荒漠植物红砂rna的提取方法

专利名称：荒漠植物红砂rna的提取方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术领域，具体说是一种荒漠植物红砂RNA的提取方法。
背景技术：
荒漠植物的强抗逆性一直受到学者们的关注。这种强抗逆性主要是由于荒漠植物体内含有大量的多糖、多酚、单宁酸和其它次级代谢物而形成的。现代分子生物学技术的运用对揭示荒漠植物强抗逆机制及其遗传种质资源的保护具有重要的作用。检测不同环境胁迫下基因表达水平的变化为理解植物的抗逆性提供一些必要的基础数据。高质量RNA的提取是进行分子生物学基因表达研究的必要前提。目前提取RNA的方法有多种，包括异硫氰酸胍法、SDS/酚抽提法、苯酚法、氯化锂沉淀法和CTAB法。然而，已发表的大量文章都反映出在分离高质足量的RNA时存有不同的困难，主要表现在RNA易受RNase的降解；植物组织细胞破碎后，释放出大量的多酚、多糖以及其它次级代谢物而干扰RNA的提取；多酚易氧化成多醌而与核酸结合；多糖在低离子浓度缓冲溶液中与RNA结合产生共沉淀。这些都导 致RNA产量降低。这样，不同植物组织中多糖、多酚以及其它次级代谢物含量的不同显著地影响着核酸的抽提及纯化过程，因此研究荒漠植物抗逆机制，RNA提取方法是科技工作者必须解决的一个技术难题。超旱生小半灌木红砂(Tfea應aria soongorica (Pall. ) Maxim.)属于径柳科红砂属，起源于第三纪，是荒漠灌丛植被主要优势种和建群种。其分布区东起我国鄂尔多斯西部，经阿拉善、河西、北山、柴达木盆地、嘎顺戈壁，西至准噶尔和塔里木盆地边缘，生长在荒漠、半荒漠的山麓洪积平原、山地丘陵、剥蚀残丘、山前砂砾质和砾质洪积扇、戈壁等地，分布区内生境相对炎热、干旱，年降水量在60-300 _，海拔在500-3200 _。土壤一般为灰棕荒漠土或棕色荒漠土及荒漠灰钙土，土壤瘠薄坚硬，富含石膏，有不同程度的盐溃化，在中重度盐溃化土壤中红砂也能良好生长。据1961年以来额济纳旗气象资料数据统计，红砂能在年均降雨量7-101. I mm，温度变化幅度为-35. 2-42. 5 °C，潜在蒸发量高达4234. 9 mm的环境下生存。红砂分布范围广，抗逆性强，生态可塑性大，因此红砂是研究抗逆机制的重要基因组荒漠模式植物。从红砂中提取高质量的RNA是研究红砂分子抗逆机制的重要前提，然而红砂叶片组织中含有大量的多糖、多酚等次级代谢物，给高质量红砂RNA的提取带来了很大的困难。因此摸索出一种高效提取红砂总RNA的技术方法为深入开展红砂分子抗逆机制具有重要的意义。刘玉冰等(中国沙漠，2006，26(4) :600-603)采用强离子型去污剂CTAB-SDS方法从红砂正常和脱水组织中获得总RNA，然而此方法从红砂叶片中反复多次提取总RNA时总有相当量的DNA污染，而每次再经DNA酶处理，大量的RNA又降解了，导致RNA的产量降低。王小华等人(Mol Biotechnol, 2011，48:165-172)披露了一种改进CTAB纯化方法，采用DNase去除DNA，酚去除蛋白质以及醋酸去除多糖，提出了一种CTAB-NaAc法。该方法能完全去除DNA等污染物，并且提高了总RNA的产量，但是，该方法操作步骤相对较多，耗时过长，产量相对偏低。

发明内容
鉴于上述提取RNA方法的不足，本发明的目的旨在提供一种荒漠植物红砂{Reaumuria soongorica (Pall. ) Maxim. ) RNA 的提取方法-CTAB-酸酌·法。本发明的目的是这样实现的
一种荒漠植物红砂RNA的提取方法，其步骤是
①取红砂叶片置于研钵中，在研钵里直接撒交联聚乙烯吡咯烷酮粉，研磨；
