专利名称：一种体外生产牦牛胚胎的方法
技术领域：
本发明属于牦牛繁殖领域，涉及牦牛胚胎生物技术，特别是涉及ー种体外生产牦牛胚胎的方法。
背景技术：
牦牛是青藏高原及其毗邻地区特有的遗传资源，是惟一能够充分利用高寒高山草原进行动物性生产的优势牛种，由于对高海抜地带严寒、缺氧、缺草等恶劣条件的良好适应能力而成为高寒牧区最基本的生产生活资料。但特殊的生态环境条件，使牦牛形成了晩熟、繁殖力低的生态生理特性，导致牦牛遗传进展缓慢、基因资源库贫乏。牦牛胚胎生物技术国内外还未有效开展，牛卵母细胞的成熟率、受精卵的卵裂率 和囊胚的体外发育率结果均不稳定，牦牛胚胎体外生产更是一片空白。极有必要针对牦牛生态生理特性与环境特征，研制出ー种体外生产牦牛胚胎的技术与方法，配合应用胚胎生物技术，全面发挥优良牦牛的繁殖特性。同时，可为牦牛基因资源库提供育种素材。
发明内容
本发明的目的在于建立体外生产牦牛胚胎的技术与方法，为牦牛胚胎生物技术的应用提供合理的技术路线，全面发挥优良牦牛遗传潜力，丰富牦牛遗传资源基因库。本发明的另一目的是为稀有的牦牛遗传资源保护，如野牦牛、天祝白牦牛，提供体外生产胚胎的技术与方法。本发明的技术方案为—种体外生产牦牛胚胎的方法，其步骤为(I)将采集的牦牛卵巢0_3h内用生理盐水30_38°C带回实验室，用抽吸法获取卵母细胞置于保存液中，保存液为PBS液添加聚こ烯醇O. 4mg/mL(防止细胞发生粘连)、牛血清白蛋白3mg/mL。(2)将卵母细胞用成熟液洗涤3次，培养27_28h。卵母细胞成熟液基础液为Mediuml99,并添加丙酮酸钠O. 2mmol/L,胎牛血清10%,促黄体素5mg/L,促卵泡素O. 5mg/L,雌ニ醇 lmg/L。(3)牦牛冷冻精液用改良的BO液上浮法处理。BO基础液由112. OmM氯化钠、4. 02mM氯化钾、O. 83mM磷酸ニ氢钠、O. 52mM氯化镁、2. 25mM氯化钙、13. 9mM葡萄糖及抗生素(75mg/L青霉素+50mg/L链霉素)组成。上浮法步骤为将1_4支牦牛冷冻精液细管于38°C水浴解冻，解冻后的精液加入盛有I. 0-1. 5mL BO获能液的离心管底部，在C02培养箱中倾斜30-45°放置，使精子上浮。上浮Ih后，吸取上清液O. 5-1. 2mL,用洗精液离心洗涤两次(800g离心8-10min)，再用获能液上浮25_35min。获能液由BO基础液添加3. 108g/L碳酸氢钠、O. 138g/L丙酮酸钠、IOmM咖啡因、3mg/mL牛血清白蛋白组成。(4)步骤⑶处理的精子(O. 5-2X IO6个/mL)移入受精液中，受精液中含步骤(2)处理的卵母细胞。受精液由BO基础液添加3. 108g/L碳酸氢钠、O. 138g丙酮酸钠、6mg/mL牛血清白蛋白、2mg/mL肝素组成。(5)受精16_18h后，用O. 2%透明质酸酶溶解卵丘细胞1-2分钟，然后Voatex (漩涡震荡)，脱除卵丘细胞。(6)将步骤(5)处理的受精卵移入颗粒细胞共培养体系中，每隔48h换1/2体积的培养液，培养144-168h后收集牦牛胚胎。培养液为基础液M199添加10%胎牛血清。颗粒细胞共培养体系制备方法采集完卵母细胞后，取检卵平皿中剰余的含颗粒细胞的卵泡液lmL，加2mL0. 2%透明质酸酶消化3_5min，用等量培养液终止消化后，200g离心5min，沉淀用5mL培养液再次悬浮,200g离心5min,最終的沉淀用培养液悬浮,用移液器将悬浮液加入培养液滴中，其最终浓度为IO6个/mL。本发明体外生产牦牛胚胎的技术參数为C02含量5% ，温度38. 50C ;湿度饱和。
本发明体外生产牦牛胚胎的技术与方法与已有黄牛、奶牛胚胎生产技术与方法相比，具有以下特点(1)胚胎生产各技术环节操作时间不同，适宜高海抜地区牦牛胚胎体外生产；(2)成熟液、受精液依掘牦牛自身生态生理特性而配制；(3)牦牛成熟卵母细胞受精后，经透明质酸酶处理，有利于受精卵的早期发育；同时，建立的颗粒细胞共培养系统有效的克服了牦牛早期胚胎发育阻滞；(4)本技术对天祝白牦牛、野牦牛等优良品种遗传资源的保存与利用提供了技术途径。
