专利名称：蛋白质纯化的方法及系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质纯化的方法及系统，更具体地说，本发明涉及使用淀粉结合蛋白的方法及系统。
背景技术：
通过微生物系统表达以生产蛋白质已成为高价、医药用蛋白质的主要来源。纯化及回收重组蛋白是设计发酵过程中的一个重要考虑因素。而蛋白质纯化的传统方法可用于分离产物，改良方法包含重组蛋白质的使用。重组蛋白可以通过亲和管柱层析法纯化，重组蛋白的所需成分通过其共价性连接至多肽，多肽与亲和性基质(亲和介质)相连接，从而完成纯化。存在某些通过亲和性管柱层析原理用于分离蛋白质的系统。美国专利号第5，643，758号的专利描述了包含有麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein, MBP)的系统。克隆基因(cloned gene)插入于来自可编码出麦芽糖结合蛋白的malE基因pMAL载体下游(down-stream)。该载体可转化至寄主细胞(host cell)，然后该重组蛋白可以在该寄主细胞表达。该细胞的溶解产物或培养基部分可装载于包含亲和性基质淀粉糖(amylose)的管柱并清洗数次，然后使用大量的麦芽糖抽提重组蛋白。美国专利号第5，202，247号的专利描述了包含有纤维素结合区域(cellulose-binding domain)的系统。纤维素管柱可用于纯化包含有纤维素结合区域的重组蛋白。该细胞的溶解产物或培养基部分可装载于该管柱并清洗。纤维素结合区域与纤维素的交互作用似乎是由中性PH值的疏水性相互作用而驱使。一般抽提方法使用低极性溶剂例如乙二醇，在去除低极性溶剂前使用透析或过滤。上述的蛋白质纯化系统具有某些缺点。(I)其蛋白质纯化过程不方便且费力。(2)用于纯化的管柱昂贵。(3)上述系统进行蛋白质纯化时，有些情况下无法分离重组蛋白，例如含有EDTA的样品，以及现在使用的蛋白质标签与本发明的目标蛋白相比，相对较大者。利用酶产物在水中饲养现今还存在某些问题，例如(a)饲料加入水中后酶快速流失，以及(b)当饲料生产温度高于100°C时酶活性将会被破坏
发明内容
本发明的具体说明及简要描述如下，本发明的特征在于淀粉结合蛋白标签化重组蛋白(starch binding protein (SBP) -tagged recombinant protein)、淀粉结合蛋白结合基质(SBP-binding matrix)及其在蛋白质纯化的应用。在某些实施例中，提供一种纯化重组蛋白的方法，包含
(a)提供包含淀粉结合蛋白标签化重组蛋白的溶液；
(b)添加该溶液至第一容器，该第一容器包含淀粉结合蛋白结合基质；
(C)抽提碱性缓冲液至步骤(b)的第一容器以获得混合物；
(d)将该混合物与溶液混合，该溶液用于在第二容器中切割淀粉结合蛋白及重组蛋白以生成反应混合物；以及
(e)添加该反应混合物至第三容器，该第三容器包含淀粉结合蛋白结合基质以回收重组蛋白。再者，在其它实施例中，提供一种纯化重组蛋白的系统，包含
装置(a)，用于提供包含淀粉结合蛋白标签化重组蛋白的溶液；
装置(b)，用于添加该溶液至第一容器，该第一容器包含淀粉结合蛋白结合基质；
装置(C)，用于抽提碱性缓冲液至(b)的第一容器以获得混合物；
装置(d)，用于将该混合物与溶液混合，该溶液用于在第二容器中切割淀粉结合蛋白及重组蛋白以生成反应混合物；以及
装置(e)，用于添加该反应混合物至第三容器，该第三容器包含淀粉结合蛋白结合基质以回收重组蛋白。
在某些方面，该淀粉结合蛋白结合基质包含淀粉、分枝淀粉(amylopectin)、直链淀粉树脂(amylose resin)、糊精树脂(dextrin resin)或藻酸盐微粒(alginatebeads)。在某些方面，(a)的淀粉结合蛋白标签化重组蛋白来自于细胞，且(b)淀粉结合蛋白结合基质为淀粉。在其它方面，(b)的第一容器、(d)的第二容器或(e)的第三容器为可抛弃式。在其它方面，(d)的混合物进一步添加淀粉结合蛋白-内切蛋白酶(SBP-endoprotease )。在特定方面，该淀粉结合蛋白_内切蛋白酶为淀粉结合蛋白-严重急性呼吸综合征蛋白酶(SBP-SARS protease)或淀粉结合蛋白-肠激酶(SBP-enterokinase)。