②将①研磨的粉末转移至离心管，加入65°C预热的十六烷基三甲基溴化铵提取缓冲液和β-巯基乙醇；
③将②中溶液润旋2min,65°C温浴8min,尔后,常温12000 rpm离心15 min ；
④取③中上清液，加等体积的氯仿和异戊醇，氯仿异戊醇体积比为24 1，混匀，18°C 12 000 rpm 离心 15 min ；
⑤取④中的上清液，加等体积的苯酚、氯仿和异戊醇，苯酚氯仿异戊醇体积比为25 24 1，抽提 I 次，18°C，12 000 r/min，离心 15 min ；
⑥取⑤上清液，加等体积的氯仿和异戊醇，氯仿异戊醇体积比为24 1，混匀，18°C12 000 rpm 离心 15 min ；
⑦取⑥上清液，向上清中加1/2体积预冷的无水乙醇和1/2体积的8mol/L LiCljg勻，冰浴30 min ；
⑧将⑦冰浴的溶液，在4°C12000 rpm离心10 min，倒掉上清液，加2体积预冷的无水乙醇和1/10体积3 mol/L、pH为5. 2的醋酸钠，混匀后置于_80°C冰箱中30 min后，4°C12 000 rpm 离心 15 min ；
⑨弃⑧中上清液，用体积浓度75%乙醇漂洗二次，4°C12 000 rpm离心15 min，收集沉淀，晾干，得纯净的核糖核酸样品，并溶于已高压灭菌处理的焦碳酸二乙酯水中。本发明的优点和产生的有益效果
I、操作简单，耗时少。第一，本发明独创性地在RNA分离开始阶段就加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇，使RNA处于离心管上层透明和半透明水相中，而残留的DNA、脂类、蛋白质将处于白色的中间层，大量DNA处于下层黄色酚相中；然后吸取上层水相到新的离心管中，利用选择性沉淀试剂高盐LiCl使RNA和DNA彻底分离。而在CTAB-NaAc法中，首先利用LiCl沉淀总RNA，在沉淀过程中由于存在大量DNA，因而会有少量DNA伴随RNA —起沉淀下来；这样就必须引入DNase I酶来清除残留的DNA,再用酹来清除DNase蛋白，还必须用氯仿及异戊醇来清除酚，这样形成了一个反复添加试剂的纯化过程，这些步骤都会影响总RNA产量和纯度。而新的提取方法一CTAB-酸酚法避免了 CTAB-NaAc法后期反复操作的纯化过程，减少了 RNA的不必要损失，提高RNA产量，简化了操作过程。第二，本发明通过独创性地在LiCl选择性地沉淀RNA过程中加入与LiCl等体积的无水乙醇，极大地加快了 RNA的沉淀，缩短了实验时间。采用CTAB-酸酚法提取RNA，全程只需I天时间，而采用CTAB-LiCl法实验周期较长，需要3天时间；采用CTAB-NaAc法需要2天时间。2、RNA损失少，产量高。第一，由于本发明独创性地在RNA分离开始阶段就加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇，避免了 CTAB-NaAc法后期反复操作的纯化过程，减少了 RNA的不必要损失，从而提高了 RNA产量；第二，本提取方法首次采用在材料研磨过程中直接撒PVPP粉在研钵里与冷冻材料一起研磨，有效抑制了在研磨过程中酚类物质氧化成醌类与RNA的结合，减少了 RNA的损失，提高RNA的产量。通过检测，CTAB-酸酚法提取的总RNA产量较CTAB-NaAc法提高30%多，较CTAB-LiCl法提高90% (见表I)
