶是嗜中温的并具有低分子量(20kDa)。然而，这个家族还包括至少两种较高分子量的热稳定木聚糖酶296个氨基酸及分子量为大约32kDa的褐色高温单孢菌木聚糖酶A(TfX-A)(Irwin等，1994；Wilson等1994，WO95/12668)和511个氨基酸及分子量为大约56kDa的粪堆梭菌木聚糖酶A。粪堆梭菌木聚糖酶A在70℃呈现最大活性(Sakka等，1993)。
大型热稳定家族11木聚糖酶由于在酶的延伸的C末端具有一个疏水性纤维素结合结构域(CBD)而与小型嗜中温酶不同。TfX-A酶由与家族11木聚糖酶共有的189个残基的催化核心序列及107个残基的纤维素结合结构域组成。较大的粪堆梭菌木聚糖酶A有2个拷贝的纤维素结合结构域。
本发明中使用位点定向诱变以在木聚糖酶中产生突变，使所述酶与天然酶相比更嗜热及嗜碱。优选地，突变的木聚糖酶衍生自家族11木聚糖酶。更优选地，本发明的突变的木聚糖酶包含一种突变的里氏木霉木聚糖酶II。
因此，认为在本发明范围内，木聚糖酶包括家族11木聚糖酶例如但不限于里氏木霉木聚糖酶II，里氏木霉木聚糖酶I，Trichodermaviride木聚糖酶，浅青紫链霉菌木聚糖酶B和浅青紫链霉菌Streptomyces lividans木聚糖酶C可以使用在此所述的一般方法和方法学进行修饰。还认为在本发明范围内，非家族11木聚糖酶也可以使用在此所述的一般原理进行修饰以获得呈现嗜热和嗜碱性的木聚糖酶。
术语“嗜热性”是指一种酶当所有其它条件均保持恒定时与另一种酶相比，在较高温度是有活性的或者更有活性。例如，如果使用相同底物，在相同条件下，木聚糖酶1与木聚糖酶2相比在较高温度能或者更有活性的水解木聚糖，则与木聚糖酶2相比木聚糖酶1呈现升高的嗜热性。由于大多数木聚糖酶当水解纯木聚糖而不是纸浆时在较高温度是有效的，因此应使用相同底物进行对比分析。在此提及的定量测定嗜热性除非特别说明均使用纯木聚糖底物。
“热稳定性”是指酶在高温，典型的在无底物时的条件下贮存或温育，然后当恢复到标准分析条件时呈现活性的能力。例如，在一定温度(典型的为较高温度)，例如但不限于70℃下保持24小时后，随后在较低温度进行分析，如果木聚糖酶1比木聚糖酶2保留了更大的活性，则称木聚糖酶1比木聚糖酶2展示更高的热稳定性。与嗜热性相反，热稳定性是关于在没有底物的情况下孵育后保留的酶活性。
这两个术语(嗜热性和热稳定性)的这些应用在现有技术领域内经常混用，因为它们被交替使用。然而，在此所述术语的应用与在本技术领域内该术语的用法一致(Mathrani和Ahring，1992)。
“嗜碱性”是指一种酶当所有其它条件均保持恒定时与另一种酶相比，在较高pH时是有活性的或者更有活性。例如，如果木聚糖酶1比木聚糖酶2在较高pH下能水解木聚糖，则木聚糖酶1比比木聚糖酶2具有更高的嗜碱性。典型的嗜碱性是关于在存在木聚糖底物的情况下的酶活性。
“更宽的有效pH范围”是指一种酶当所有其它条件均保持恒定时，与另一种酶的活性相比，在较高pH，较低pH或较高和较低pH时均是有活性的或者更有活性的。例如，但不限于，如果木聚糖酶1在pH5.5-8.0能以接近最佳(80％)活性水解木聚糖，而木聚糖酶2只在pH5.5-7.5的较窄范围内保持80％最佳活性，则木聚糖酶1比木聚糖酶2呈现更宽的有效pH范围。
“TrX编号”是指与基于TrX(XynII-表1；Tr2-图1，SEQ ID NO16)氨基酸序列的氨基酸位置相关的编号。如以下所示及如图1所示，家族11木聚糖酶呈现很大程度的序列相似性。因此，通过对比氨基酸以使木聚糖酶之间序列相似性最佳化及通过使用TrX的氨基酸编号作为编号基础，其它木聚糖酶内氨基酸位置可以相对于TrX而确定。
“表达效率”是指生产宿主产生活性酶或酶促活性的适宜性或便利性，其典型地计算为当所有发酵条件保持恒定时，每单位体积的发酵培养物产生的活性酶或酶促活性的数量。例如但不限于，如果在单位体积的培养物中由相同宿主产生的木聚糖酶1是木聚糖酶2的3倍，则木聚糖酶1比木聚糖酶2具有改良的表达效率。这种宿主的一个非限制性实例是大肠杆菌。
修饰的木聚糖酶是指使用本领域技术人员已知的技术改变木聚糖酶分子。这些方法包括但不限于，位点定向诱变，盒式诱变，随机诱变，合成寡核苷酸构建，克隆及其它遗传工程方法。
如在此更详细的描述，已经制备了一些突变木聚糖酶，当与天然木聚糖酶对比时，它们呈现更高的嗜热性，嗜碱性和热稳定性。表2列出了一些突变体，但这些突变体是非限制性的。
另外，本发明涉及一种修饰的家族11木聚糖酶，例如但不限于得自木霉的一种木聚糖酶，其包含至少一个取代的氨基酸残基，特征在于具有在大约69℃至大约84℃之间的最大有效温度(MET)。优选地，所述修饰的木聚糖酶特征在于具有大约70℃至大约80℃的MET。本发明还涉及一种修饰的木聚糖酶，例如但不限于得自木霉的一种木聚糖酶，其包含至少一个取代的氨基酸，特征在于具有在大约5.8至大约8.4之间的最大有效pH(MEP)。优选地，MEP在大约6.0至大约8.0之间。本发明还涉及一种修饰的木聚糖酶，例如但不限于得自木霉的一种木聚糖酶，其包含至少一个取代的氨基酸，特征在于具有在大约69℃至大约84℃之间的最大有效温度(MET)，，及在大约5.8至大约8.4之间的最大有效pH(MEP)。优选地，MET在大约70℃至大约84℃之间，MEP在大约6.0至大约8.0之间。
另外，本发明还涉及一种天然家族11木聚糖酶，特征在于具有在大约69℃至大约84℃之间的最大有效温度(MET)，及在大约5.8至大约8.4之间的最大有效pH(MEP)。优选地，MET在大约70℃至大约80℃之间，MEP在大约6.0至大约8.0之间。
测定木聚糖酶的MET和MEP可如下进行i)如实施例3所述测定木聚糖酶的温度分布图。测定发挥至少80％最佳(最大)活性的温度，最高温度为MET；ii)如实施例4所述测定木聚糖酶的pH分布图。测定发挥至少80％最佳(最大)活性的pH，最高pH为MEP。
然后将这些数据绘图，如图11所示。
表2修饰的木聚糖酶木聚糖酶描述

