纤维素酶蛋白的分离提纯方法
【专利摘要】本发明涉及到纤维素酶分离纯化方法。本方法首先调节纤维素酶蛋白浓度至3mg/mL～8mg/mL，通过高精度强阴离子柱层析，利用线性与梯度相结合的洗脱方式对纤维素酶液进行初步分离，真空冷冻浓缩至冻干粉，用pH4.0～6.0缓冲液溶解，然后再通过凝胶柱层析，并采用蛋白电泳进行纯度检测，最后通过质谱检测，从而达到高效、精确分离提纯纤维素酶单酶组分的目的。与现有的方法对比，本方法可以实现酶蛋白单一组分的快速高效和精确分离，并能一次性获得多个单酶组分。
【专利说明】纤维素酶蛋白的分离提纯方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于酶【技术领域】，涉及到单酶分离提纯方法。
【背景技术】
[0002] 纤维素酶是一类多组分酶的总称，能够将难以被生物利用的纤维素水解为利于被 生物利用的葡萄糖，因此被认为是潜力巨大的酶制剂之一。纤维素酶属于糖苷水解酶，能够 降解纤维素的纤维素酶系至少包括三类组分：1、内切型-β -葡聚糖酶（endo-Ι，4-β-D-gl ucanase, EC3. 2. I. 4) ;2、外切型-β -葡聚糖酶（exo-1, 4- β -D-glucanase, EC 3· 2. I. 91); 3、β -葡萄糖苷酶（β -1，4-D-glucosidase, EC 3. 2. I. 21)。而纤维素主体由批喃葡萄糖构 成，并以β -1，4糖苷键连接，形成的大分子线性多聚物，单体为纤维二糖分子，主要由结构 稳定、微生物难以降解的结晶区和结构疏松、微生物容易降解的非结晶区两部分构成。
[0003] 纤维素酶系中的酶组分并不是单独作用于纤维素从而水解纤维素的，它们通过相 互协同作用实现水解功能，其中内切型-葡聚糖酶作用于非结晶区，水解β -1，4糖苷 键，可将线性纤维素多聚物截断生成大量带非还原性末端的纤维素小分子；外切型_β -葡 聚糖酶水解1，4-β-D-糖苷键，作用于线性纤维素多聚物的末端，生成单个纤维二糖分子； β_葡萄糖苷酶则将纤维二糖水解成为葡萄糖。通过纤维素酶复合酶组分的相互协同作用， 可以将地球上最丰富的生物高聚物一纤维素，转化为微生物可以轻易利用的葡萄糖分子， 并通过发酵产生生物燃料，用以缓解目前的能源短缺的问题。
[0004] 纤维素酶的来源广泛，能产生纤维素酶的生物包括昆虫、软体动物、原生动物、细 菌和真菌，纤维素酶最为方便的来源就是采用微生物作为纤维素酶的来源。然而，这些自产 酶天生具有一定的配比缺陷，比如：里氏木霉的纤维素酶中CBH II和β -葡萄糖苷酶表达 量不足，而黑曲霉所产酶中各酶的分泌高峰期不同，这些因素均对纤维素水解有限制作用。 所以，优化定制纤维素酶，使各组分达到最佳配比，才能在最少酶用量时获得最优的水解效 果。可见，对纤维素酶复合酶液进行单酶分离提纯是十分必要的。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供纤维素酶酶蛋白的分离提纯方法，通过高精度强阴离子柱 过柱、真空冷冻浓缩以及凝胶柱过柱，对纤维素复合酶液进行分离，并使之达到电泳纯。为 分析纤维素酶协同作用，提高纤维素酶酶解效率奠定了基础。
[0006] 本发明的技术解决方法包括的纤维素酶蛋白的分离提纯方法包括以下步骤：
[0007] 1、纤维素酶液蛋白浓度调节：一般而言，商业纤维素酶制剂十分粘稠，色泽厚重， 微生物自产酶或复配酶酶蛋白含量较低，均不满足柱层析的要求，对酸性纤维素酶液而言， 用pH4. 0?6. 0缓冲溶液，例如柠檬酸缓冲液、柠檬酸-磷酸缓冲液或乙酸钠缓冲液，将纤 维素酶蛋白含量调节至3mg/mL?8mg/mL较为合适。
[0008] 2、纯化：对稀释后的纤维素酶液进行阴离子交换柱层析色谱，采用高精度强阴离 子交换柱，例如Mono Q 5/50GL或Hitrap Q HP，利用线性与梯度洗脱结合的方式对纤维素 酶液进行分离，层析缓冲液为pH7. O?9. O缓冲溶液，例如Tris-HCl缓冲液。
[0009] 3、电泳纯条带检测：对接收液进行SDS-PAGE检测，当接收管所对应条带为单一条 带时，其接收管直接进入下一步的质谱鉴定；当接收管对应条带杂而多时，其接收管进行真 空冷冻浓缩过夜，将冻干酶粉用PH4. 0?6. 0缓冲溶液进行溶解，再采用凝胶柱层析，例如 Surperdex? 7510/300L 或 Surperdex? 20010/300L，层析缓冲液为 pH4. 0 ?6. 0 缓冲溶液。 将所得接收液同样进行SDS-PAGE检测，保留单条带所对应的接收管。
[0010] 4、质谱检测：对所有单条带对应的接收管均进行质谱检测，即可得到确切的单酶 组分。
[0011] 本发明的有益效果：