3、纯度高。荒漠植物红砂富含多酚、多糖、蛋白质等次级代谢物，并且在试验操作过程中又带入了 Li+、Cl—等离子物质，为了使提取的RNA纯度高，操作过程中首先在材料研磨时使用PVPP粉结合多酚进而通过氯仿/异戊醇抽提彻底去除多酚；通过使用高盐的CTAB缓冲液去除大部分多糖，并且通过后续的LiCl溶解多糖进一步去除，后期再用低温预冷的无水乙醇和醋酸钠沉淀，彻底去除残留多糖；通过使用酚/氯仿/异戊醇及氯仿/异戊醇的多次抽提而彻底去除蛋白质；试验过程中带入的微量Li+、Cl—干扰RNA的反转录和体外翻译，采用低温预冷的无水乙醇和醋酸钠沉淀，并结合75%的乙醇洗涤两次，有效去除离子的干扰。4、完整性好。采用CTAB-酸酚法提取红砂总RNA，不仅试验操作简单，耗时少，产量高，纯度高，而且RNA完整性好。对CTAB-酸酚法提取的RNA进行凝胶电泳检测，获得 两条明亮清晰的RNA条带，且28S条带的亮度约是18S的两倍(如图2);另外，用RNA进行RT-PCR反应，获得组氨酸蛋白激酶基因保守区约602 bp的一条明亮cDNA条带(如图3)。由于CTAB-酸酚法能彻底去除多糖、多酚、蛋白质、DNA及其它污染物，所提的RNA适合分子生物学的下游实验如反转录及基因扩增等，所以CTAB-酸酚法是提取红砂总RNA的最理想方法，为后续开展红砂分子克隆和基因表达分析等分子生物学实验奠定了基础。5、适用性强。本发明不仅能从红砂中提取出高质量的RNA，同时也适合于其它富含次级代谢物的荒漠植物RNA的高效提取，它具有广泛的应用价值，具有简单、省时和产量高、纯度高等优点。


图I为本发明CTAB-酸酚法提取红砂RNA操作流程图
图2为不同方法提取红砂叶片总RNA的电泳凝胶图，其中泳道l，CTAB-LiCl法；泳道2，CTAB-NaAc 法；泳道 3，CTAB-酸酚法。图3为CTAB-酸酚法所提红砂总RNA的RT-PCR反应的产物。
具体实施例方式下面结合附图，对本发明的技术方案再作进一步的说明。荒漠植物红砂高质量总RNA提取的试验技术的具体步骤如下
一、试验准备阶段
I、植物材料
挑选河西走廊荒漠中大小一致生长旺盛的红砂，取其叶片立即冻存于液氮，贮存在-80°C备用。2、试剂
十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、四乙酸乙二胺(EDTA)、焦碳酸二乙酯(DEPC)、b-巯基乙醇、醋酸钠、氯化锂购自美国Amresco公司，不含RNase的RQ DNase酶及交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP P 6755)购自美国Sigma 公司，Taq 酶(5 U/μ L)、dNTP (2. 5 mmol/L)、DL2000、Agarose 等购自天根公司,PrimeScriptTM RTase (200 U/μ L)购自TaRaKa大连宝生物有限公司，其他试剂均为国产分
析纯产品。3、RNA提取准备工作
RNase-free water: 0.1% DEPC处理24小时后高压灭菌的新鲜超纯水。提取试剂配制所用容器，提取所用研钵、药匙和研杵等用锡箔纸包好，于180°C烘箱高温烘烤4 h以上。制备RNA的离心管、枪头等用O. 1% DEPC浸泡12-24 h，于121 °C高压蒸汽灭菌20 min后烘干备用。所有试剂用RNase-free Water配制。用于RNA电泳的电泳槽和梳子的处理用去污剂清洗后,用水冲洗并用乙醇干燥，在装满3%的H2O2溶液，室温下处理10 min,用O. 1%的DEPC处理过的水彻底刷洗。操作过程中，带手套口罩，研磨迅速，避免RNA降解。4、溶液