与天然木聚糖酶相比，在第11，116，118，144或161位的取代不明显改变木聚糖酶的比活性(见表4，实施例2-3)。
改良木聚糖酶的表达效率均携带N11D突变的突变体木聚糖酶TrX-H-11D-ML-75A105H-125A 129E-144R161R，(TrX-H-11D-ML-AHAE-RR)；TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R(TrX H11D-ML-AHGAE-RR)；和TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R(TrX H11D-ML-AHCAE-RR)，已经被持续表达，而且与其不具有这种突变的前体相比产生出大约2.5到4.3倍的蛋白质(见表5，实施例2-4)。这些结果提示这种突变改良了木聚糖酶的生产产量，这在工业规模的任何生产中均是一个重要因素。木聚糖酶表达效率的这种改良不用降低木聚糖酶的嗜热性和嗜碱性就可达到。
提高木聚糖酶的嗜热性与没有这种突变的前体木聚糖酶TrX-HML-75A105H-125A129E相比，在第144位突变为Arg改良了突变的木聚糖酶TrX-HML-75A105H-125A129E-144R(TrX-HML-AHAE-R)在较高温度水解木聚糖的酶活性(图3)。因此，本发明提供了一种天然或修饰的木聚糖酶，其包含一个碱性氨基酸，例如但不限于在第144位的Arg。优选地，在第144位具有碱性氨基酸的天然或修饰的木聚糖酶具有在大约69℃至大约84℃之间的MET。
分别在第116和第118位突变为Gly和Cys的两种突变也表明木聚糖酶在高温下的改良活性。与天然TrX相比，单一点突变体TrX-116G和TrX-118C在较高的温度呈现更高的活性(图4)，最佳温度为55℃，而天然TrX为50℃。
当与前体木聚糖酶TrX-HML-75A105H-125A129E-144R(TrX-HML-AHAE-R)在pH5.5(见图5，116G突变体)和pH6.0(图6和7)相比时，在TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R(TrX-HML-AHGAE-R)，和TrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R(TrX-HML-AHCAE-R)中也观测到通过这两种突变(第116和118位分别突变为Gly和Cys)嗜热性同样增强。
未曾期望在第116位突变为小的非极性残基可以改良嗜热性，因为大多数天然木聚糖酶包括嗜热木聚糖酶(例如Tf，Tl，Cs，图1)在该位置具有荷负电的氨基酸，天冬氨酸(D，66％，图1)和谷氨酸(E，10％，图1)，或者极性无电荷的氨基酸谷氨酰胺(Q，15％，图1)。未知木聚糖酶在第116位具有Gly。因此，本发明还涉及一种天然或修饰的木聚糖酶，其在第116位包含一个非极性氨基酸，例如但不限于Gly。优选地，在第116位具有非极性氨基酸的天然或修饰的木聚糖酶呈现在大约69℃至大约84℃之间的MET。
基于在第118位突变为半胱氨酸而改良嗜热性也是未曾期望的，因为大多数木聚糖酶包括嗜热木聚糖酶(Tf，Tl，Cs，图1)具有酪氨酸(Y，60％，图1)和色氨酸(W，10％，图1)。在第118位具有半胱氨酸的唯一木聚糖酶是嗜中温黑曲霉，Aspergillus kawakii和Aspergillustubigensis其中之一(图1)，这些木聚糖酶的最佳温度是大约45-55℃(Sunna和Antranikian，1997)。因此，本发明还涉及一种修饰的木聚糖酶，其在第118位包含一个非芳香族的疏水性氨基酸，例如但不限于Cys，本发明还涉及一种天然木聚糖酶，其在第118位包含一个非芳香族的疏水性氨基酸，提供了该天然木聚糖酶呈现在大约69℃至大约84℃之间的MET。
在第11位突变为Asp的另一种突变对木聚糖酶的嗜热性也有益。与前体TrX-HML-75A105H-125A129E-144(TrX-HML-AHAE；图8)相比，突变体TrX-H-11D-ML-75A105H-125A129E-144R161R(Trx-H11D-ML-AHAE-RR)在较高温度呈现更高的活性。这个结果也是未曾期望的，因为(Turenen等(2001))报道相同的N11D突变使含有分子内二硫键的TrX突变体的温度最佳值和范围降低。另外，US 5,759,840揭示了11D突变对TrX-H-11D-ML(称为NI-TX12的突变体)的嗜热性没有作用。因此，本发明还涉及一种天然的或修饰的木聚糖酶，其在第118位包含一个酸性氨基酸，例如但不限于Asp，提供了天然或修饰的木聚糖酶呈现在大约69℃至大约84℃之间的MET。
另外，可以组合上述鉴别的突变以产生甚至在更高pH范围具有更高嗜热性的突变体木聚糖酶。基于三突变N11 D/D 116G/144R或N11D/Y118C/144R的组合突变木聚糖酶即TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R(TrX-H11D-ML-AHGAE-RR)；和TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R(Trx-H11D-ML-AHCAE RR)，在pH5.5(图5，只有116G突变体)和pH6.0(图6和7)，在70-75℃的较高温度呈现最大酶活性，而且进一步示出在80℃呈现明显的酶活性。这些结果提示具有N11D和H144R的D116G或Y118C突变对突变体木聚糖酶的嗜热性作用是互补的。因此，本发明涉及一种天然或修饰的木聚糖酶，其在第11位包含一个酸性氨基酸，在第116位包含一个非极性氨基酸，及在第144位包含一个碱性氨基酸，例如但不限于N11D/D116G/144R，或者在第11位包含一个酸性氨基酸，在第118位包含一个非芳香族的疏水性氨基酸，和在第114位包含一个碱性氨基酸，例如但不限于N11D/Y118C/144R。优选所述天然或修饰的木聚糖酶呈现大约69℃至大约84℃的MET，所述天然或修饰的木聚糖酶包含在第11位的一个酸性氨基酸，在第116位的一个非极性氨基酸，和在第144位的一个碱性氨基酸，或者所述木聚糖酶包含在第11位的一个酸性氨基酸，在第118位的一个非芳香族的疏水性氨基酸，和在第114位的一个碱性氨基酸。
除了实现在较高温度下最佳活性，基于本发明的突变体木聚糖酶，例如TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R(TrX-H11D-ML-AHGAE-RR)；和TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R(TrX-H11D-ML-AHCAE-RR)，(图5和6)，也证明了在它们温度最佳值时具有更高的酶活性(检测到更多的木糖释放)。TrX-H11D-ML-AHGAE-RR和TrX-H11D-ML-AHCAE-RR在它们的温度最佳值时的活性是在40℃观测到的活性的600％。这与前体比较，修饰的木聚糖酶TrX-HML-75A105H-125A129E其在温度最佳值时呈现相对于40℃的活性的大约400％的活性，和天然TrX(在最佳温度时，它的活性是40℃的活性的150％)。
本发明因此包括修饰的木聚糖酶，其包含在第第10和105位的His，第27位的Met，第29位的Leu，第75和125位的Ala，第129位的Glu，和至少一个第11位的酸性氨基酸；第16位的小的非极性氨基酸；第18位的中等大小的非芳香族的疏水氨基酸；和第144位的碱性氨基酸优选地，在第11位的氨基酸是Asp(D)，在第116位的氨基酸是Gly(G)，在第118位的氨基酸是Cys(C)，在第144位的氨基酸选自Lys(L)和Arg(R)组成的组中。
提高木聚糖酶的嗜碱性在Q161R突变形成的突变体木聚糖酶TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R(TrX-HML-AHAE-RR)中，pH条件对酶活性的作用示于图9。与其前体TrX-HML-75A105H-125A129E和TrX-HML-75A105H-125A129E-144R(未示出)相对比。后者这些酶具有相同pH/活性分布图，然而突变体木聚糖酶TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R(TrX-HML-AHAE-RR)在大约6.5至大约8.0的更高pH范围内呈现更大的活性。当与没有这个突变的前体对比时，TrX-HML-AHAE-RR在大约5.0至大约6.0的较低pH值时呈现较低的活性。因此，本发明涉及一种天然或修饰的木聚糖酶，其包含在161位的一个碱性氨基酸，例如但不限于Arg。优选地，在161位具有碱性氨基酸的天然或修饰的木聚糖酶呈现在大约5.8至大约8.4之间的MEP。
第116和118位分别突变为Gly和Cys的突变还改良了在较高pH范围时酶的活性。与天然TrX相比，单突变体TrX-116G和TrX-118C在较高pH时具有更高的活性，如图10所示。
未曾期望第116位突变为小型非极性残基可以改良嗜碱性，因为没有天然的木聚糖酶在第116位具有Gly。因此，本发明提供了一种天然或修饰的木聚糖酶，其在第116位包含一个非极性氨基酸，例如但不限于Gly。优选地，在第116位具有非极性氨基酸的天然或修饰的木聚糖酶呈现在大约5.8至大约8.4之间的MEP。
基于在第118位突变为半胱氨酸而改良嗜热性也是未曾期望的，因为大多数木聚糖酶包括嗜碱性木聚糖酶(例如Tf，Bp，见图1)具有一个酪氨酸(Y，60％，图1)和色氨酸(W，10％，图1)。在第118位具有半胱氨酸的唯一木聚糖酶是嗜酸性黑曲霉，Aspergillus kawakii和Aspergillus tubigensis其中之一(图1)，这些木聚糖酶的最佳pH为大约2-4(Sunna和Antranikian，1997；Kinoshita等1995)。因此，本发明包含一种天然或修饰的木聚糖酶，其在第118位包含一个非芳香族的疏水性氨基酸，例如但不限于Cys。优选地，在第118位具有非芳香族的疏水性氨基酸的天然或修饰的木聚糖酶呈现在大约5.8至大约8.4之间的MEP。
当与前体木聚糖酶TrX-HML-75A105H-125A129E-144R和TrX-HML-75A105H-125A129E相比时，在以下通过D116G和Y118C突变产生的突变体中也观测到木聚糖酶嗜碱性的增强作用TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R(TrX-HML-AHGAE-R)和TrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R(TrX-HML-AHCAE-R)(图9)。尽管这两种突变体在大约6.5至大约8.0的pH范围均表现较高活性，只有突变体TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R(TrX-HML-AHGAE-R)在大约5.0至大约6.0的较低pH范围基本保持最佳活性。在大约5.0至大约8.0的pH范围保持高活性表明在第116位的这个突变使最佳pH范围扩大。
