专利名称：一种山羊无角间性(pis)有害基因的检测方法
技术领域：
本发明属分子遗传及家畜育种领域，具体涉及ー种山羊无角间性有害基因的检测方法。
背景技术：
在畜牧业生产实践中，人们很早就接触到了家畜的两性畸形现象，猪、牛、绵羊、马、犬等都有报道。山羊是所有家畜中两性畸形或间性发生率最高的家畜。通常把间性分为真两性畸形和假两性畸形两大类。真两性畸形山羊性腺为卵睾体，有类似不发育的苗勒氏管和沃弗氏管残留，有似阴茎的阴蒂，无阴囊。雄性假两性畸形山羊的遗传性别为雄性，不育，表型介于雌雄之间，有睾丸。雌性假两性畸形山羊外表特征为雄性，遗传性别是雌性，生殖器官为间性。间性山羊的产生给奶山羊产业带来了巨大的危害和经济损失。 1939年，Eaton等首次对萨能和吐根堡奶山羊的间性率进行统计，发现无角山羊的子代中，有57. 68%是正常雄性，36. 15%为正常雌性，6. 17%为间性，而有角山羊则无间性发生。因此，认为无角与雌性假两性畸形密切相关，井指出山羊无角间性综合征(Polled IntersexSyndrome, PIS)为常染色体隐性遗传病。山羊是家畜中体格最小的反刍动物，具有适应干旱、半干旱、山区等多种环境的能力。它为人类提供产品的历史比牛和绵羊还要长。全世界有8.7亿只山羊，为人类生产1160. 9万吨山羊奶和581. I万吨山羊肉等畜产品(FAO Database 2009)。不同国家，不同品种山羊中均有间性发现。解决间性山羊问题成为许多研究者关注的重点和难点。山羊奶不仅营养丰富，而且脂肪球小，酪蛋白结构与母乳相似，比牛奶易为人体吸收，其特别适合老人、儿童、体弱人群，以及对牛奶过敏和溃疡病人食用。最近其产量一直維持在120亿吨以上的水平(FAO Database 2009)，降低奶山羊的间性发生率具有十分重要的意义。自1939年首次对奶山羊的间性率进行统计以来，直到2001年Pailhoux研究发现一段位于lq43上的长约11. 7kb片段的缺失导致了(PIS)。随后以PIS基因为研究基础的性别发育机制成为研究热点，然而它对性别发育的影响并不如当初预料的那样广泛。尽管研究已经确定11. 7KB，但是由于这段序列的复杂性，很多研究者将重点放在了 PIS的定位及其形成的分子机理上，在遗传及家畜育种领域却没有人利用PCR扩增技术将PIS的三种基因型进行判别和应用。本发明从分子遗传鉴别入手，g在建立一种简便快捷的奶山羊PIS遗传缺陷基因的检测方法，为筛选PIS遗传缺陷基因携帯者及间性山羊提供技术手段，为间性山羊的淘汰奠定应用基础，以期为奶山羊生产带来可观的经济效益。
发明内容
本发明的目的是为了提供ー种简便、高效、准确、快速检测无角间性(PIS)有害基因的方法，包括以下步骤
I)引物设计
本发明涉及的引物分为两部分遗传性别判定引物(SRY-F/R、GAPDH-F/R)和PIS遗传缺陷基因型鉴定引物(Pis二F/R、PIS+-F/R和NEI-F/R)。引物设计利用Primer Premier
5.O软件。两对遗传性别判定引物设计分别参考SRY序列(JN561348 )和GAPDH序列 (NMJ)01190390)。PIS遗传缺陷基因型鉴定引物参考AF404302序列设计。在I号染色体11. 7kb的缺失区内设计引物PIS—，其扩增片段大小为141bp。在跨缺失区的上下游设计引物PIS+。 PCR过程中受聚合酶作用的限制以及PCR程序中延伸温度的设定时间等影响，若待检测个体11. 7kb片段未缺失，那么将得不到PIS+的扩增产物；若待检测个体的两条同源染色体中的一条或两条缺失了 11. 7kb片段，可得到449bp的扩增产物。在缺失区下游设计对照引物 NEI，其扩增片段大小为300bp。其中，PIS遗传缺陷基因型鉴定引物在染色体上的位置如附图I所示；所有引物具有附图2所示的序列信息。2)遗传性别判定
