专利名称：一种海水中四环素抗性基因的检测方法
技术领域：
本发明属于水环境污染物的检测技术领域，具体涉及一种海水中新型污染物-抗生素抗性基因tet的检测方法。
背景技术：
医疗和养殖中抗生素的大量使用，使抗生素通过生活污水和养殖废水途径进入水环境，环境中生物或细菌因此产生耐药性基因。耐药基因的传播导致耐药性可能从非致病菌转移到致病细菌，并进一步传播、发展成生态层次上的耐药性，而使没有接触到抗生素的个体也产生耐药性。Pruden等人(2006)首先将抗生素抗性基因
(AntibioticResistanceGenes, ARGs)作为一种新型“环境污染物”提出。由于ARGs在生物体内可能长久而持续地传播，即使携带ARGs的细胞被杀灭或消亡，它释放到环境中的DNA因受脱氧核糖核酸酶的保护而仍然存在，并最终可能转移给其它细胞，因此，ARGs在环境中的持久性残留、菌群间的迁移、转化和传播，比抗生素残留本身对环境生态的危害更大。近海环境中城市污水和养殖用水的大量排入，使抗性基因容易扩散进入海水环境并传播给海水环境中微生物，获得了耐药性的微生物可能通过接触、食物等多种方式传播进入人体，对人类健康和水生生态系统安全构成巨大威胁。但迄今为止，抗生素抗性基因作为一类新型环境污染物在我国海洋生态环境监测中还尚未将引起足够重视，有关海水环境中的抗生素抗性基因污染检测方法极为薄弱。四环素类抗生素是一种被广泛用于人和动物的的细菌性感染的抗生素，此外，还被大量用作促生长剂投喂给动物，因而四环素抗性基因(tet)是水体中抗生素抗性基因污染的一种重要种类，但是目前海水中四环素抗性基因(tet)检测还无系统成熟的方法。为保护海洋生态系统和保障人类自身健康，建立海水中四环素抗性基因(tet)的检测方法，对海洋环境新型污染物ARGs进行监测是十分必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种海水中新型污染物-抗生素抗性基因tet的检测方法，通过PCR方法来检测，其特征在于通过以下步骤来实现( I)海水样品的采集及处理以中速定量滤纸(孔径30 50 μ m)抽滤待测海水样品1L，除去海水中较大颗粒杂质，所得滤液用O. 22 μ m滤膜过滤，保留O. 22 μ m孔径滤膜作为待测样品。(2 )提取水样中DNA滤膜剪碎，置于I. 5ml离心管，加入SDS裂解液(5. 5% SDS, O. 125mg/ml蛋白酶K)60°C温育2小时，以酚-氯仿-异戊醇溶液(25:24: l，v/v/v)抽提两遍，二倍体积乙醇加十分之一体积醋酸钠_20°C沉淀I小时，离心，TE溶解，_20°C保存备用。(3) PCR扩增区域与引物序列PCR扩增检测选取决定四环素类抗药机制的两类主要蛋白-外输泵蛋白和核糖体保护蛋白基因。引物tet-AF:GCGCTNTATGCGTTGATGCA和tet-AR:ACAGCCCGTCAGGAAATT扩增四环素抗性基因-外输蛋白基因tet (A)的387bp序列；弓丨物 tet-MF: ACAGAAAGCTTATTATATAAC 和 tet_MR: TGGCGTGTCTATGATGTTCAC 扩增四环素抗性基因-核糖体保护蛋白基因tet (M)的17Ibp序列。(4) PCR扩增体系与条件PCR反应体系为25 μ L的反应体系包含50ng的模板，O. 2mMdNTP,正反向引物分别O. 4μΜ, IUTaq 酶，2. 5μ 10 Xbuffer0 反应条件为94°C预变性 5min ;94°C变性 30s，55。。复性30s，72°C延伸30s，进行30个循环；4°C保温。(5)结果检测PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，tet (A)弓丨物对和tet (M)弓丨物对分别产生
387bp和171bp清晰条带，如图I所示，四环素抗性基因得到阳性扩增，说明海水中具有抗四环素抗性基因污染。