已经将上述鉴别的突变组合以产生具有更高嗜碱性和嗜热性的突变体木聚糖酶。基于四重突变N11D/D116G/H144R/Q161R或N11D/Y118C/144R/Q161R的组合突变体木聚糖酶，即TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R(TrX-H11D-ML-AHGAE-RR；图9)；和TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R(TrX-H11D-ML-AHCAE-RR；未示出)，与其前体相比，在大约5.0至大约7.0的pH下呈现接近最大酶活性的活性。另外，存在D116G突变有助于在大约5.0至大约6.0的较低pH范围基本保持最大活性，因此避免在前体TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R中观测到的在低pH时明显丧失活性(图9)。这个结果进一步证实在第116位的这个突变使最佳pH范围加大。因此，本发明涉及一种天然或修饰的木聚糖酶，其在第11位包含一个酸性氨基酸，在第116位包含一个非极性氨基酸，及在第114位包含一个碱性氨基酸，例如但不限于N11D/D116G/144R，或者在第11位包含一个酸性氨基酸，在第118位包含一个非芳香族的疏水性氨基酸，及在第114位包含一个碱性氨基酸，例如但不限于N11D/Y118C/144R。优选地，天然或修饰的木聚糖酶具有在大约5.8至大约8.4之间的MEP，所述木聚糖酶在第11位包含一个酸性氨基酸，在第116位包含一个非极性氨基酸，及在第114位包含一个碱性氨基酸，或者木聚糖酶在第11位包含一个酸性氨基酸，在第118位包含一个非芳香族的疏水性氨基酸，及在第114位包含一个碱性氨基酸。
本发明还提供了一种修饰的木聚糖酶，其包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，在第129位的Glu，及至少一个·在第11位的一个酸性氨基酸；·在第116位的一个小型非极性氨基酸；·在第118位的一个中等大小的非芳香族的疏水性氨基酸；·在第161位的一个碱性氨基酸。
优选地，在第11位的氨基酸是Asp，在第116位的氨基酸是Gly，在第118位的氨基酸是Cys，在161位的氨基酸选自Lys和Arg。
总而言之，改良的嗜碱性突变体TrX木聚糖酶可如下构建i)将第116位的Asp突变为小型非极性残基，例如但不限于Gly；ii)将第118位的Tyr突变为中等大小的非芳香族的疏水性残基，例如但不限于Cys；iii)将第161位的Gln突变为碱性氨基酸Arg或Lys；iv)将i)中所描述的突变与ii)至iii)中所述突变组合，以改良嗜热性和嗜碱性；或者v)将i)至iv)所述突变与上述HML系列突变(见U.S.5,759,840所述，在此针对HML突变并入参考)组合。
以上描述不以任何形式限制要求保护的本发明，另外所论述的特征组合不是发明方案所绝对必需的。
实施例本发明通过以下实施例得以进一步阐明。然而，应理解这些实施例只是为了阐明本发明，而无以任何方式限制本发明范围之意。
实施例1构建里氏木霉突变体木聚糖酶根据本领域技术人员熟知的充分建立的方案进行基本重组DNA方法，如质粒制备，限制酶消化，聚合酶链式反应，寡核苷酸磷酸化，连接，转化和DNA杂交(例如Sung等，1986)，或者如酶或试剂盒的生产者所推荐的方法进行。针对许多酶的缓冲液已经作为试剂盒的一部分而提供或者根据生产者的指导而生产。限制酶，T4多核苷酸激酶和T4 DNA连接酶购自New England BioLabs Ltd，Mississauga，Ont。GeneAmp PCR试剂试剂盒购自Perkin-Elmer。前体质粒pXYbc，其是具有插入的Bacillus circulans木聚糖酶基因的一种pUC类型质粒，已经预先制备及公布(Sung等，1993；Campbell等，U.S.专利号5,405,769)。一种常用的大肠杆菌菌株HB101(Clonetech Lab，Palo Alto，CA)用作所有基因构建体的转化和表达宿主。桦木木聚糖和RemazolBrilliant Blue R-D-木聚糖购自Sigma(St.Louis，Mo)。羟基苯甲酸酰肼(HBAH)购自Aldrich。寡核苷酸用APPLIED BIOSYSTEM DNA合成仪(380B型)制备。所有木聚糖酶分析均在有盖的循环水浴中进行(Haake型F 4391)并保持在±0.1℃的温度范围内。
1-1构建携带合成的TrX(SEQ ID NO39)的前体质粒pTrX以下揭示的用于突变的前体质粒pTrX已经被预先公布(Sung等，1995)。这个质粒衍生自具有编码里氏木霉木聚糖酶(TrX，图2)的合成核苷酸序列的pUC119质粒。这个木聚糖酶及随后所述的其它突变木聚糖酶的表达均在pUC质粒的lacZ启动子的控制之下。木霉木聚糖酶基因的完全装配需要两个阶段，初始为(92-190；Tr2编号)区域，随后为(1-92；Tr2编号)区域。构建这个基因的方案是常规进行的，与针对许多其它基因公布的标准方法相同。所述方案需要酶促磷酸化编码木聚糖酶的重叠的合成的寡核苷酸。然后连接入适当切割的质粒中。
为构建TrX(92-190)，模拟大肠杆菌密码子使用频率设计以下10个重叠的寡核苷酸(见图2)XyTv-101，SEQ ID NO29；
XyTv-102，SEQ ID NO30；TrX-103，SEQ ID NO31；XyTv-104，SEQ ID NO32；XyTv-105，-SEQ ID NO33；XyTv-106，SEQ ID NO38；XyTv-107，SEQ ID NO37；TrX-108，SEQ ID NO36；XyTv-109，SEQ ID NO35；和XyTv-110，SEQ ID NO34。
两个末端寡核苷酸的SalI和BglII粘性末端使得所述10个片段能酶促连接入线性化的质粒pXYbc中。将编码木霉木聚糖酶的TrX(92-190)区域的10个寡核苷酸(每种50pmol，1μL)在混合物中磷酸化，所述混合物含有10×标准激酶缓冲液(0.4μL)，1mM ATP(4μL)，T4 DNA激酶(5单位)和水(3μL)。磷酸化反应在37℃进行1小时。然后将溶液组合并加热至70℃进行10分钟。在缓慢冷却至室温后，将组合的溶液加入混合物中，在12℃孵育20小时，所述混合物含有4mM ATP(3.5μL)，EcoR1-HindIII线性化质粒pUC119(0.1pmol)和T4 DNA连接酶(3.5μL)。将连接混合物的等份的用于转化在含有氨苄青霉素(100mg/L)的YT平板(于1L水中含有8g酵母提取物，5g细菌用胰蛋白胨，5g NaCl，15g琼脂)上的大肠杆菌HB101。
为制备杂交探针，将寡核苷酸之一，例如XyTv-110(10pmol，1μL)使用T4 DNA激酶(1μL)，10×激酶缓冲液(1μL)和水(4μL)在37℃用32P-ATP(10pmol，3μL)磷酸化1小时。
随机选择转化体以进行杂交分析。将菌落在具有氨苄青霉素的YT平板上生长过夜，并移至尼龙滤膜上。然后将它们用0.5N NaOH-1.5M NaCl变性(10分钟)，并用0.5N Tris-HCl(pH7.0)-1.5M NaCl中和(10分钟)。在254nm紫外线照射8分钟后，将该滤膜用6×SSC-0.05％ Triton X-100洗涤30分钟。完全刮去细胞碎片。在新鲜溶液中30分钟后，将双份滤膜单独移至单独的混合物中，所述混合物为6×SSC-1％硫酸葡聚糖-0.05％ TritonX-100-1×Denhardt′s杂交液混合物。将32P-标记的探针加入滤膜。在45℃16小时后，将该滤膜用6×SSC-0.05％TritonX-100在室温洗涤5分钟，然后在65℃洗涤30分钟。具有中间质粒pBcX-TrX的阳性杂交克隆通过自动X线照相分析鉴别。
上述方案，包括合成的重叠寡核苷酸的酶促磷酸化和连接入线性化的质粒中，用于TrX(1-92)区域的装配中及随后产生本发明所述的其它突变木聚糖酶的盒式诱变中。
为将TrX(1-92；Tr2编号)区域装配成完全的全长里氏木霉木聚糖酶II基因(TrX)，将中间质粒pBcX-TrX通过NheI和KpnI内切核酸酶线性化以释放针对BcX(1-83)的插入DNA。用NheI和KpnI的粘性末端，通过上述方案将编码TrX(1-91)序列的8个重叠寡核苷酸连接入线性化质粒pBcX-TrX(图2)中，所述8个重叠寡核苷酸是TrX-1，SEQ ID NO21；XyTv-2，SEQ ID NO22；TrX-3，SEQ ID NO23；XyTv-4，SEQ ID NO24；XyTv-5，SEQ ID NO28；TrX-6，SEQ ID NO27；XyTv-7，SEQ ID NO26；和TrX-8 SEQ ID NO25。
新质粒pTrX因此携带合成的TrX基因(SEQ ID NO39)。
下述所有突变木聚糖酶基因均已经通过盒式诱变方法构建。盒式诱变方法与针对上述基因装配所描述的方法相同。一般地，盒式诱变包括(i)酶促磷酸化重叠的合成寡核苷酸，(ii)将合成的寡核苷酸与线性化质粒连接，(iii)将质粒转化入大肠杆菌HB101感受态细胞中，(iv)通过与标记的寡核苷酸杂交而鉴别突变转化体，(v)通过双脱氧核苷酸测序证实突变。
1-2构建前体质粒pTrX-HML这个前体质粒pTrX-HML的构建详见于U.S.专利号5,759,840所述(见实施例1N，在此并入参考；质粒称为pNI-TX13)。TrX-HML包含天然TrX木聚糖酶，伴随N10H(在10位的Asn由His取代)，Y27M和N29L三个突变。以下示出了包含N10H，Y27M和N29L的序列的前30个氨基酸。
TrX 1 2 3 4 5 6 7 8氨基酸 Q T I Q P G T G5′-CT AGC TAA GGA GG CTG CAG ATG CAA ACA ATA CAA CCA GGA ACC GGT3′-GATT CCT CC GAC GTC TAC GTT TGT TAT GTT GGT CCTTGG CCANheI PinAI9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24Y H N G Y F Y S Y W N D G H G GTAC CAC AAC GGT TAC TTT TAC AGC TAT TGG AAC GAT GGC CAT GGA GGCATG GTG TTG CCA ATG AAA ATG TCG ATA ACC TTG CTA CCG GTA CCT CCG25 26 27 28 29 30V T M T L GGTC ACA ATG ACT CTG GGGCAG TGT TAC TGA GAC CCC1-3构建缺失质粒pTrX-HML-(1-113)质粒pTrX-HML-(1-113)包含TrX(SEQ ID NO39)的1-113位氨基酸序列但是不能表达有活性的木聚糖酶。这种转化体通过在蓝色木聚糖平板上转化体菌落周围没有透明区或晕轮而证实。
如下构建新质粒(i)通过用限制酶BamHI和BglII切割除去pTrX-HML的TrX(114-190)编码序列，(ii)连接线性化质粒的相同粘端，(iii)转化入大肠杆菌HB101感受态细胞中，随后铺板于含有氨苄青霉素(100mg/L)的YT平板(在1L水中含有5g酵母提取物，3g细菌用胰蛋白胨，5g NaCl，15g琼脂，及1g Remazol Brilliant Blue R-D-木聚糖)，(iv)通过木聚糖酶活性的丧失鉴别突变的转化体(在40℃过夜的蓝色木聚糖平板上菌落周围没有透明区或晕轮)，(v)通过双脱氧核苷酸测序证实突变。这些步骤的每一个均与上述基因装配的方案相似。
1-4构建质粒pTrX-HML-105R突变木聚糖酶pTrX-HML-105R与TrX-HML相似，除了在105位的Leu由Arg替代(L105R)。
使用PCR产生编码具有L105R突变的(100-190)区域的一个DNA片段。在构建pTrX-HML-105R中具有突变(黑体字)的PCR引物如下所示TX-105R-1(SEQ ID NO44)100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113T G A T K R G E V T S D G S5′-ACCGGC GCCACA AAA AGA GGC GAA GTC ACT AGT GAT GGA TCCKasI反向PCR引物TX-C1包含TX-C1(SEQ ID NO42)183 184 185 186 187 188 189 190 terG S A S I T V SCCA AGG CGA TCA TAA TGT CAC TCG ATTTCT AGAACT TCG AACCC-5′BglI HindIII以下列出了合适的PCR模板和引物，及切割PCR产物末端的限制酶(表3-1)
表3-1