绝大部分间性山羊的遗传基础是雌性，本发明首先对被鉴定样本进行遗传性别判定。 利用复合PCR技术同时扩增SRY和GAPDH基因片段，通过检测扩增产物中两个特异性片段的有无确定被检测个体的遗传性别。两个特异性片段(122、218bp)同时存在则为雄性，只存在GAPDH片段(218bp)则为雌性。PCR扩增采用20mL体系，其中2XTaq PCR Master Mix IOmL(内含 O. lU/mL Taq 酶、500mmol/L dNTP、3mmol/L Mg2+、IOOmmo 1/L KCL、PCR 稳定剂和增强剂等)，DNA 模板 lmL，引物 SRY-F (IOmmoI/L)、SRY-R (10mmol/L)各 lmL，引物 GAPDH-F (IOmmoI/L)和 GAPDH-R (10mmol/L)各 O. 5mL,无菌双蒸水 6mL。反应条件为 95°C 5 分钟; 940C 30秒，540C 20秒，72°C 30秒，32个循环；72°C，10分钟。2. 5%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物。3) PIS遗传缺陷基因型鉴定
PIS遗传缺陷基因型鉴定的核心为引物设计，具体涉及三对PIS基因型鉴定引物 (PIS_-F/R、PIS+-F/R、NEI-F/R,附图2)，不同基因型山羊的扩增片段组合如附图3所示。以两个家系六个样本的基因组DNA为模板，PCR反应的扩增体系每对引物均为20mL 2XTaq PCR Master Mix IOmL (内含 0. I U/mL Taq 酶、500mmol/L dNTP、3 mmol/L Mg2+、IOOmmol/ L KCL、PCR稳定剂和增强剂等)，DNA模板lmL，上下游引物(PIS— -F/R、PIS+-F/R、NEI-F/ R, 10mmol/L)各0. 5mL，无菌双蒸水8mL。PIS基因型鉴定引物的反应条件为95°C预变性5 分钟；94°C 30 秒，(PIS二F/R :60°C、PIS+-F/R :52°C、NEI-F/R 55°C) 30 秒，72。。35 秒，
30个循环；72°C 10分钟。2. 5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。将通过以上方法获得的 PIS_PIS_、PIS_PIS+、PIS+PIS+个体的PCR产物回收纯化，连接到PGM-T载体中克隆测序验证。本发明从PIS的分子遗传机理入手，基于PIS个体缺失11. 7kb的特征，建立了一种简便快捷的奶山羊PIS遗传缺陷基因的PCR检测方法。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步的说明。
图I :PIS遗传缺陷基因型鉴定引物在染色体上的位置图。图2 :SRY-F/R、GAPDH-F/R、PIS二F/R、PIS+-F/R 和 NEI-F/R 序列图。
图3 :不同基因型山羊的扩增片段组合图。图4 :遗传性别判定结果电泳图 1、2 :间性山羊；3 :正常母羊；4 :正常公羊。 M:DL500 DNA Marker。图5 :奶山羊PIS遗传缺陷基因的三种基因型电泳图 1、2、3 :PIS_PIS_个体引物 PIS' PIS+和NEI的扩增结果;4、5、6 =PISTIS+个体引物PIS' PIS+和NEI的扩增结果；7、
8、9 : 15卞15+个体引物？15'卩15+和肥1的扩增结果；10、11、12 :引物PIS'PIS+和NEI的阴性对照(No template control, NTC) ;M 为 DNA Marker I (100，200，300，400，500，600b p)。图6 :遗传缺陷基因的遗传传递关系图 A、B:分别是两个家系的系谱和PIS基因遗传传递关系图。805 (父本)，034 (母本)，227 (子代)，517 (父本)，726 (母本)，150 (子代)是样本的耳号，其下方是该检测个体的PIS遗传缺陷基因的基因型。图7 :表型选择和基因型选择对间性山羊发生率的影响。
具体实施例方式以下描述了本发明的具体实施例。应该说明的是，这些实施例对本发明仅有说明作用，而没有限制作用。实施例一奶山羊两个家系无角间性(PIS)有害基因的检测
I.实验样品
从内蒙古呼和浩特分别采集两个家系血液样品，表型分别为一个家系父本、母本均正常，子代为间性；另一个家系父本、母本以及子代均为正常个体。-20°C快速带回实验室， 血液基因组DNA提取试剂盒(DP318，离心柱)提取DNA，TE溶解_20°C保存备用。2.遗传性别鉴定
利用复合PCR技术共扩增目的基因SRY和GAPDH。扩增产物2. 5%琼脂糖检测结果见附图4。1、2泳道检测的样品为外生殖器官有部分雄性特征的间性个体，只检测到218bp的 GAPDH基因，说明待检测个体遗传性别是XX。这一结果符合间性山羊的遗传基础是雌性的理论。3.遗传缺陷基因型鉴定