在另一方面，(a)的溶液具有4至6的pH值。在另一方面，(C)的缓冲液具有7至11的pH值。在又一方面，淀粉结合蛋白标签化重组蛋白于淀粉结合蛋白及目标蛋白间包含有内切蛋白酶识别位置。在又一方面，(b)的溶液具有4至8的pH值。在再一方面，某些实施例于步骤(e)前进一步包含中和步骤用于调整pH值直到5至7。在再一方面，某些实施例进一步包含中和装置，用于调整pH值直到5至7。在某些实施例中，提供一种具有热稳定性的重组蛋白，其以上述任一实施例的方法制备，其中该重组蛋白以淀粉结合蛋白标签及目标蛋白而融合。在其它方面，该目标蛋白指脂酶(Lipase)、聚木糖酶(Xylanase)或植酸酶(Phytase)0
在其它实施例中，提供一种用于制备重组蛋白的方法，该重组蛋白包含有淀粉结合蛋白标签及蛋白质A (protein A),其中该重组蛋白通过酵母菌或细菌而表达。在某些方面，该酵母菌为准赤酵母属iPichia、。在某些方面，该细菌为大肠杆菌(疋coli、。本发明中一或多个实施例的细节将于下详细描述。而本发明的其它特征及优点将由下述的详细描述及权利要求中显现。上述的一般性描述及后述的详细描述可通过例子而理解，且可提供如本发明所主张的进一步解释。
图I表示一种系统，该系统设计用于高度专一性切割地融合蛋白质，接着将其快速、亲和性为主地获取并移除所有淀粉结合蛋白标签化(SBP-tagged)的残基。(即SBP-标签化内切蛋白酶(SBP-tagged endoprotease )、SBP-标签化-目标蛋白(SBP-taggedtarget protein)及游离 SBP (free SBP) ) 图2表示SBP-植酸酶(SBP-Phytase)及植酸酶在水中的示意图。图3表示SBP-植酸酶在水中释放实验的结果。图4A-4C表示淀粉结合蛋白-增强型绿色荧光蛋白(SBP-eGFP)结合至不同类型树脂的结合试验的聚丙烯酰胺胶体电泳(SDS-PAGE)的结果。图4A显示分枝淀粉的结果。图4B显示直链淀粉树脂的结果。图4C显示糊精树脂的结果，其中，M:标记，In:流入物，P结合蛋白，S:未结合蛋白。图5显示淀粉结合蛋白-增强型绿色荧光蛋白结合至藻酸盐微粒的结合试验的聚丙烯酰胺胶体电泳的结果，其中，M:标记，In:流入物，S:未结合蛋白，E:抽提物。图6显示亲和性标签化(affinity-tagged)的纯化及”完全切割(Clean-Cut)” 的去标签化(de-tagging)过程的结果，其中，I :以第一淀粉管柱纯化的目标蛋白，2 :SBP-蛋白酶切割的SBP，3 :经纯化去标签化的目标蛋白，4 :结合于第二淀粉管柱的SBP及SBP-蛋白酶。
图7A-7B表示以淀粉结合蛋白-蛋白质A直链淀粉树脂(SBP-SpA amylose resin)进行免疫球蛋白纯化的结果。图7A表示纯化来自疋coli.的淀粉结合蛋白-蛋白质A(SBP-SpA)的纯化结果。图7B表示纯化来自Pichia的淀粉结合蛋白_蛋白质A(SBP-SpA)的纯化结果，其中，M:标记,S:血清,FT:流过物(Flowthrough), W:清洗溶液,E:抽提物。
具体实施例方式为描述及主张本发明，将使用依照下列定义的术语。如本文所使用的术语“重组蛋白”为源自于重组DNA的蛋白质。术语“重组DNA”指一种DNA形式，其非自然存在，通过结合不会正常发生的DNA序列而创造。如本文所使用的术语“淀粉结合蛋白(starch binding protein)”将可缩写为“SBP”，且其定义为所有对于结合至淀粉具有亲和性的多肽。如本文所使用的术语“淀粉结合蛋白标签(SBP tag (s))”指淀粉结合蛋白(SBP)的亲和性标签，且术语“亲和性标签(affinity tags)”指附于蛋白质的标签致使蛋白质可由其粗生物来源，使用亲和性技术而纯化。如本文所使用的术语“淀粉结合蛋白标签化重组蛋白(SBP-tagged recombinantprotein,以下简称SBP-tagged重组蛋白)”指重组蛋白，其具有以遗传方式接合的淀粉结合蛋白胜肽序列作为亲和性标签者。如本文所使用的术语“淀粉结合蛋白结合基质(SBP-binding matrix,以下简称SBP结合基质)”指任何可与淀粉结合蛋白结合的基质。