将切割的PCR产物(a)(表3-1)连接入KasI/HindIII线性化的质粒pTrX-HML(1-113)中以产生质粒pTrX-HML-105R。
1-5构建质粒pTrX-HML-75A105R和pTrX-HML-75G105R木聚糖酶突变体TrX-HML-75A-105R和TrX-HML-75G-105R与TrX-HML-105R相似，除了分别具有额外单突变S75A或S75G之外。
以下示出了具有突变S75A(TX-75A-1；SEQ ID NO40)和S75G(TX75-G-1；SEQ ID N046)的PCR引物。
TX-75A-1(SEQ ID NO40)69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81NG NS Y L A V Y G W S R5′-T GGG AAT TCA TAC TTA GCC GTC TAT GGC TGG TCT AGEcoRITX-75G-1(SEQ ID NO46)69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81NG NS Y L G V Y G W S R5′-T GGG AAT TCA TAC TTA GGC GTC TAT GGC TGG TCT AGEcoRI以下示出了合适的PCR模板和引物，及切割PCR产物末端的限制酶(表3-2)。
表3-2

制备EcoRI/HindIII切割PCR产物(b)和(c)(见表3-2)，并与EcoRI/HindIII线性化的pTrX-HML(1-113)质粒连接以分别产生质粒pTrX-HML-75A-105R和pTrX-HML-75G-105R。
1-6构建质粒pTrX-HML-75G105R-125A129E突变体TrX-HML-75G-105R-125A129E与TrX-HML-75G-105R相同，除了额外的突变Q125A和I129E之外。
完整的突变木聚糖酶基因通过连接编码1-121和122-190区域的两个DNA序列而装配。编码1-121区域的DNA序列通过以下限制性核酸酶缺失质粒pTrX-HML-75G-105R而分离(表3-3)。
表3-3

编码122-190区域的DNA序列是通过如下编码突变的引物而产生的PCR产物(d)。
TX-125A129E-1(SEQ ID NO49)120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133Q RV N A P S I E G T A T5′-C CAA CGC GTT AAT GCG CCA TCG ATC GAG GGA ACC GCC ACCMluI以下列出了合适的PCR模板和引物，及切割PCR产物末端的限制性酶(表3-4)。
表3-4

将切割的PCR产物(d)和缺失序列(A)与NheI/HindIII-线性化的质粒pTrX-(1-113)连接以产生质粒pTrX-HML-75G-105R-125A129E。
1-7构建质粒pTrX-HML-75A105H-125A129E完整的突变体基因通过连接编码1-101和102-190区域的两个DNA序列而装配。
为制备编码1-101区域的DNA序列，缺失合适质粒的限制性核酸酶如下所列(表3-5)。
表3-5

为制备编码102-190区域的DNA序列，使用引物TX-105H-1进行聚合酶链式反应。
TX-105H-1(SEQ ID NO41)100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113TG AT K H G E V T S D G S5′-ACCGGC GCCACA AAA CAC GGC GAA GTC ACT AGT GAT GGA TCCKasI以下列出了在105位具有突变的合适的PCR引物及切割PCR产物末端的限制性酶(表3-6)。
表3-6质粒pTrX-HML-75G-105R-125A129E作为PCR模板

将切割的PCR产物(e)和缺失序列(B)连接入NheI/HindIII线性化的质粒pTrX-(1-113)中以产生质粒pTrX-HML-75A-105H-125A129E。
1-8构建缺失质粒pTrX-del(43-53)编码(43-53)区域缺失的非活性木聚糖酶的质粒pTrX-del(43-53)如下构建限制性切割质粒pTrX在43位残基的BspEI位点和在53残基的Xmal位点，并将相同末端自身连接。在转化后，通过在蓝色含有木聚糖的YT平板上无木聚糖酶表达或者没有晕轮或透明区而鉴别正确的克隆。
1-9构建缺失质粒pTrX-del(123-144)和pTrX-HML-75A105H-del(123-144)使用编码(123-144)区域缺失的新引物通过PCR反应，构建含有部分缺失的木聚糖酶基因的两个质粒。
PCR寡核苷酸引物TX-del(123-144)-1r(SEQ ID NO43)148 147 146 145 122 121 120 119 118 117 116 115GS SR RQ T R Y I D Y5′-C GGA GCT CCGAC GCG TTG GGT ACG GTA GAT ATC ATASacI MluITX-N1(SEQ ID NO45)1 2 3 4 5 6 7Q T I Q P G T5′-CT AGC TAA GGA GGCTG CAGATG CAA ACA ATA CAA CCA GGA ANheI PstI表3-7用TX-del(123-144)-1r和TX-N1作为引物的PCR模板

将切割的PCR片段(f)和(g)与PstI/SacI线性化的质粒pTrX连接并转化，产生分别携带缺失质粒pTrX-del(123-144)和pTrX-HML-75A105H-del(123-144)的正确克隆，这些克隆通过在蓝色含有木聚糖的YT平板中无木聚糖酶表达及没有晕轮或透明区而鉴别。
1-10构建质粒pTrX-HML-75A105H-125A129E-144R新突变体pTrX-HML-75A105H-125A129E-144R与前体pTrX-HML-75A105H-125A129E不同之处在于一个额外的突变H144R。使用一种新的PCR反向引物产生这个突变。
TX-144R-1r(SEQ NO47)159 158 157 156 155 154 153 152 151 150 149 148 147 146 145 144 143 142W A NF H N A T N V S G S S R R N R5′-CCA TGC ATT AAA GTG ATT CGC AGT ATT AAC CGA ACC GGA GCT CCG ACG ATT ACGNsiI141 140 139 138R V S WTCT AAC ACT CCA以下列出了合适的PCR模板和引物，及切割PCR产物末端即1-146序列的限制性酶(表3-8)。
表3-8

将PstI/NsiI切割的PCR片段(h)与PstI/NsiI线性化的质粒pTrX-del(43-53)连接，以在新质粒 pTrX-HML-75A-105H-125A-129E-144R中恢复功能性木聚糖酶基因。
1-11构建质粒pTrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R新的突变体pTrX-HML-75A105H-125A129E-144R161与前体pTrX-HML-75A105H-125A129E-144R的不同之处在于一个额外的突变Q161R。使用新的PCR反向引物产生这个突变。
TX-161R-1r(SEQ ID NO48)168 167 166 165 164 163 162 161 160 159 158 157 156 155 154TG LT L G Q R A W A N F H N5′-GT ACC TAG GGT TAA CCC TTG CCG TGC CCA TGC ATT AAA GTG ATTAvrII如表3-9所述制备编码TrX(1-165)区域的PCR产物。
表3-9质粒pTrX-HML-75A-105H-125A129E-144R作为PCR模板

将PstI/AvrII切割的PCR片段(i)与PstI/AvrII线性化的质粒pTrX-del(43-53)连接，以在新的质粒pTrX-HML-75A-105H-125A-129E-144R161R中恢复功能性木聚糖酶基因。
1-12构建质粒pTrX-116G和pTrX-118C这两个新的突变体与TrX相同，主要不同之处在于一个额外的突变，即Asp-116突变为Gly(D116G)或者Tyr-118突变为Cys(Y118C)。
制备具有突变(黑体字)的两个PCR引物。
TX-116G-1(SEQ ID NO50)111 112 113 114 115 116 117 118 119DG SV Y G I Y R5′-GACGGA TCCGTA TAT GGT ATC TAC CGBamHITX-118C-1(SEQ ID NO51)111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122DG SV Y D I C R T Q R5′-GACGGA TCCGTA TAT GAT ATC TGC CGT ACC CAA CGCBamHI
以下质粒模板和引物是所述两个PCR所需的。
表3-10质粒pTrX作为模板的PCR