CTAB 提取缓冲液3 % (w/v) CTAB,5% (w/v)PVPP (研磨时加入)，100 mM Tris-HCl(pH值8.0)，25 mM EDTA, 2 M NaCl和5 % (v/v) b_巯基乙醇(使用前加入)；氯仿异戊醇(24 I, v/v) ；10 M LiCl0所有溶液都用O. I % DEPC处理的超纯水制备并高压灭菌。二、RNA提取阶段
I、材料研磨
①取O.I g红砂叶片置于研钵中，在研钵里直接撒O. 01 g交联聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)粉，与红砂叶片一起研磨；
红砂叶片在研磨过程中会释放出大量的多酚，多酚氧化形成醌类物质而与RNA结合，可是红砂叶片硬而厚，研碎费时，这样就为多酚氧化形成醌类物质与RNA结合提供了更大的可能。为了避免多酚氧化成醌类物质而结合RNA，采用了在研磨过程中直接撒PVPP粉在研钵里与冷冻材料一起研磨的方法。PVPP粉作为多酚化合物的螯合剂，具有很强的结合酚能力。在此实验中特别提高了 PVPP粉和β -巯基乙醇的含量，使其浓度都达到5 %，β -巯基乙醇提供还原条件，二者协同作用，使得多酚类物质不易被氧化，而与PVPP充分结合形成螯合物。再通过后续的步骤抽提除去，有效抑制了酚类物质对RNA提取的影响。试验中使用PVPP而不用PVP，这是因为PVP是聚乙烯吡咯烷酮，水溶性好，可溶于各种有机溶剂，而PVPP是交联聚乙烯吡咯烷酮，是聚乙烯吡咯烷酮的交联聚合物，几乎不溶于任何溶剂。不溶性PVPP替代可溶性的PVP，有三个优势一)可溶性PVP与酚的抽提不兼容而干扰RNA沉淀；二)不溶性PVPP既能结合多酚，又能结合多糖，从而阻止核酸与多糖多酚结合而导致RNA产量减少，可溶性PVP粉只结合多酚而不结合多糖，从而不能去除多糖污染物；三)PVP粉的使用量受到限制，缓冲液PVP粉不能超过的1%，否则RNA的产量会显著地减少，而PVPP不受限制。2、抽提RNA，清除次级代谢物
②将①研磨的粉末转移至2ml的离心管，加入65°C预热、700 ml CTAB提取缓冲液和35 ml β-巯基乙醇；
③将②中溶液涡旋2min，65°C温浴8 min，尔后，常温(18°C )12000 rpm离心15 min ；④取③中上清液，加等体积的氯仿和异戊醇，氯仿异戊醇体积比为24 1，混匀，18°C 12 OOO rpm 离心 15 min ；
⑤取④中的上清液，加等体积的苯酚、氯仿和异戊醇，苯酚氯仿异戊醇体积比为25 24 1，抽提 I 次，18°C，12 000 r/min，离心 15 min ；
⑥取⑤上清液，加等体积的氯仿和异戊醇，氯仿异戊醇体积比为24 1，混匀，18°C12 000 rpm 离心 15 min ；
CTAB提取液中包含有较高浓度的CTAB (3%), NaCl (2M)，PVPP (5%)，β-巯基乙醇(5%)以及25 mM EDTA和100 mM Tris-HCl (pH值8. O)。CTAB是一种阳离子去污剂，能溶解细胞膜，对植物细胞具有较好的裂解作用，而且同巯基乙醇共同对蛋白质的强烈变性作用，使核酸从蛋白-核酸复合物中彻底被释放出来。在高离子浓度的NaCl溶液中(NaCl>0.7 mol/L)，释放出来的核酸与较高浓度的CTAB (3 % (w/v))形成可溶性的复合物，而变性蛋白质与CTAB形成不溶性的的复合物，随着氯仿的抽提蛋白质被去除；在高离子浓度的盐溶液中，CTAB作为一种RNase的抑制剂，保护RNA不被降解；细胞破裂后释放大量的多糖，高浓度的盐促使多糖、CTAB-核酸复合物的溶解，溶解的多糖与CTAB结合形成不容性的复合物，随着氯仿的抽提多糖被去除。同时，巯基乙醇不但可以作为强还原剂防止多酚氧化，还可以打断RNase的二硫键使之不可逆转地失活。