SBP结合基质的例子包含但不限于淀粉、分枝淀粉、直链淀粉树脂、糊精树脂及藻酸盐微粒。如本文所使用的术语“淀粉结合蛋白-内切蛋白酶(SBP-endoprotease,以下简称SBP-内切蛋白酶)”指任何以淀粉结合蛋白作为标签并与其结合的内切蛋白酶。内切蛋白酶(Endoprotease)为一种可以切割非末端氨基酸(即在分子内)的肽键的酵素。SBP-内切蛋白酶的例子包含但不限于淀粉结合蛋 白-严重急性呼吸综合征蛋白酶(SBP-SARS protease,以下简称SBP-SARS蛋白酶)或淀粉结合蛋白-肠激酶(SBP-enterokinase,以下简称SBP-肠激酶)。本发明的实施于后述详细描述关于用于纯化目标蛋白的方法及系统，其使用可再利用、方便及低价的SBP-tagged重组蛋白及SBP结合基质。在某些实施例中，提供一种纯化重组蛋白的方法，包含
(a)提供包含SBP-tagged重组蛋白的溶液；
(b)添加该溶液至第一容器，该第一容器包含SBP结合基质；
(C)抽提碱性缓冲液至步骤(b)的第一容器以获得混合物；
(d)混合该混合物与溶液，该溶液是用于在第二容器中切割SBP及重组蛋白以生成反应混合物；以及
(e)添加该反应混合物至第三容器，该第三容器包含SBP结合基质以回收重组蛋白。在本发明的某些实施例，其中该SBP结合基质包含淀粉、分枝淀粉、直链淀粉树月旨、糊精树脂或藻酸盐微粒。在某些实施例中，提供一种纯化重组蛋白的方法，包含步骤
(a)提供包含来自于SBP-tagged重组蛋白的溶液；
(b)添加该溶液至第一容器，该第一容器包含淀粉基质；
(c)抽提碱性缓冲液至步骤(b)的第一容器以获得混合物；
(d)混合该混合物与溶液，该溶液是用于在第二容器中切割SBP及重组蛋白以生成反应混合物；以及
(e)添加该反应混合物至第三容器，该第三容器包含淀粉基质以回收重组蛋白。在较佳实施例中，(b)的第一容器、(d)的第二容器或(e)的第三容器为可抛弃式。(d)的混合物进一步添加SBP-内切蛋白酶。在最佳实施例中，该SBP-内切蛋白酶为SBP-SARS蛋白酶或SBP-肠激酶。在较佳实施例中，步骤(a)的溶液具有4至6的pH值，且步骤(C)的缓冲液具有7至11的pH值。在最佳实施例中，步骤(a)的溶液具有5至6的pH值，且步骤(c)的缓冲液具有8至9的pH值。尽管当pH值为11时，步骤(c)的缓冲液有最佳中和电荷效果(discharge effect),过于碱性的环境可能会破坏目标蛋白。因此,推荐的缓冲液pH值范围为8至9。当pH值范围为2至4时，该缓冲液也可中和蛋白质电荷，但推荐碱性环境。
在较佳实施例中，SBP-tagged重组蛋白于SBP及目标蛋白间包含有内切蛋白酶识别位置。在某些实施例中，该(b)的溶液具有4至8的pH值以回收重组蛋白。在某些较佳实施例，推荐5至7的pH值。在某些实施例中，该方法在步骤(e)前进一步包含中和步骤，用于调整pH值直到5至7。本发明还提供一种用于纯化重组蛋白的系统，包含
(a)一装置，用于提供包含SBP-tagged重组蛋白的溶液；
(b)一装置，用于添加该溶液至第一容器；
(c)一装置，用于抽提碱性缓冲液至(b)的第一容器以获得混合物；
(d)一装置，用于将该混合物与溶液混合，该溶液是用于在第二容器中切割SBP及重组蛋白以生成反应混合物；以及
(e)一装置，用于添加该反应混合物至第三容器，该第三容器包含SBP结合基质以回收重组蛋白。在本发明的某些实施例，其中该SBP结合基质包含淀粉、分枝淀粉、直链淀粉树月旨、糊精树脂或藻酸盐微粒。在较佳实施例中，(b)的第一容器、(d)的第二容器或(e)的第三容器为可抛弃式。(d)的混合物进一步添加SBP-内切蛋白酶。在最佳实施例中，该SBP-内切蛋白酶为SBP-SARS蛋白酶或SBP-肠激酶。在较佳实施例中，(a)的溶液具有4至6的pH值，且(C)的缓冲液具有7至11的pH值。在最佳实施例中，(a)的溶液具有5至6的pH值，且(c)的缓冲液具有8至9的pH值。在较佳实施例中，SBP-tagged重组蛋白在SBP及目标蛋白间包含有内切蛋白酶识别位置。在某些实施例中，该(b)的溶液具有4至8的pH值以回收SBP-tagged重组蛋白。在某些较佳实施例，推荐5至7的pH值。