将切割的PCR产物(j)和(k)与BamHI/HindIII线性化的质粒pTrX-del(123-144)连接，以在携带各自质粒pTrX-116G和pTrX-118C的转化体中恢复功能性木聚糖酶基因。
1-13构建质粒pTrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R和pTrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R两个新的突变体与前体TrX-HML-75A105H-125A129E-144R相同，主要不同之处在于一个额外的突变，即Asp-116突变为Gly(D116G)或者Tyr-118突变为Cys(Y118C)。
以下质粒模板和引物是进行所述两个PCR所需的。
表3-11质粒pTrX-HML-75A105H-125A129E-144R作为模板的PCR

将切割的PCR产物(1)和(m)与BamHI/HindIII线性化的质粒pTrX-HML-75A105H-del(123-144)连接，以在携带各自质粒pTrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R和pTrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R的转化体中恢复功能性木聚糖酶基因。
1-14构建质粒pTrX-H-11D-ML-75A105H-125A129E-144R161R，pTrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R和pTrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R新的突变体TrX-H-11D-ML-75A105H-125A129E-144R161R，TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R和TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R与其各自的前体TrX-HML-75A105H-125A129E-144R，TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R和TrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R相同，主要不同之处在于额外的突变，即Asn-11突变为Asp(N11D)及Gln-161突变为Arg(Q161R)。制备具有突变N11D(黑体字)的一个新的PCR引物。
TX-10H11D-1(SEQ NO52)67 89 10 11 12 13 14 15 16 17 18GT GY H D G Y F Y S Y W5′-GGAACC GGTTAC CAC GAC GGT TAC TTT TAC AGC TAT TGGAgeI表3-13

将切割的PCR产物(n)，(o)和(p)与AgeI/AvrII切割的质粒pTrX-del(43-53)连接，以在分别携带新质粒pTrX-H-11D-ML-75A105H-125A129E-144R161R，pTrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R和pTrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R的转化体中恢复功能性木聚糖酶基因。
1-15构建缺失质粒pTrX-H-11D-ML-75A105H-116G-del(123-144)含有部分缺失的木聚糖酶基因的质粒通过与实施例1-9相同的方法，使用编码缺失(123-144)区域的新引物进行PCR反应来构建。
表3-14用TX-del(123-144)-1r和TX-N1作为引物的PCR模板

将切割的PCR片段(q)连接入PstI/SacI线性化的质粒pTrX中并转化，以产生携带缺失质粒pTrX-H-11D-ML-75A105H-116G-del(123-144)的正确克隆，这些克隆通过在蓝色含有木聚糖的YT平板中无木聚糖酶表达及没有晕轮或透明区而鉴别。
1-16构建质粒pTrX-H-11D-ML-75A105H-116G118C-125A129E-144R161R新的突变体TrX-H-11D-ML-75A105H-116G118C-125A129E-144R161R与其前体TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R和TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R相同，不同之处在于具有组合突变，Tyr-118突变为Cys(Y118C)及Asp-116突变为Gly(D116G)。制备具有组合突变D116G/Y118C(黑体字)的一个新的PCR引物。
TX-116G118C-1(SEQ ID NO53)111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122DG SV Y G I C R T Q R5′-GACGGA TCCGTA TAT GGT ATC TGC CGT ACC CAA CGCBamHI表3-15产生含有组合突变的(112-167)片段的PCR

将切割的PCR产物(r)与BamHI/AvrII切割的质粒pTrX-H-11D-ML-75A105H-116G-del(123-144)连接，以在携带新质粒pTrX-H-11D-ML-75A105H-116G118C-125A129E-144R161R的转化体中恢复功能性木聚糖酶基因。
实施例2定性突变体木聚糖酶2-1生产木聚糖酶培养条件包括将于含有氨苄青霉素(100mg/L)的2YT培养基(16g细菌用胰蛋白胨，10g酵母提取物，5g NaCl，1L水)中接种过夜的5ml培养物加入具有氨苄青霉素的2YT培养基(1L)中。将培养物在37℃摇动(200rpm)生长。16小时后，收获细胞。
2-2纯化突变体木聚糖酶首先产生细胞提取物而从细胞中制备蛋白质样品，所述细胞提取物通过用25g氧化铝粉末研磨10g细胞糊状物而制备。在研磨为平滑的混合物之后，加入少量(5mL)冰冻的缓冲液A(10mM乙酸钠，pH5.5，针对BcX突变体)或者缓冲液B(10mM乙酸钠，pH4.6，针对TX突变体)，并在加入缓冲液期间将混合物用力研磨。将该混合物以8000×g离心30分钟除去氧化铝和细胞碎片。
在进行柱层析之前，将上清用乙酸调节为pH4.6，离心除去沉淀物。随后针对所有突变体木聚糖酶的柱层析方法均相同。
在酸化和离心后，抽取木聚糖酶样品到在10mM乙酸钠(pH4.6)中平衡的50ml床体积的，CM-琼脂糖快速流动的阳离子交换柱(Pharmacia Biotech，Uppsala)。将木聚糖酶用250ml线性梯度(于10mM乙酸钠中的0-0.6M Nacl，pH 4.6)以1ml/分钟流速洗脱。木聚糖酶在150至200ml梯度时被洗脱出来。通过SDS-PAE检测收集的组分，并集合具有大多数木聚糖酶的那些组分。纯化的木聚糖酶通过分光光度测定法，对大多数突变TrX木聚糖酶在280nm使用54,600-53,400M-1之间的消光系数进行量化。从10g细胞中典型地纯化产生25mg木聚糖酶。
2-3测定酶活性的标准分析量化分析测定了从可溶木聚糖中产生的还原糖末端的数量。这个分析的底物是来自桦木木聚糖的5％悬浮液(Sigma Chemical Co.)的溶解于水中的桦木木聚糖的组分。在除去不溶的组分后，将上清冻干并贮存于干燥器中。如下测定比活性将含有预先在分析缓冲液(50mM柠檬酸钠，pH5.5或者测试的木聚糖酶的最佳pH)中稀释的100μL的30mg/mL木聚糖的反应混合物，150μL分析缓冲液，和在分析缓冲液中稀释的50μL酶在40℃孵育。在不同时间间隔取50μL的部分，稀释在1ml的5mMNaOH中终止反应。还原糖的数量用对羟基苯甲酸酰肼试剂(HBAH)(Lever，1972，Analytical Biochem 47273-279)测定。一单位的酶活性定义为在40℃1分钟内产生1μmol还原糖的酶量。
为比较突变的和天然木聚糖酶之间的比活性，将突变木聚糖酶的比活性转变为相对活性。相对活性以突变酶的比活性除以天然木聚糖酶的比活性的百分比计算。
表4在40℃和pH5.5时突变和天然木聚糖酶的相对活性

*天然TrX木聚糖酶的比活性经测定为770U/mg。
表4所示结果表明突变木聚糖酶在40℃的特异性酶活性与天然木聚糖酶相比无明显改变。但是，当与天然木聚糖酶相比时(比活性提高13-21％)，观测到118C突变木聚糖酶(TrX-HML-AHCAE-R和TrX-H11D-ML-AHCAE-R)的活性增高比活性。
2-4确定大肠杆菌表达突变木聚糖酶的表达效率通过2-3所述的标准分析，确定了每种突变木聚糖酶的相对表达效率，其通过估计在单位体积细菌培养物中木聚糖酶产生的木糖释放而确定。与没有这种突变的各自前体TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R，TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R和TrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R相比，大肠杆菌表达的编码突变N11D的三种突变木聚糖酶TrX-H-11D-ML-75A105H-125A129E-144R161R(TrX-H11D-ML-AHAE-RR)；TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R(TrX-H11D-ML-AHGAE-RR)和TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R(TrX-H11D-ML-AHCAERR)的表达效率高2.4-4.3倍。
表5突变木聚糖酶的表达效率