图I为卵母细胞及胚胎不同发育时期參照图，其中，A :未成熟卵母细胞(d-1)，B :成熟卵母细胞(d0)，C 2细胞期胚胎(dl-2)，D 4细胞期胚胎(d2)，E 8细胞期胚胎(d2-3)，F 8-16细胞期胚胎(d3)，G :> 16细胞期胚胎(d3_4)，H :紧实桑椹胚(d4_5)，I 紧实桑椹胚-早期囊胚(d5-6)，J :早期囊胚(d6-7)，K :囊胚(d7-8)，L :孵化囊胚(d8_9)。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例一体外生产50枚以内牦牛胚胎。(I)将采集的牦牛卵巢0_2h内用生理盐水32_38°C带回实验室，用抽吸法获取卵母细胞(图1-A)置于保存液中，保存液为PBS液添加聚こ烯醇O. 4mg/mL、牛血清白蛋白jmg/mL0(2)将卵母细胞用卵母细胞成熟液洗涤3次，用成熟液在35mmX IOmm培养皿中制备5个50 μ L的培养液微滴，覆盖石蜡油。培养28h后，卵母细胞形态见图1-Β。卵母细胞成熟液基础液为Mediuml99，并添加丙酮酸钠O. 2mmol/L,胎牛血清10 %，促黄体素5mg/L，促卵泡素O. 5mg/L,雌ニ醇lmg/L。(3)牦牛冷冻精液用改良的BO液上浮法处理。上浮法步骤为将I支牦牛冷冻精液细管于38°C水浴解冻，解冻后的精液加入盛有I. OmL BO获能液的离心管底部，在C02培养箱中倾斜30-45°放置，使精子上浮。上浮Ih后，吸取上清液0.5-0. 8mL，用洗精液离心洗涤两次(800g离心8-10min)，再用获能液上浮25_35min。获能液由BO基础液添加
3.108g/L碳酸氢钠、O. 138g/L丙酮酸钠、IOmM咖啡因、3mg/mL牛血清白蛋白組成。BO基础液由112. OmM氯化钠、4. 02mM氯化钾、O. 83M磷酸ニ氢钠、O. 52mM氯化镁、2. 25mM氯化钙、13. 9mM葡萄糖及抗生素(75mg/L青霉素+50mg/L链霉素)组成。(4)步骤(3)处理的精子(O. 5X IO6个/mL)移入50 μ L受精液中，受精液中含步骤(2)处理的卵母细胞。受精液由BO基础液添加3. 108g/L碳酸氢钠、O. 138g丙酮酸钠、6mg/mL牛血清白蛋白、2mg/mL肝素组成。(5)受精16_18h后，用O. 2%透明质酸酶溶解卵丘细胞1-2分钟，然后Voatex (漩涡震荡)，脱除卵丘细胞。(6)将步骤(5)处理的受精卵移入颗粒细胞共培养体系中，每隔48h换1/2体积的培养液，第2天换液时，可观察到2细胞期胚胎(图1-C)、4细胞期胚胎(图1-D)、8细胞期胚胎(图トE)，培养144-168h后收集牦牛胚胎(图1-1，1-J，トK)。培养液为基础液M199 添加10%胎牛血清。颗粒细胞共培养体系制备方法采集完卵母细胞后，取检卵平皿中剩余的含颗粒细胞的卵泡液lmL，加2mL0. 2%透明质酸酶消化3_5min，用等量培养液终止消化后，200g离心5min,沉淀用5mL培养液再次悬浮,200g离心5min,最終的沉淀用培养液悬浮，用移液器将悬浮液加入培养液滴中，其最終浓度为IO6个/mL。实施例ニ 体外生产100枚牦牛胚胎。(I)将采集的牦牛卵巢0_3h内用生理盐水30_37°C带回实验室，用抽吸法获取卵母细胞置于保存液中，保存液为PBS液添加聚こ烯醇O. 4mg/mL、牛血清白蛋白3mg/mL。(2)用成熟液在60mmX 15mm培养皿中制备6个100 μ L的培养液微滴，覆盖石蜡油。将卵母细胞用成熟液洗涤3次，20-30个/滴，培养28h。卵母细胞成熟液基础液为Mediuml99,并添加丙酮酸钠O. 2mmol/L,胎牛血清10%,促黄体素5mg/L,促卵泡素O. 5mg/L,雌ニ醇 lmg/L。(3)牦牛冷冻精液用改良的BO液上浮法处理。BO基础液由112. OmM氯化钠、
4.02mM氯化钾、O. 83mM磷酸ニ氢钠、O. 52mM氯化镁、2. 25mM氯化钙、13. 9mM葡萄糖及抗生素(75mg/L青霉素+50mg/L链霉素)组成。上浮法步骤为将2支牦牛冷冻精液细管于38°C水浴解冻，解冻后的精液加入盛有I. 2mL BO获能液的离心管底部，在C02培养箱中倾斜30-45°放置，使精子上浮。上浮Ih后，吸取上清液O. 8-1. OmL，用洗精液离心洗涤两次(800g离心8-10min)，再用获能液上浮25_35min。BO获能液由BO基础液添加3. 108g/L碳酸氢钠、