在某些实施例中，该系统在装置(e)前进一步包含中和装置，用于调整pH值直到5至7。此外，当SBP标签、SBP内切蛋白酶及未被切割的SBP-tagged重组蛋白在SBP结合基质被捕获时，第三容器中的反应混合物可回收无标签的重组蛋白。在某些实施例中，提供一种具有热稳定性的重组蛋白，其以上述任一实施例的方法制备，其中该重组蛋白以SBP标签及目标蛋白而融合。在特定实施例中，该目标蛋白指脂酶、聚木糖酶或植酸酶。如此一来，蛋白质的热稳定性可轻易提升并相当广泛地扩大其应用领域。在其它实施例中，提供一种用于制备重组蛋白的方法，该重组蛋白包含有SBP标签及蛋白质A，其中该重组蛋白通过酵母菌或细菌而表达。在某些方面，该酵母菌为毕赤巴斯德酵母)。在其它方面，该细菌为大肠杆菌。因此，本发明可适用于任何关于纯化所需蛋白的应用，例如诊断、研究或产业上利用。实施例下述提供的实施例用于描述但非限制本发明。实施例I蛋白质纯化 SBP-tagged重组蛋白构建及表达
以PCR扩增SBP基因且融合至目标蛋白的N端，其于SBP及目标蛋白基因间包含有内切蛋白酶识别位置。该融合蛋白在毕赤巴斯德酵母的表达载体pPICZ a A中复制，其在AOXl启动子控制下并转化至毕赤巴斯德酵母GS115而表达。载有SBP-目标蛋白基因的毕赤巴斯德酵母转化物在BMGY培养基中培养24小时。该细胞以在包含0.5%甲醇的BMMY中离心及再悬浮而取得。0. 5%甲醇(0. 5% v/v)每24小时添加以诱导SBP-tagged重组蛋白的表达。诱导5天之后，细胞以离心方式移除且收集不含细胞的发酵液供后续纯化。后续纯化方式请参考图I及下列描述
以第一淀粉管柱纯化SBP-tagged重组蛋白
不含细胞的发酵液使用于第一淀粉管柱。该SBP-tagged重组蛋白结合至淀粉且不纯物流出。该结合的SBP-tagged重组蛋白以pHll的甘氨酸缓冲液抽提，其后以pH7. 4的Tris缓冲液透析而储存。
的内切蛋白酶切割
该抽提的SBP-tagged重组蛋白与SBP-内切蛋白酶于适当缓冲液中混合。SBP标签及目标蛋白间的蛋白酶识别位置可以SBP-蛋白酶而移除SBP标签。以第二淀粉管柱移除SBP标签残基
经SBP-内切蛋白酶处理后，该反应混合物使用于第二淀粉管柱。该不纯物包含SBP标签、SBP内切蛋白酶及未切割的SBP-tagged重组蛋白以淀粉管柱捕获。完全消化切割的天然N端的目标蛋白于流过部分(flow through fraction)重新获得。实施例2热稳定性的比较
以PCR扩增SBP基因且融合至目标酵素的N端。脂酶基因来自于疋聚木糖酶基因来自于未纯化的瘤胃真菌培养基以及植酸酶基因来自于疋coli，其均复制并与SBP融合。该SBP-脂酶、SBP-聚木糖酶及SBP-植酸酶等融合蛋白以上述方法表达并于本发明中使用。不同来源脂酶的热稳定性
脂酶活性单位(U)定义为当样品每分钟释出I ii mole的磷硝基酹(p-Nitrophenol )在0. 3mM的4-硝基苯基软脂酸盐(4-Nitrophenly palmitate)在30。。、pH值7. 0的条件下。SBP-脂酶(52500 U/g)及 F-AP15 脂酶(32430 U/g, R. oryzae 脂酶购买自 AmanoEnzyme Inc.)与含水15%或20%的发酵黄豆粉混合以达每克100U。来自不同来源的100U/g混合脂酶秤重并挑选12g至IOOml血清瓶。含样品的血清瓶于此固定并以85°C或90°C高压灭菌10分钟。每一脂酶的每一情况均测试两次。经处理后测量脂酶的活性。结果显示于表I及表2。表I含水15%发酵黄豆粉
释高名I处理温度！ I处理时间(inin)I百分比％
SBP-脂酶25°C一 0100 %
SBP-脂酶85°C一 1086.78 %
SBP-脂酶90°C一 1086.2 %
F-AP1525°C—0100 %
F-AP1585°C— 1066.82 %
F-AP15丨90。。|l0丨37.02 % —
表2含水2 Q %发酵黄豆粉
尊高名 I处理温度！ I处理时间(inin)I百分比％
SBP-脂酶 |25°C|oIlOO % —
权利要求