*相对于在上文中规定的各自的前体。
这表明突变N11D的一个益处是增强在微生物中的表达，这是工业生产酶的一个重要特征。
实施例3突变木聚糖酶的嗜热性检测嗜热性是测试不同温度对不同突变木聚糖酶酶促水解可溶木聚糖的作用。
分析步骤与标准分析相似，不同之处是孵育温度和时间。将pH5.5的50mM柠檬酸钠缓冲液中的木聚糖酶(15μg/mL)和可溶的桦木木聚糖底物混合，并在不同的温度在循环水浴中孵育。孵育30分钟后，通过HBAH分析测定木聚糖释放的还原糖的量，并计算为相对活性，在40℃的数值代表100％。
图3示出温度对TrX-HML-75A105H-125A129E-144R(TrX-HML-AHAE-R)水解木聚糖的作用。与没有H144R突变的前体(TrX-HML-AHAE)相比，这个突变木聚糖酶显示在较高温度时中等程度改良的酶活性。这些结果提示H144R突变改良了木聚糖酶的嗜热性。
与TrX-HML-75A105H-125A129E-144R(TrX-HML-AHAE-R)相比，另一种突变体TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R(TrX-HML-AHAE-RR)在较高温度不明显增强酶活性(未示出)。这些结果提示Q161R突变对木聚糖酶的嗜热性没有益处。
已经测试了基于D116G和Y118C突变的两个系列的突变体。与天然TrX相对比，单一突变TrX-116G和TrX-118C在较高温度呈现较高活性(图4)。
与前体TrX-HML-75A105H-125A129E-144R(Trx-HML-AHAE-R)在pH5.5(图5，只示出116G突变体)和pH6.0(图6和7，这些图包括相同数据但相对活性表示不同)相比，在下对突变中也观测到嗜热性的相同增强作用TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R(TrX-HML-AHGAE-R)和TrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R(TrX-HML-AHCAE-R)。
基于N11D突变的另一系列突变木聚糖酶对嗜热性也有益处。与前体TrX-HML-75A105H-125A129E-144R(TrX-HML-AHAE-R，图8)相比，突变体TrX-H-11D-ML-75A105H-125A129E-144R161R(TrX-H11D-ML-AHAE-RR)在较高温度呈现较高活性。这是个未曾期望的结果，因为现有技术的报道表明观测到了相同的N11D突变或者在含有分子内二硫键的TrX突变体中降低温度最佳值和温度范围(Turenen等，2001)，或者对TrX-H-11D-ML的嗜热性无作用(US 5,759，840，突变体称为NI-TX12)。本发明的这些数据表明11D突变对适当修饰的木聚糖酶有益处。
以上鉴别的突变可以组合以产生甚至在较高pH范围具有较高嗜热性的突变木聚糖酶。组合突变木聚糖酶，包括三重突变N11D/D116G/144R或N11D/Y118C/144R的突变体TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R(TrX-H11D-ML-AHGAE-RR)；和TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R(TrX-H11D-ML-AHCAE-RR)，在大约70℃至大约75℃的较高温度呈现最大酶活性，及在pH5.5(图5，只示出116G突变体)和pH6.0(图6和7)在80℃示出明显酶活性。这些结果提示突变D116G或Y118C补充了突变N11D和H144R，与木聚糖酶的嗜热性相关。
实施例4突变木聚糖酶的嗜碱性检测遗传修饰的木聚糖酶的嗜碱性以测试不同pH条件对突变木聚糖酶酶促水解可溶的桦木木聚糖的作用。该分析方法与标准分析相似，不同之处在于孵育温度和时间不同。将遗传修饰的木聚糖酶等份(15μg/mL)和在50mMpH4-7之间的柠檬酸钠缓冲液中的可溶木聚糖底物一起在65℃孵育。温育30分钟后，通过HBAH分析测定木聚糖底物释放的还原糖的数量，并计算各种突变木聚糖酶对pH的函数，最大活性定为100％。
突变H144R在较高pH不影响活性。突变体TrX-HML-75A105H-125A129E-144R及其前体TrX-HML-75A105H-125A129E具有相同pH/活性分布图(未示出)。然而，如实施例3所述，这个突变(H144R)有益于木聚糖酶的嗜热性。
图9示出在突变Q161R所产生的突变木聚糖酶TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R(TrX-HML-AHAE-RR)中pH对酶活性的作用。与具有相同pH/活性分布图的其前体TrX-HML-75A105H-125A129E和TrX-HML-75A105H-125A129E-144R(未示出)相对比，突变木聚糖酶TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R(TrX-HML-AHAE-RR)在6.5，7.0，7.5和8.0的较高pH范围呈现较高活性。当与无此突变的前体相比时，TrX-HML-AHAE-RR在5.0，5.5和6.0的较低pH也呈现较低活性。
已经测试了突变D116G和Y118C对木聚糖酶活性的直接作用。与天然TrX相比，单一突变TrX-116G和TrX-118C在较高的pH表现了更高的活性(图10)。
当与前体TrX-HML-75A105H-125A129E-144R和TrX-HML-75A105H-125A129E相比时，在以下突变体中也观测到突变D116G和Y118C对嗜碱性的相同增强作用TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R(TrX-HML-AHGAE-R)和TrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144R(TrX-HML-AHCAE-R，图9)。尽管这两种突变体在pH6.5，7.0，7.5和8.0均呈现了较高活性，突变体TrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144R在5.0，5.5和6.0的较低pH保持最佳活性。这两种突变体在pH5.0-8.0保持高活性表明最佳pH范围扩大。
N11D突变未显示出有助于TrX的嗜碱性。突变体TrX-H-11D-ML-75A105H-125A129E-144R161R(TrX-H11DML-AHAE-RR)与其前体TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R具有相同的pH/活性分布图(未示出)。11D对pH/活性分布图无作用的结果与Turenen等(2001)所述结果相矛盾，其指出N11D突变在含有分子内二硫键的TrX突变体中降低pH最佳值和pH范围。然而，上述结果与US 5,759,840的结论一致，其中未观测到对TrX-H-11D-ML(称为NI-TX12的突变体)嗜碱性的阴性作用。
组合以上鉴别的突变产生具有较高嗜碱性和嗜热性的突变木聚糖酶。基于四重突变N11D/D116G/H144R/Q161R或N11D/Y118C/144R/Q161R的组合突变木聚糖酶TrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161R(TrX-H11D-ML-AHGAE-RR，图9)和TrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161R(TrX-H11D-ML-AHCAE-RR，未示出)与其前体木聚糖酶相比，在大约pH5.5至大约pH7呈现最大酶活性。另外，存在突变D116G有助于在5.0，5.5和6.0的较低pH范围充分保持最大活性，因此避免在低pH明显丧失活性，如在前体TrX-HML-75A105H-125A129E-144R161R(图9)中所观测到的。这个结果进一步证实最佳pH范围扩大。
概括而言，嗜碱性木聚糖酶可以通过组合突变D116G或Y118C与Q161R而构建。加入其它新的突变N11D和H144R可进一步增强突变体TrX的嗜热性。N11D突变可有益于突变体的表达。
本发明描述了突变木聚糖酶，其呈现改良的嗜热性和嗜碱性及与纸浆生产中这些酶相关的益处，这些突变木聚糖酶还可以用于其它工业过程中，例如但不限于清洗精密仪器和半导体。另外，由于其提高的嗜热性和热稳定性，突变木聚糖酶可用于化学处理中，即使用少量的变性剂或去污剂或者存在溶剂，例如但不限于少量非极性溶剂例如但不限于己烷，二氧杂环乙烷，四氯化碳，苯，醚，氯仿，乙酸和二氯甲烷，及极性溶剂例如但不限于丙酮，乙醇，二甲基甲酰胺，乙腈，噻吩烷砜，二甲亚砜和水。
本发明针对优选的实施例已经进行了描述。然而，显而易见在不偏离本发明在此所述范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明加以各种变化和修改。
所有参考和引用的资料在此并入参考。
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Gly Thr Ile Thr Thr Gly Asn His Phe Asp Ala Trp Ala Arg Ala Gly145 150 155 160Met Asn Met Gly Asn Phe Arg Tyr Tyr Met Ile Asn Ala Thr Glu Gly165 170 175Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ser Thr Ile Thr Val Ser Gly180 185<210>13<211>189<212>PRT<213>褐色高温单孢菌<400>13Ala Val Thr Ser Asn Glu Thr Gly Tyr His Asp Gly Tyr Phe Tyr Ser1 5 10 15Phe Trp Thr Asp Ala Pro Gly Thr Val Ser Met Glu Leu Gly Pro Gly20 25 30Gly Asn Tyr Ser Thr Ser Trp Arg Asn Thr Gly Asn Phe Val Ala Gly35 40 45Lys Gly Trp Ala Thr Gly Gly Arg Arg Thr Val Thr Tyr Ser Ala Ser50 55 60Phe Asn Pro Ser Gly Asn Ala Tyr Leu Thr Leu Tyr Gly Trp Thr Arg65 70 75 80Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Ser Trp Gly Thr Tyr Arg85 90 95Pro Thr Gly Thr Tyr Met Gly Thr Val Thr Thr Asp Gly Gly Thr Tyr100 105 110Asp Ile Tyr Lys Thr Thr Arg Tyr Asn Ala Pro Ser Ile Glu Gly Thr115 120 125Arg Thr Phe Asp Gln Tyr Trp Ser Val Arg Gln Ser Lys Arg Thr Ser130 135 140Gly Thr Ile Thr Ala Gly Asn His Phe Asp Ala Trp Ala Arg His Gly145 150 155 160