O.138g/L丙酮酸钠、IOmM咖啡因、3mg/mL牛血清白蛋白組成。(4)步骤(3)处理的精子(I X IO6个/mL)移入100 μ L受精液微滴中，受精液中含步骤⑵处理的卵母细胞。受精液由BO基础液添加3. 108g/L碳酸氢钠、O. 138g丙酮酸钠、6mg/mL牛血清白蛋白、2mg/mL肝素组成。(5)受精16_18h后，用O. 2%透明质酸酶溶解卵丘细胞1-2分钟，然后Voatex (漩涡震荡)，脱除卵丘细胞。(6)将步骤(5)处理的受精卵移入颗粒细胞共培养体系中，每隔48h换1/2体积的培养液，第3天换液时，可观察到8细胞期胚胎(图1-E) ,8-16细胞期胚胎(图1-F)、>16细胞期胚胎(图1-G)，培养144-168h后收集牦牛胚胎(图1_J，1_K)。培养液为基础液Μ199添加10%胎牛血清。颗粒细胞共培养体系制备方法采集完卵母细胞后，取检卵平皿中剰余的含颗粒细胞的卵泡液lmL，加2mL0. 2%透明质酸酶消化3_5min，用等量培养液终止消化后，200g离心5min,沉淀用5mL培养液再次悬浮,200g离心5min,最終的沉淀用培养液悬浮，用移液器将悬浮液加入培养液滴中，其最終浓度为IO6个/mL。实施例三体外生产150枚牦牛胚胎。(I)将采集的牦牛卵巢0_3h内用生理盐水32_37°C带回实验室，用抽吸法获取卵母细胞置于保存液中，保存液为PBS液添加聚こ烯醇O. 4mg/mL、牛血清白蛋白3mg/mL。(2)将卵母细胞用成熟液洗涤3次，移入含成熟液ImL/孔的四孔培养板中，覆盖石蜡油，每孔30-50个卵母细胞，培养27-28h。卵母细胞成熟液基础液为Mediuml99，并添加丙酮酸钠O. 2mmol/L,胎牛血清10%,促黄体素5mg/L,促卵泡素O. 5mg/L,雌ニ醇lmg/L。(3)牦牛冷冻精液用改良的BO液上浮法处理。BO基础液由112. OmM氯化钠、
4.02mM氯化钾、O. 83mM磷酸ニ氢钠、O. 52mM氯化镁、2. 25mM氯化钙、13. 9mM葡萄糖及抗生素(75mg/L青霉素+50mg/L链霉素)组成。上浮法步骤为将3支牦牛冷冻精液细管于38°C水浴解冻，解冻后的精液加入盛有I. 5mL BO获能液的离心管底部，在C02培养箱中倾斜30-45°放置，使精子上浮。上浮Ih后，吸取上清液1.0-1. 2mL，用洗精液离心洗涤两次(800g离心8-10min)，再用获能液上浮25_35min。BO获能液由BO基础液添加3. 108g/L碳酸氢钠、
O.138g/L丙酮酸钠、IOmM咖啡因、3mg/mL牛血清白蛋白組成。(4)步骤(3)处理的精子(2X IO6个/mL)移入ImL受精液中，受精液中含步骤⑵处理的卵母细胞。受精液由BO基础液添加3. 108g/L碳酸氢钠、O. 138g丙酮酸钠、6mg/mL牛血清白蛋白、2mg/mL肝素组成。(5)受精16_18h后，用O. 2%透明质酸酶溶解卵丘细胞1-2分钟，然后Voatex (漩涡震荡)，脱除卵丘细胞。(6)将步骤(5)处理的受精卵移入颗粒细胞共培养体系中，每隔48h换1/2体积的培养液，第5天换液时，可观察到紧实桑椹胚(图l-Η)、紧实桑椹胚-早期囊胚(图1-1)，培养168h后收集牦牛胚胎(图1-K)，培养192h后，可观察到孵化囊胚(图1-L)。培养液为基础液M199添加10%胎牛血清。颗粒细胞共培养体系制备方法采集完卵母细胞后，取检卵平皿中剩余的含颗粒细胞的卵泡液lmL，加2mL0. 2%透明质酸酶消化3_5min，用等量培养液终止消化后，200g离心5min,沉淀用5mL培养液再次悬浮,200g离心5min,最終的沉淀用培养液悬浮，用移液器将悬浮液加入培养液滴中，其最終浓度为IO6个/mL。本发明不限于以上实施例，按照本发明技术方案的各种组合也是本发明所要保护的内容。
权利要求