1.一种提高目标蛋白热稳定性的方法，其特征在于所述方法是将淀粉结合蛋白与目标蛋白融合形成重组蛋白，所述重组蛋白通过真核生物表达。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述真核生物为酵母菌或昆虫细胞。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述酵母菌为毕赤巴斯德酵母或啤酒酵母。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述目标蛋白是酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述酶为植酸酶、脂酶、F-AP15脂酶、聚木醣酶、内切蛋白酶、严重急性呼吸综合征蛋白酶或肠激酶。
6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述目标蛋白是具有医药用途的蛋白。
7.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述目标蛋白为LZ8、绿色荧光蛋白或蛋白 质A。
8.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述重组蛋白与淀粉结合蛋白结合基质相彡口口
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于所述淀粉结合蛋白结合基质包含但不限于淀粉和/或藻酸盐。
10.一种使目标蛋白在水中维持活性的方法，其特征在于所述方法是将淀粉结合蛋白与目标蛋白融合形成重组蛋白，所述重组蛋白通过真核生物表达，且该重组蛋白与淀粉结合蛋白结合基质相结合。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述淀粉结合蛋白使目标蛋白在水中维持80%活性至少16个小时。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述淀粉结合蛋白使目标蛋白维持活性，是通过减少该目标蛋白从淀粉结合蛋白结合基质的流失来完成。
13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述淀粉结合蛋白结合基质包含但不限于淀粉和/或藻酸盐。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于所述淀粉结合蛋白结合基质为饲料。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于所述饲料为饲料颗粒、饲料小球或水中饲料。
16.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述真核生物为酵母菌或昆虫细胞。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于所述酵母菌为毕赤巴斯德酵母或啤酒酵母。
18.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述目标蛋白是酶。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于所述酶为植酸酶、脂酶、F-AP15脂酶、聚木醣酶、内切蛋白酶、严重急性呼吸综合征蛋白酶或肠激酶。
20.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述目标蛋白是具有医药用途的蛋白。
21.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述目标蛋白为LZ8、绿色荧光蛋白或蛋白质A。
全文摘要
本发明涉及一种纯化蛋白质的方法及其系统，其利用淀粉结合蛋白标签化重组蛋白而进行纯化。本发明还涉及淀粉结合蛋白结合基质以回收淀粉结合蛋白标签化重组蛋白。因此，通过本发明进行纯化是可再利用、方便并低廉的。
文档编号C12N9/96GK102746371SQ20121020491
公开日2012年10月24日 申请日期2010年5月14日 优先权日2009年5月15日
发明者张大慈, 许嘉钦 申请人:善笙生物科技股份有限公司