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Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ile Thr Val Ser180 185 190<210>15<211>178<212>PRT<213>里氏木霉Xy1 I<400>15Ala Ser Ile Asn Tyr Asp Gln Asn Tyr Gln Thr Gly Gly Gln Val Ser1 5 10 15Tyr Ser Pro Ser Asn Thr Gly Phe Ser Val Asn Trp Asn Thr Gln Asp20 25 30Asp Phe Val Val Gly Val Gly Trp Thr Thr Gly Ser Ser Ala Pro Ile35 40 45Asn Phe Gly Gly Ser Phe Ser Val Asn Ser Gly Thr Gly Leu Leu Ser50 55 60Val Tyr Gly Trp Ser Thr Asn Pro Leu Val Glu Tyr Tyr Ile Met Glu65 70 75 80Asp Asn His Asn Tyr Pro Ala Gln Gly Thr Val Lys Gly Thr Val Thr85 90 95Ser Asp Gly Ala Thr Tyr Thr Ile Trp Glu Asn Thr Arg Val Asn Glu100 105 110Pro Ser Ile Gln Gly Thr Ala Thr Phe Asn Gln Tyr Ile Ser Val Arg115 120 125Asn Ser Pro Arg Thr Ser Gly Thr Val Thr Val Gln Asn His Phe Asn130 135 140Trp Ala Ser Leu Gly Leu His Leu Gly Gln Met Met Asn Tyr Gln Val145 150 155 160Val Ala Val Glu Gly Trp Gly Gly Ser Gly Ser Ala Ser Gln Ser Val165 170 175Ser Asn
<210>16<211>190<212>PRT<213>里氏木霉Xyl II<400>16Gln Thr Ile Gln Pro Gly Thr Gly Tyr Asn Asn Gly Tyr Phe Tyr Ser1 5 10 15Tyr Trp Asn Asp Gly His Gly Gly Val Thr Tyr Thr Asn Gly Pro Gly20 25 30Gly Gln Phe Ser Val Asn Trp Ser Asn Ser Gly Asn Phe Val Gly Gly35 40 45Lys Gly Trp Gln Pro Gly Thr Lys Asn Lys Val Ile Asn Phe Ser Gly50 55 60Ser Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Val Tyr Gly Trp Ser65 70 75 80Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr85 90 95Asn Pro Ser Thr Gly Ala Thr Lys Leu Gly Glu Val Thr Ser Asp Gly100 105 110Ser Val Tyr Asp Ile Tyr Arg Thr Gln Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile115 120 125Ile Gly Thr Ala Thr Phe Tyr Gln Tyr Trp Ser Val Arg Arg Asn His130 135 140Arg Ser Ser Gly Ser Val Asn Thr Ala Asn His Phe Asn Ala Trp Ala145 150 155 160Gln Gln Gly Leu Thr Leu Gly Thr Met Asp Tyr Gln Ile Val Ala Val165 170 175Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ile Thr Val Ser180 185 190<210>17<211>190
<212>PRT<213>Trichoderma viride<400>17Gln Thr Ile Gln Pro Gly Thr Gly Phe Asn Asn Gly Tyr Phe Tyr Ser1 5 10 15Tyr Trp Asn Asp Gly His Gly Gly Val Thr Tyr Thr Asn Gly Pro Gly20 25 30Gly Gln Phe Ser Val Asn Trp Ser Asn Ser Gly Asn Phe Val Gly Gly35 40 45Lys Gly Trp Gln Pro Gly Thr Lys Asn Lys Val Ile Asn Phe Ser Gly50 55 60Ser Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ser Tyr Leu Ser Val Tyr Gly Trp Ser65 70 75 80Arg Asn Pro Leu Ile Glu Tyr Tyr Ile Val Glu Asn Phe Gly Thr Tyr85 90 95Asn Pro Ser Thr Gly Ala Thr Lys Leu Gly Glu Val Thr Ser Asp Gly100 105 110Ser Val Tyr Asp Ile Tyr Arg Thr Gln Arg Val Asn Gln Pro Ser Ile115 120 125Ile Gly Thr Ala Thr Phe Tyr Gln Tyr Trp Ser Val Arg Arg Thr His130 135 140Arg Ser Ser Gly Ser Val Asn Thr Ala Asn His Phe Asn Ala Trp Ala145 150 155 160Gln Gln Gly Leu Thr Leu Gly Thr Met Asp Tyr Gln Ile Val Ala Val165 170 175Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ile Thr Val Ser180 185 190<210>18<211>202<212>PRT<213>产琥珀酸丝状杆菌
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<210>25<211>51<212>DNA<213>Trx-8<400>25gattcctccg acgtctacgt ttgttatgtt ggtccttggc caatgttgtt g 51<210>26<211>84<212>DNA<213>XyTv-7<400>26ccaatgaaaa tgtcgataac cttgctaccg gtaccaccac aatggatatg tttgcccggg 60cctccggtta aatcgcagtt aacc84<210>27<211>78<212>DNA<213>Trx-6<400>27agattgaggc ctttgaagca tccacctttt ccaaccgttg ggccctggtt tttattccac 60tagttgaaga gacctaga 78<210>28<211>85<212>DNA
<213>XyTv-5<400>28atattaggct tacccttaag tatgaattcg cagataccga ccagatcttt gggtgactaa60cttataatgt aacagctttt aaagc 85<210>29<211>58<212>DNA<213>XyTv-101<400>29tcgacaattt cggtacctac aatccgagta ccggcgccac aaaattaggc gaagtcac 58<210>30<211>53<212>DNA<213>XyTv-102<400>30tagtgatgga tccgtatatg atatctaccg tacccaacgc gttaatcagc cat 53<210>31<211>59<212>DNA<213>Trx-103<400>31cgatcattgg aaccgccacc ttttatcagt actggagtgt tagacgtaat catcggagc 59
<210>32<211>69<212>DNA<213>XyTv-104<400>32tccggttcgg ttaatactgc gaatcacttt aatgcatggg cacagcaagg gttaacccta 60ggtacaatg 69<210>33<211>67<212>DNA<213>XyTv-105<400>33gattatcaaa tcgtagcggt ggaaggctac ttctcgagtg gttccgctag tattacagtg 60agctaaa 67<210>34<211>73<212>DNA<213>XyTv-110<400>34gttaaagcca tggatgttag gctcatggcc gcggtgtttt aatccgcttc agtgatcact 60acctaggcat ata73<210>35<211>54
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caccttccga tgaagagctc accaaggcga tcataatgtc actcgatttc tag 53<210>39<211>596<212>DNA<213>TrX<400>39ctagctaagg aggctgcaga tgcaaacaat acaaccagga accggttaca acaacggtta 60cttttacagc tattggaacg atggccatgg tggtgttacc tatacaaacg ggcccggagg120ccaatttagc gtcaattggt ctaactccgg aaacttcgta ggtggaaaag gttggcaacc180cgggaccaaa aataaggtga tcaacttctc tggatcttat aatccgaatg ggaattcata240cttaagcgtc tatggctggt ctagaaaccc actgattgaa tattacattg tcgaaaattt300cggtacctac aatccgagta ccggcgccac aaaattaggc gaagtcacta gtgatggatc360cgtatatgat atctaccgta cccaacgcgt taatcagcca tcgatcattg gaaccgccac420cttttatcag tactggagtg ttagacgtaa tcatcggagc tccggttcgg ttaatactgc480gaatcacttt aatgcatggg cacagcaagg gttaacccta ggtacaatgg attatcaaat540cgtagcggtg gaaggctact tctcgagtgg ttccgctagt attacagtga gctaaa596<210>40<211>36<212>DNA<213>Tx-75A-1<400>40tgggaattca tacttagccg tctatggctg gtctag 36<210>41
