专利名称：一种刺参速生性状相关srap标记的筛选方法
技术领域：
本发明属于刺參DNA分子遗传标记技术，具体涉及ー种刺參速生性状相关SRAP标记的筛选和检测方法。
背景技术：
刺參(Apostichopus japonicus)隶属棘皮动物门、海參纲、楣手目、刺參科，是我国重要的海水养殖经济种类。筛选培育具有优势生长良性状、抗病能力强、抗逆性好的优良品种，是解决目前刺參种质退化、生长缓慢、病害多发等问题，保持刺參养殖业持续健康发展的迫切需要。现代分子标记技术的飞速发展，为传统刺參遗传育种提供了有效的辅助和途径。序列相关扩增多态性(SequenceRelated Amplifted Polymorphism, SRAP)是一 种基于PCR的分子标记系统，是2001年由Li和Quiros博士提出的新一代分子标记。它针对基因外显子里GC含量丰富而启动子和内含子里AT含量丰富的特点来设计引物进行扩增，因不同个体的内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性。SRAP标记，具有简便、中等产量、高共显性、重复性、易于分离条带及测序等优点，适合基因定位、基因克隆、遗传图谱构建等生物学研究。遗传改良或品种培育是刺參养殖稳定发展的动力，随着对刺參快速生长品系的选育工作和刺參分子生物学研究工作不断深入，对刺參优势性状相关分子标记的需求也越来越迫切。开发筛选与刺參优势生长性状相关的标记，能够在刺參育种工作中对有关性状的遗传动态进行跟踪，从而大大增强人们对刺參优势生长性状的遗传操纵能力，最終实现分子标记辅助选择，加快性状遗传进展，培育出具有快速生长性状的刺參新品种。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种刺參速生性状相关SRAP标记的筛选方法，为刺參数量性状定位提供分子标记和方法。本发明通过对经过选育具有快速生长性状的速生F (fast)组刺參30头和普通野生S (slow)组刺參30头为材料，提取DNA，采用分离群体混合分析BSA法和SRAP技术相结合，利用17条上游引物，20条下游引物(表1)，共340对引物组合分别对10头具有快速生长性状的速生组刺參基因组和10头普通野生组刺參基因组混合的基因池进行扩増，PCR扩增产物用8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染，得到具有差异扩增条带的引物组合R)6-R10、R)8-R03、F11-R11(图I)。差异条带引物组合以相同条件分别在60个刺參个体中进行扩增，差异条带在速生F组出现频率明显闻于普通S组,所得差异条带06-10-A、08-03-B、11-11-C为刺參速生性状相关SRAP标记。
图I :具有差异条带引物组合聚丙烯酰胺电泳图，A:06-10-A ;B:08-03-B ；C:ll-ll-Co
具体实施例方式下面对本发明做进ー步详细说明。I、刺參基因组DNA的提取及检测提取刺參F组和S组各30头，剖取获得纵肌lOOmg，液氮研磨，加入700ml CTAB提取缓冲液(100mmol/L Tris-HCl,pH 8. 0,20mmol/L EDTA_Na2，I. 4mol/L NaCl，2%CTAB，
0.1%β-巯基こ醇)和终浓度为 οομ g/ml蛋白酶K，55°C消化3h或37°C过夜，等体积酚氯仿(酚氯仿=1 :1)、氯仿抽提，二倍体积こ醇沉淀，TE溶解，紫外分光光度计定量，-20°C保存备用。2> BSA (Bulked Segregant Analysis)分池及基因池的 PCR 扩增 取F组和S组中10个体基因组各5 μ I DNA溶液混合构成相应的F池和S池。利用17条上游引物，20条下游引物(表1，SEQ ID NO. 1_37)，共340对引物组合分别对两个池DNA进行PCR扩增，寻找差异条带。PCR反应体系为25 μ L的反应体系包含IOOng的模板，0.2mM dNTP，0. 4μΜ引物(正反向分別)，IU Taq酶，2.5yL IOXbuffer0反应条件为94°C预变性5min ;94°C变性lmin，35°C复性lmin，72°C延伸Imin，进行5个循环；94°C变性lmin,50°C复性 Imin, 72°C 延伸 Imin, 30 个循环；72°C延伸 5min,4°C保温。表I SRAP引物序列表Tab. I The sequences of SRAP primers
权利要求
1.一种刺参速生性状相关SRAP标记的筛选方法，其特征在于，操作步骤为以具有快速生长性状的速生F(fast)组刺参30头和普通野生S(slow)组刺参30头为材料，提取刺参基因组DNA，采用分离群体混合分析BSA法和SRAP技术相结合，共340对引物组合分别对两个池DNA进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳，筛选得到在F组个体中出现频率明显高于在S组个体中出现频率的差异条带。
2.如权利要求I所述的筛选方法，其特征在于，所述差异条带的引物组合为H)6-R10、R)8-R03、F11-R11，差异条带为 06-10-A、08-03-B、ll-ll-C。
3.为从F组刺参基因组和S组刺参基因组中各取样本10个，每个取5 u LDNA溶液混合构成相应的F混合基因池和S混合基因池。
4.如权利要求I所述的筛选方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系为25yL，包含 IOOng 的模板，0. 2mM dNTP，正反引物分别 0. 4 y M，IU Taq 酶，2.5yL IOXbuffer ;反应条件为-MV预变性5min ；94°C变性lmin，35°C复性lmin，72°C延伸lmin，进行5个循 环；94°C 变性 lmin，50°C 复性 lmin，72°C 延伸 lmin，30 个循环；72°C 延伸 5min，4°C 保温。
全文摘要
本发明公开了一种刺参速生性状相关SRAP标记的筛选方法，通过以经过选育具有快速生长性状的速生F(fast)组刺参30头和普通野生S(slow)组刺参30头为材料，采用分离群体混合分析BSA法和SRAP技术相结合，利用340对引物组合分别对速生F组和普通S组混合基因池进行扩增，PCR扩增产物变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到具有差异扩增条带的引物组合F06-R10、F08-R03、F11-R11，差异条带06-10-A、08-03-B、11-11-C在速生F组出现频率明显高于普通S组，为刺参速生性状相关SRAP标记。本发明提供的筛选方法刺参优势性状相关分子标记的开发提供了方法，为刺参数量性状定位及分子标记辅助刺参育种提供了分子标记资源。
文档编号C12Q1/68GK102732624SQ20121020443
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月20日 优先权日2012年6月20日
发明者任利华, 刘相全, 孙国华, 杨建敏, 王卫军 申请人:山东省海洋水产研究所