提供pH值为8. O缓冲环境，能有效降低多酚物质在酸性条件下被氧化的几率。在RNA分离的开始阶段就加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇抽提，RNA将留在透明和半透明的上层水相中，残留的DNA、脂类、蛋白质将留在白色的中间层，大量DNA留在下层黄色酚相中，然后吸取上层水相到新的离心管中，再通过氯仿/异戊醇的抽提，将残留的苯酚去除(由于酚对后续分子操作过程RNA的运用有影响，如影响酶切、影响反转录)。这样将RNA与DNA分离，同时也去除了蛋白质、酚及其它残留杂质。在RNA分离开始阶段加酚能避免CTAB-NaAc法中反复纯化操作步骤=LiCl沉淀总RNA过程中杂带少量DNA及其它杂质，须引入DNase I酶来清除残留的DNA，引入酚来清除DNase蛋白，最后还需用氯仿及异戊醇来清除酚。而所有的这些操作都会影响总RNA提取的产量。因此改进的CTAB-酸酚法在RNA抽提的开始阶段就用酸酚抽提RNA，这样能替代CTAB-NaAc法后期阶段反复操作的纯化过程，从而简化操作过程，并且避免在反复的操作纯化过程中RNA的不必要损失。3、沉淀RNA，获取纯净RNA
⑦取⑥上清液，向上清中加1/2体积预冷的无水乙醇，1/2体积的8mol/L LiClJg勻，冰浴30 min ；
⑧将⑦冰浴的溶液，在4°C12000 rpm离心10 min，倒掉上清液，加2体积预冷的无水乙醇和1/10体积3 mol/L，pH为5. 2醋酸钠，混匀后置于_80°C冰箱中30min后，4°C 12000 rpm 离心 15 min ；
⑨弃⑧中上清液，用体积浓度为75%乙醇漂洗二次，4°C12 000 rpm离心15 min，收集沉淀，晾干，得纯净的核糖核酸(RNA)样品，溶于50 ml、质量浓度O. 1%已高压灭菌处理的焦碳酸二乙酯(DEPC)水中。LiCl沉淀RNA，实验周期较长，一般都需要至少2h以上的冰浴RNA才能沉淀。本方法通过在LiCl选择性地沉淀RNA过程中加入1/2体积的无水乙醇，加快了 RNA的沉淀速度，节省了实验时间；同时LiCl能溶解多糖，对残留的多糖能进一步去除。
红砂叶片中富含多糖，其成分以及理化性质和核酸很接近，不容易分离，尽管大量的多糖在RNA的抽提过程中被高盐的CTAB缓冲液已经去除以及后续的LiCl的进一步溶解多糖，但还是有极少量的多糖在LiCl的选择性沉淀RNA的过程中渗入到RNA水相中与RNA一起沉淀，而使抽提到的RNA中还含有极少量多糖的污染，所以后期再用低温预冷的无水乙醇和醋酸钠沉淀，这样可有效彻底去除残留多糖的干扰。另外，溶解的RNA中可能含有微量的Li+、C1_干扰RNA的反转录和体外翻译，而低温预冷的无水乙醇和醋酸钠沉淀，并用75%的乙醇洗涤两次，这样可有效去除离子的干扰。这样，经过对多酚、多糖、蛋白质及离子物质的有效去除，获得纯净的RNA样品。三、总RNA质量和产量检测阶段
I、完整性检测
每个样品中取3 ml总RNA溶液通过凝胶电泳检测其完整性，其它RNA样品保存在-80°C冰箱中。将I ml 5 X RNA缓冲液和3 ml总RNA溶液室温混合3 min，然后上样到 1%琼脂糖凝胶(已加EB)样孔中，在5-7 V/cm IX甲醛电泳缓冲液中跑胶30 min后，用全自动数码凝胶成像系统美国伯乐Gel Doc XR+拍照记录。 2、总RNA纯度和产量检测
取5 μ L RNA样品用DEPC水(pH 7. O)稀释500倍，混匀，用UV/VIS- 752N型紫外分光光度计测定OD26tl、OD280和OD23tl处的吸光值(以无RNase水为空白液调零)，计算RNA产量及纯度。总RNA产量计算根据公式RNA产量=40XOD26tlX稀释倍数X样品的体积(ml)/材料重(g)。RNA、蛋白质和多糖、多酚分别在126(|、I28tl和I23tl有最大的吸光值，常