图I为四环素抗性基因PCR产物电泳图，M :分子量标准；I tet(A) ；2 tet (M) ；N 阴性对照；图2为四环素抗性基因tet (A) PCR电泳结果，M :分子量标准；S1_S5 :水样S1-S5 ；N :阴性对照；图3为四环素抗性基因tet (M) PCR电泳结果，M :分子量标准；S1_S5 :水样S1-S5 ；N :阴性对照。
权利要求
1.一种海水中四环素抗性基因tet的检测方法，其特征在于，取IL待测海水样品，两次抽滤，采用SDS法提取水样中DNA，采用PCR法对外输泵蛋白tet (A)和核糖体保护蛋白基因tet (M)进行检测，检测得到387bp和171bp的扩增带谱。
2.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，所述两次抽滤是以孔径30 50μπι的中速定量滤纸抽滤待测海水样品1L，除去海水中较大颗粒杂质,所得滤液用O. 22 μ m滤膜过滤，保留O. 22um孔径滤膜作为待测样品。
3.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，所述采用SDS法提取水样中DNA的方法为滤膜剪碎，置于I. 5ml离心管，加入SDS裂解液60°C温育2小时，以酚-氯仿-异戊醇溶液抽提两遍，二倍体积乙醇加十分之一体积醋酸钠-20°C沉淀I小时，离心，TE溶解，-20°C保存备用，其中SDS裂解液含有5. 5% SDS (W/V)和O. 125mg/ml蛋白酶K，酚-氯仿-异戊醇溶液中酚氯仿异戊醇的体积比为25:24:1。
4.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，所述采用PCR法对外输泵蛋白tet (A)和核糖体保护蛋白基因tet(M)进行检测时使用的引物为 弓丨物tet-AF:核苷酸序列为GCGCTNTATGCGTTGATGCA和引物tet_AR:核苷酸序列为ACAGCCCGTCAGGAAATT扩增四环素抗性基因-外输蛋白基因tet (A)的387bp序列；引物tet-MF:核苷酸序列为ACAGAAAGCTTATTATATAAC和tet_MR:核苷酸序列为TGGCGTGTCTATGATGTTCAC扩增四环素抗性基因-核糖体保护蛋白基因tet (M)的171bp序列。
5.根据权利要求I所述的检测方法，其特征在于，所述PCR的反应体系为25μL的反应体系，具体包含50ng的模板，O. 2mM dNTP，正反向引物分别O. 4μΜ，IU Taq酶，2. 5μ IOXbuffer ;反应条件为94°C预变性 5min，94°C变性 30s，55°C复性 30s，72°C 延伸 30s，进行30个循环，4°C保温。
全文摘要
本发明公开了一种海水中四环素抗性基因的检测方法，步骤为取1L海水样品，分别以中速定量滤纸和0.22μm 微孔滤膜抽滤，留取0.22μm 微孔滤膜作为检测样本， SDS法提取DNA，采用PCR法对外输泵蛋白tet(A)和核糖体保护蛋白基因tet(M)进行检测，引物序列分别为tet-AF: GCGCTNTATGCGTTGATGCA和tet-AR: ACAGCCCGTCAGGAAATT； tet-MF: ACAGAAAGCTTATTATATAAC和tet-MR: TGGCGTGTCTATGATGTTCAC，得到387bp和171bp的扩增带谱。检测结果电泳阳性，说明海水中含有四环素抗性基因。本方法为海洋环境新型污染物ARGs的检测提供了方法。
文档编号C12Q1/68GK102876772SQ201210205120
公开日2013年1月16日 申请日期2012年6月20日 优先权日2012年6月20日
发明者任利华, 孙国华, 刘爱英, 刘丽娟, 姜向阳, 宋秀凯, 姜会超 申请人:山东省海洋水产研究所