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65 70 75 80Tyr Ile Val Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Asn Pro Cys Ser Ser Ala Thr85 90 95Ser Leu Gly Thr Val Tyr Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Gln Val Cys Thr100 105 110Asp Thr Arg Thr Asn Glu Pro Ser Ile Thr Gly Thr Ser Thr Phe Thr115 120 125Gln Tyr Phe Ser Val Arg Glu Ser Thr Arg Thr Ser Gly Thr Val Thr130 135 140Val Ala Asn His Phe Asn Phe Trp Ala Gln His Gly Phe Gly Asn Ser145 150 155 160Asp Phe Asn Tyr Gln Val Met Ala Val Glu Ala Trp Ser Gly Ala Gly165 170 175Ser Ala Ser Val Thr Ile Ser Ser180
权利要求
1.一种修饰的木聚糖酶，其包含至少一个在选自第11，116，118，144或161位氨基酸的位置上的取代的氨基酸残基，所述位置从所述修饰的木聚糖酶与SEQ ID NO16所示里氏木霉(Trichoderma reesei)木聚糖酶II氨基酸序列的序列对比中确定。
2.权利要求1的修饰的木聚糖酶，其中所述修饰的木聚糖酶与相应的天然木聚糖酶相比呈现改良的嗜热性，嗜碱性，表达效率，或其组合。
3.权利要求1的修饰的木聚糖酶，其中所述取代的氨基酸在第144位，而且选自于碱性氨基酸组成的一组。
4.权利要求3的修饰的木聚糖酶，其中所述至少一个取代的氨基酸选自Arg和Lys组成的一组。
5.权利要求4的修饰的木聚糖酶，其中所述修饰的木聚糖酶衍生自家族11木聚糖酶。
6.权利要求5的修饰的木聚糖酶，其中所述家族11木聚糖酶是里氏木霉木聚糖酶。
7.权利要求4的修饰的木聚糖酶，还包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala及在第129位的Glu(HML-AHAE)。
8.权利要求1的修饰的木聚糖酶，其中所述取代的氨基酸在第161位，而且选自于碱性氨基酸组成的一组。
9.权利要求8的修饰的木聚糖酶，其中所述至少一个取代的氨基酸选自于Arg，Lys和His组成的一组。
10.权利要求9的修饰的木聚糖酶，其中所述修饰的木聚糖酶衍生自家族11木聚糖酶。
11.权利要求10的修饰的木聚糖酶，其中所述家族11木聚糖酶是里氏木霉木聚糖酶。
12.权利要求9的修饰的木聚糖酶，还包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，及在第129位的Glu。
13.权利要求12的修饰的木聚糖酶，还包含在第144位的第二个取代的氨基酸，而且选自于碱性氨基酸组成的一组。
14.权利要求13的修饰的木聚糖酶，其中所述第二个取代的氨基酸选自于Arg和Lys组成的一组。
15.权利要求14的修饰的木聚糖酶，其中所述修饰的木聚糖酶衍生自家族11木聚糖酶。
16.权利要求15的修饰的木聚糖酶，其中所述家族11木聚糖酶是里氏木霉木聚糖酶。
17.权利要求1的修饰的木聚糖酶，其中所述取代的氨基酸在第11位，而且选自于酸性氨基酸组成的一组。
18.权利要求17的修饰的木聚糖酶，其中所述至少一个取代的氨基酸是Asp。
19.权利要求18的修饰的木聚糖酶，其中所述修饰的木聚糖酶衍生自家族11木聚糖酶。
20.权利要求19的修饰的木聚糖酶，其中所述家族11木聚糖酶是里氏木霉木聚糖酶。
21.权利要求18的修饰的木聚糖酶，还包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，及在第129位的Glu。
22.权利要求21的修饰的木聚糖酶，还包含在第144位和161位的第二个和第三个取代的氨基酸，而且选自于碱性氨基酸组成的一组。
23.权利要求22的修饰的木聚糖酶，其中所述在第144位的第二个取代的氨基酸选自于Arg和Lys组成的一组，所述在第161位的第三个取代的氨基酸选自于Arg，Lys和His组成的一组。
24.权利要求23的修饰的木聚糖酶，其中所述修饰的木聚糖酶衍生自家族11木聚糖酶。
25.权利要求24的修饰的木聚糖酶，其中所述家族11木聚糖酶是里氏木霉木聚糖酶。
26.权利要求1的修饰的木聚糖酶，其中所述取代的氨基酸在第116位而且选自于小型疏水性氨基酸组成的一组。
27.权利要求26的修饰的木聚糖酶，其中所述至少一个取代的氨基酸是Gly。
28.权利要求27的修饰的木聚糖酶，其中所述修饰的木聚糖酶衍生自家族11木聚糖酶。
29.权利要求28的修饰的木聚糖酶，其中所述家族11木聚糖酶是里氏木霉木聚糖酶。
30.权利要求27的修饰的木聚糖酶，还包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，及在第129位的Glu。
31.权利要求30的修饰的木聚糖酶，还包含在第11位的第二个取代的氨基酸而且选自于酸性氨基酸组成的一组，及在第144和161位的第三个和第四个取代的氨基酸而且选自于碱性氨基酸组成的一组。
32.权利要求31的修饰的木聚糖酶，其中在第11位的所述第二个取代的氨基酸是Asp，在第144位的所述第三个取代的氨基酸选自于Arg和Lys组成的一组，在第161位的第四个取代的氨基酸选自于Arg，Lys和His组成的一组。
33.权利要求32的修饰的木聚糖酶，其中所述修饰的木聚糖酶衍生自家族11木聚糖酶。
34.权利要求33的修饰的木聚糖酶，其中所述家族11木聚糖酶是里氏木霉木聚糖酶。
35.权利要求1的修饰的木聚糖酶，其中所述取代的氨基酸在第118位，而且选自于中等大小的非芳香族的疏水性氨基酸组成的一组。
36.权利要求35的修饰的木聚糖酶，其中所述至少一个取代的氨基酸是Cys。
37.权利要求36的修饰的木聚糖酶，其中所述修饰的木聚糖酶衍生自家族11木聚糖酶。
38.权利要求37的修饰的木聚糖酶，其中所述家族11木聚糖酶是里氏木霉木聚糖酶。
39.权利要求36的修饰的木聚糖酶，还包含在第10和105位的His，在第27位的Met，在第29位的Leu，在第75和125位的Ala，及在第129位的Glu。
40.权利要求39的修饰的木聚糖酶，还包含在第11位的第二个取代的氨基酸并选自于酸性氨基酸组成的一组，及在第144和161位的第三个和第四个取代的氨基酸，其选自于碱性氨基酸组成的一组。
41.权利要求40的修饰的木聚糖酶，其中在第11位的所述第二个取代的氨基酸是Asp，在第144位的所述第三个取代的氨基酸选自于Arg和Lys组成的一组，在第161位的第四个取代的氨基酸选自于Arg，Lys和His组成的一组。
42.权利要求41的修饰的木聚糖酶，其中所述修饰的木聚糖酶衍生自家族11木聚糖酶。
43.权利要求42的修饰的木聚糖酶，其中所述家族11木聚糖酶是里氏木霉木聚糖酶。
44.权利要求40的修饰的木聚糖酶，其中在第11位的所述第二个取代的氨基酸是Asp，在第116位的所述第三个取代的氨基酸是Gly，在第144位的所述第四个取代的氨基酸选自于Arg和Lys组成的一组，及在第161位的所述第五个取代的氨基酸选自于Arg，Lys和His组成的一组。
45.权利要求44的修饰的木聚糖酶，其中所述修饰的木聚糖酶衍生自家族11木聚糖酶。
46.权利要求45的修饰的木聚糖酶，其中所述家族11木聚糖酶是里氏木霉木聚糖酶。
47.权利要求1的修饰的木聚糖酶在工业处理中的应用。
48.权利要求47的应用，其中所述工业处理是纸浆制造。
49.一种修饰的木聚糖酶，其选自由以下组成的一组(如表2所述)TrX-HML-75A105H-125A129E-144RTrX-HML-75A105H-125A129E-144R161RTrX-116GTrX-118CTrX-HML-75A105H-116G-125A129E-144RTrX-HML-75A105H-118C-125A129E-144RTrX-H-11D-ML-75A105H-125A129E-144R161RTrX-H-11D-ML-75A105H-116G-125A129E-144R161RTrX-H-11D-ML-75A105H-118C-125A129E-144R161RTrX-H-11D-ML-75A105H-116G118C-125A129E-144R161R
50.一种木聚糖酶，其包含在选自第11，116，118，144和161位氨基酸的位置的一个氨基酸残基，所述位置从所述修饰的木聚糖酶与SEQ ID NO16所示里氏木霉木聚糖酶II氨基酸序列对比中确定，所述氨基酸在所述SEQ ID NO16所示里氏木霉木聚糖酶II氨基酸序列中的所述位置未发现。
51.一种木聚糖酶，其在第116位包含非极性氨基酸，所述位置从所述修饰的木聚糖酶与SEQ ID NO16所示里氏木霉木聚糖酶II的氨基酸序列对比中确定。
52.权利要求51的木聚糖酶，其中所述非极性氨基酸是Gly。
53.一种木聚糖酶，其在第118位包含一个非芳香族的疏水性氨基酸，所述位置从所述修饰的木聚糖酶与SEQ ID NO16所示里氏木霉木聚糖酶II的氨基酸序列的对比中确定。
54.权利要求53的木聚糖酶，其中所述非芳香族的疏水性氨基酸是Cys。
55.一种木聚糖酶，其在第144位包含一个碱性氨基酸，所述位置从所述修饰的木聚糖酶与SEQ ID NO16所示里氏木霉木聚糖酶II的氨基酸序列的对比中确定。
56.权利要求55的木聚糖酶，其中所述碱性氨基酸是Arg。
57.一种木聚糖酶，其包含在第11位的一个酸性氨基酸，在第116位的一个非极性氨基酸，及在第144位的一个碱性氨基酸，所述位置从所述修饰的木聚糖酶与SEQ ID NO16所示里氏木霉木聚糖酶II的氨基酸序列的对比中确定。
58.权利要求57的木聚糖酶，其中所述酸性氨基酸是Asp，所述非极性氨基酸是Gly，及所述碱性氨基酸是Arg。
59.一种木聚糖酶，其包含在第11位的一个酸性氨基酸，在第118位的一个非芳香族的疏水性氨基酸，及在第144位的一个碱性氨基酸，所述位置从所述修饰的木聚糖酶与SEQ ID NO16所示里氏木霉木聚糖酶II的氨基酸序列的对比中确定。
60.权利要求59的木聚糖酶，其中所述酸性氨基酸是Asp，所述非芳香族的疏水性氨基酸是Cys，及所述碱性氨基酸是Arg。
61.一种修饰的木聚糖酶，其包含至少一个取代的氨基酸残基，其中所述修饰的木聚糖酶的特征在于具有在大约69℃至大约84℃之间的最大有效温度(MET)，其中所述修饰的木聚糖酶是得自木霉(Trichoderma sp.)的家族11木聚糖酶。
62.权利要求61的修饰的木聚糖酶，其中所述MET在大约70℃至大约84℃之间。
63.一种修饰的木聚糖酶，其包含至少一个取代的氨基酸残基，其中所述修饰的木聚糖酶特征在于具有在大约pH5.8至大约pH8.4之间的最大有效pH值(MEP)，其中所述修饰的木聚糖酶是得自木霉的家族11木聚糖酶。
64.权利要求63的修饰的木聚糖酶，其中所述MEP在大约pH6.0至大约pH8.0之间。
65.权利要求61的修饰的木聚糖酶，其中所述修饰的木聚糖酶的特征还在于具有在大约pH5.8至大约pH7.6之间的最大有效pH(MEP)。
66.权利要求62的修饰的木聚糖酶，其中所述修饰的木聚糖酶的特征还在于具有在大约pH6.5至大约pH7.4之间的最大有效pH(MEP)。
全文摘要
本发明提供了一种木聚糖酶或者一种修饰的木聚糖酶，其包含至少一个选自第11，116，118，144和161位氨基酸的位置上的取代的氨基酸残基，所述位置从所述修饰的木聚糖酶与里氏木霉(Trichoderma reesei)木聚糖酶II氨基酸序列对比中确定。本发明所述木聚糖酶与相应的天然木聚糖酶相比呈现改良的嗜热性，嗜碱性，表达效率或其组合。
文档编号C12N9/24GK1697877SQ02823195
公开日2005年11月16日 申请日期2002年11月20日 优先权日2001年11月21日
发明者宋永霖 申请人:加拿大国立研究院