A260/230、^260/280
的比值来表示RNA的纯度，A260/230> A2607280在I. 8 2. I表示RNA有较高的纯度，A26(i/23(i小于I. 8或大于2. I说明RNA有多糖、多酚污染，A26(i/28(i小于I. 8或大于2. I说明RNA有蛋白质污染。高质量总RNA的提取可通过所获得RNA的产量、纯度及完整性来判断。分别采用CTAB-LiCl、CTAB-NaAc法、CTAB-酸酚法提取红砂叶片中的总RNA，发现用CTAB-酸酚法所提RNA的产量显著高于其它两方法。CTAB-酸酚法所提RNA的产量是237. 76±64. 57 (mg/g)，高于 CTAB-NaAc 法产量(18L 35±42· 11 (mg/g))的 31%，几乎是 CTAB-LiCl 产量的 2 倍(见表I)。表I不同方法提取红砂叶片总RNA纯度和产量比较表
权利要求
1.一种荒漠植物红砂RNA的提取方法，其步骤是 ①取红砂叶片置于研钵中，在研钵里直接撒交联聚乙烯吡咯烷酮粉，研磨； ②将①研磨的粉末转移至离心管，加入65°C预热的十六烷基三甲基溴化铵提取缓冲液和β-巯基乙醇； ③将②中溶液润旋2min,65°C温浴8min,尔后,常温12000 rpm离心15 min ； ④取③中上清液，加等体积的氯仿和异戊醇，氯仿异戊醇体积比为24 1，混匀，18°C 12 000 rpm 离心 15 min ； ⑤取④中的上清液，加等体积的苯酚、氯仿和异戊醇，苯酚氯仿异戊醇体积比为 25 24 1，抽提 I 次，18°C，12 000 r/min，离心 15 min ； ⑥取⑤上清液，加等体积的氯仿和异戊醇，氯仿异戊醇体积比为24 1，混匀，18°C12 000 rpm 离心 15 min ； ⑦取⑥上清液，向上清中加1/2体积预冷的无水乙醇和1/2体积的8mol/L LiCljg勻，冰浴30 min ； ⑧将⑦冰浴的溶液，在4°C12000 rpm离心10 min，倒掉上清液，加2体积预冷的无水乙醇和1/10体积3 mol/L、pH为5. 2的醋酸钠，混匀后置于_80°C冰箱中30 min后，4°C12 000 rpm 离心 15 min ； ⑨弃⑧中上清液，用体积浓度75%乙醇漂洗二次，4°C12 000 rpm离心15 min，收集沉淀，晾干，得纯净的核糖核酸样品，并溶于已高压灭菌处理的焦碳酸二乙酯水中。
全文摘要
本发明涉及一种荒漠植物红砂RNA的提取方法，通过对红砂叶片撒PVPP研磨，将溶液离心，取上清液加等体积的氯仿和异戊醇，离心；再取上清液，加等体积的酚、氯仿和异戊醇，离心；取上清液再加等体积氯仿和异戊醇，再离心；取上清，向上清中加预冷的无水乙醇和LiCl，混匀，冰浴；再离心，倒掉上清液，加预冷的无水乙醇和醋酸钠，混匀后置于冰箱中，离心；弃上清，用75%乙醇漂洗二次，离心，收集沉淀，晾干，得纯净的RNA样品，溶于DEPC水中。本发明经过本发明对多酚、多糖、蛋白质及离子物质等次生代谢物的有效去除，获得纯净的RNA样品，并且产量高，耗时少，与现有方法相比，操作简单，RNA未受RNase(核糖核酸酶)的降解，完整性好。
文档编号C12N15/10GK102757953SQ20121020701
公开日2012年10月31日 申请日期2012年6月21日 优先权日2012年6月21日
发明者王小华, 肖洪浪, 肖生春, 赵亮, 邹松兵 申请人:中国科学院寒区旱区环境与工程研究所