利用PIS_-F/R、PIS+-F/R和NEI-F/R引物分别对同一只奶山羊的DNA样品进行PCR扩增，奶山羊个体PIS遗传缺陷基因的基因分型情况如附图5所示，1、2、3的扩增结果包括 141bp和300bp的条带，无449bp的条带，此个体的基因型为PIS—PIS—;4、5、6的扩增结果包括141bp、449bp和300bp的条带，此个体的基因型为PIS—PIS+ ;7、8、9的扩增结果包括 449bp和300bp的条带，无141bp的带条，此个体的基因型为PIS+PIS+。分别对两个家系六个个体进行PIS遗传缺陷基因的基因分型，遗传缺陷基因的遗传传递关系如附图6所示。基因判型结果表明符合基因分离定律。实施例二一个群体无角间性(PIS)有害基因的频率检测分析
利用实施例一的方法对内蒙古呼和浩特地区224只奶山羊个体进行PIS遗传缺陷基因的基因型检测。结果发现PIS_PIS+基因型个体150个，PIS_PIS_基因型个体70个，PIS+PIS+ 基因型个体4个。各个体的PIS遗传缺陷基因型与表型相 一致，且符合基因的遗传传递规律。在父本、母本、子代及整个群体中，杂合体和PIS+基因的频率如表I所示。
表I PIS缺陷基因杂合体基因型频率及PIS缺陷基因频率
权利要求
1.ー种用于检测山羊无角间性(PIS)有害基因的分子方法，具有如下特征首先设计三对引物，其中ー对为PIS_引物，用于扩增显性基因的DNA片段，另ー对为PIS+引物，用于扩增含有隐性基因的DNA片段，第三对为对照引物NEI，用于扩增PIS基因的近邻DNA序列；再将上述三对引物分别在单管中进行PCR扩增产生相对应的DNA扩增产物，然后以琼脂糖凝胶电泳分离技术检测；根据扩增产物中DNA片段的有无及大小判断山羊的基因型。
2.根据权利要求I所述的基因检测方法，其特征在于三对引物具有如下序列特征 PIS—-F 5’- AAGAGAGGTGCCCTGAATAGA -3’，PIS_-R 5’ -CACTGCTTTTGGTGTGTATCC-3 ’ ；PIS+-F 5，- AAAGGGGAGTTGAAGAAG -3 ’，PIS+-R 5，-AAAAGACACACGGACTAC -3 ’； NEI-F5’ -CCTCATTGGAGTGCTAAG-3’ , NEI-R 5’ - ATCGGTCTACACCACAAC-3。
3.根据权利要求2所述的基因检测方法，其特征在于PIS—、PIS+、NEI三对引物的PCR，反应条件分别为 95°C预变性 5 分钟;94°C 30 秒，(PIS'F/R :60°C、PIS+_F/R :52°C、NEI-F/R 55°C) 30 秒，72°C 35 秒，30 个循环；72°C 10 分钟。
4.根据权利要求2和3所述的基因检测方法，其特征在于，PIS_,PIS+、NEI三对引物分别获得大小为141、449、300bp的扩增产物；如果扩增产物中含有141bp的片段，即为检测出显性等位基因PIS_ ;如果扩增产物中含有449bp的片段，即为检测出隐性等位基因PIS+ ；能够扩增出300bp的片段是保证PIS基因检测有效性的必要条件。
5.根据权利要求I所述的基因检测方法，其特征在干，2知3%琼脂糖电泳检测三对引物的扩增片段基因型为Pis_ PIS_、PIS_ PIS+、PIS+ PIS+的山羊分别具有(141、300bp)、(141、449、300bp)、(449、300bp)的片段组合，其对应的山羊表现型分别为正常、正常、间性。
全文摘要
本发明属分子遗传及家畜育种领域，具体涉及一种山羊无角间性(PIS)有害基因的检测方法。本方法首先设计三对引物，分别用于扩增含有显性基因、隐性基因和近邻基因序列的DNA片段。再将上述三对引物分别在单管中进行PCR，获得相对应的扩增片段，然后以琼脂糖凝胶电泳分离技术检测。最后根据扩增产物中DNA片段的有无及大小判断山羊的基因型。本发明方法特异性高，能为山羊场开展PIS基因快速检测和有效淘汰杂合体山羊提供技术保障，并且操作简单，成本低，可在一般实验室开展。
文档编号C12Q1/68GK102690891SQ20121020508
公开日2012年9月26日 申请日期2012年6月20日 优先权日2012年6月20日
发明者付绍印, 刘雪峰, 张文广, 李金泉, 杨波, 贾丽丽, 赵德超 申请人:内蒙古农业大学