1.一种体外生产牦牛胚胎的方法，其特征在于，包括如下步骤 (1)将采集的牦牛卵巢0-3h内用生理盐水30-38°C带回实验室，用抽吸法获取卵母细胞置于保存液中； (2)将卵母细胞用成熟液洗涤3次，培养27-28h； (3)牦牛冷冻精液用改良的BO液上浮法处理； (4)步骤(3)处理的精子移入受精液中，受精液中含步骤(2)处理的卵母细胞； (5)受精16-18h后，用O.2%透明质酸酶溶解卵丘细胞l-2min，然后Voatex漩涡震荡，脱除卵丘细胞； (6)将步骤(5)处理的受精卵移入颗粒细胞共培养体系中，每隔48h换1/2体积的培养液，培养144-168h后收集牦牛胚胎。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述体外生产牦牛胚胎的技术参数为CO2含量5% ;温度38. 5 0C ;湿度饱和。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中的保存液为PBS液添加聚乙烯醇O. 4mg/mL、牛血清白蛋白3mg/mL。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中卵母细胞成熟液基础液为Mediuml99,并添加丙酮酸钠O. 2mmol/L,胎牛血清10%,促黄体素5mg/L,促卵泡素O. 5mg/L,雌二醇 lmg/L。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中上浮法步骤为将1-4支牦牛冷冻精液细管于38°C水浴解冻，解冻后的精液加入盛有I. 0-1. 5mL BO获能液的离心管底部，在CO2培养箱中倾斜30-45°放置，使精子上浮；上浮Ih后，吸取上清液O. 5-1. 2mL,用洗精液离心洗涤两次，再用获能液上浮25-35min ;所述获能液由BO基础液添加3. 108g/L碳酸氢钠、O. 138g/L丙酮酸钠、IOmM咖啡因、3mg/mL牛血清白蛋白组成；所述BO基础液由112. OmM氯化钠、4. 02mM氯化钾、O. 83mM磷酸二氢钠、O. 52mM氯化镁、2. 25mM氯化钙、13. 9mM葡萄糖及抗生素组成；所述抗生素为75mg/L青霉素+50mg/L链霉素；所述0)2培养箱中C02含量5% ;温度38. 5 0C ;湿度饱和。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，受精液由BO基础液添加·3.108g/L碳酸氢钠、O. 138g丙酮酸钠、6mg/mL牛血清白蛋白、2mg/mL肝素组成。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤￠)中，培养液为基础液M199添加10%胎牛血清；颗粒细胞共培养体系制备方法采集完卵母细胞后，取检卵平皿中剩余的含颗粒细胞的卵泡液ImLjp 2mL0. 2%透明质酸酶消化3_5min，用等量培养液终止消化后，200g离心5min,沉淀用5mL培养液再次悬浮,200g离心5min,最终的沉淀用培养液悬浮，用移液器将悬浮液加入培养液滴中，其最终浓度为IO6个/mL。
全文摘要
本发明公开了一种体外生产牦牛胚胎的方法，由下述时间点控制卵巢保存时间0-3h，卵母细胞成熟时间27-28h，成熟卵母细胞体外受精时间16-18h，受精卵培养时间144-168h。并提供了牦牛卵母细胞成熟液、卵母细胞体外受精液的基本组成，确保体外生产胚胎的质量和效率，防止卵母细胞不完全成熟或多精受精。该技术与方法全面，可完全应用于牦牛胚胎体外生产，能够有效提高牦牛的繁殖效率，保护牦牛种质资源。
文档编号C12N5/073GK102703378SQ201210206870
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月12日 优先权日2011年12月6日
发明者丁学智, 包鹏甲, 朱新书, 梁春年, 裴杰, 褚敏, 郭宪, 阎萍 申请人:中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所