[0012] 1、本方法操作周期短，分离工艺简单，主要由阴离子柱层析与凝胶柱层析组成，阴 离子柱层析耗时约3小时，凝胶柱层析耗时约6小时。
[0013] 2、采用高精度强阴离子交换柱，提高分离效率，通过SDS-PAGE与质谱检测，能够 精确检验分离组分。
[0014] 3、在经过阴离子柱层析与真空冷冻浓缩后，用pH4. 0?6. 0的缓冲液溶解，且凝胶 柱层析的缓冲液同样使用ΡΗ4. 0?6. 0的缓冲液，使分离后所得酶蛋白处于适宜环境中，保 持酶蛋白活力。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图I B液浓度控制0?20 %线性增加，洗脱体积为30CV
[0016] 图2 B液浓度控制20?30 %线性增加，洗脱体积为20CV
[0017] 图3 B液浓度控制30?50 %线性增加，洗脱体积为30CV
[0018] 图4 Mono Q 5/50GL柱层析后对蛋白峰进行SDS-PAGE，其中，
[0019] 泳道1、2、3检测的是图1中的峰1，
[0020] 泳道4、5、6、7检测的分别是图2中的峰1、2、3、4，
[0021] 泳道8、9、10、11、12检测的是图3中的峰1、2、3、4、5。
[0022] 图5对图4第5泳道所对应的接收液进行凝胶柱层析
[0023] 图6对图4第6泳道所对应的接收液进行凝胶柱层析
[0024] 图7对图4第7泳道所对应的接收液进行凝胶柱层析
[0025] 图8 -次纯化和两次纯化后所得蛋白峰SDS-PAGE，其中，
[0026] 泳道1、2检测的是图5中的峰1，
[0027] 泳道3、4检测的是图7中的峰1，
[0028] 泳道5、6检测的是图1中的峰1，
[0029] 泳道7检测的是图3中的峰5。
[0030] 图9 B液浓度控制0?9 %线性增加，洗脱体积为IOCV
[0031] 图10 B液浓度控制0?13 %线性增加，洗脱体积为20CV
[0032] 图11 B液浓度控制20?30%线性增加，洗脱体积为20CV
[0033] 图12 Mono Q 5/50GL柱层析后对蛋白峰进行SDS-PAGE，其中，
[0034] 泳道1检测的是图11中的峰1，
[0035] 泳道2、3检测的是图11中的峰2，
[0036] 泳道4检测的是图11中的峰3，
[0037] 泳道5检测的是图9中的峰1，
[0038] 泳道6、7、8、9检测的分别是图10中的峰1、2、3、4。
[0039] 图13对图4的第2泳道所对应的蛋白接收液进行凝胶柱层析
[0040] 图14对图4的第4泳道所对应的蛋白接收液进行凝胶柱层析
[0041] 图15 -次纯化和两次纯化后所得蛋白峰SDS-PAGE，其中，
[0042] 泳道1检测的是图11的峰3，
[0043] 泳道2检测的是图9中的峰1，
[0044] 泳道3、4检测的是图10中的峰2、3，
[0045] 泳道5、6检测的是图14中的峰1。
【具体实施方式】
[0046] 下面通过实例，对发明的技术方案进行进一步的说明。
[0047] 实施例1
[0048] 取商业酶制剂GC220原酶液适量，用50mM柠檬酸缓冲液（pH4. 8)稀释纤维素酶蛋 白浓度至5. 4369mg/mL,用水系0. 45 μ m针头式过滤器过滤一次,使用美国通用电气医疗集 团生产的AKT avant蛋白分离仪，通过高精度强阴离子柱Mono Q 5/50GL将复合酶液进行 初步分离。其中：缓冲液A液是20mM Tris-HCl缓冲液（pH7. 5)，B液是含IM NaCl的A液， 上样量为lmL，控制流速为0. 7mL/min。阴离子柱层析结果见图1?3。
[0049] 通过高精度强阴离子交换柱Mono Q 5/50GL后，对蛋白峰进行SDS-PAGE检测。检 测结果见图4。
[0050] 凝胶柱Surperdex? 75 10/300L上样量为500yL，对第一次跑胶验证后杂带所 对应的接收液进行真空冷冻干燥至冻干粉，用50mM柠檬酸缓冲液（pH4. 8)溶解，然后通过 Surperdex? 7510/300L凝胶柱层析，进行进一步纯化，层析缓冲液为含有0. 15 M NaCl的 50mM柠檬酸缓冲液（pH4. 8)，控制流速为0. 8mL/min。凝胶柱层析结果见图5?7。
[0051] 对这些蛋白进行SDS-PAGE预实验后，将经过一次纯化得到的电泳纯和二次纯化 得到的电泳纯条带所对应的接收液进行SDS-PAGE。结果见图8。
[0052] 对图8中的这些条带进行质谱检测，快速鉴定蛋白种类。鉴定结果见下表。
[0053]
【权利要求】
1. 纤维素纤维素酶蛋白的分离提纯方法，其特征在于方法的步骤如下： 1) 纤维素酶液蛋白浓度调节：用PH4. 0?6. 0缓冲溶液将纤维素酶液调节至合适的蛋 白浓度。 2) 纯化：对稀释后的纤维素酶液进行阴离子交换柱层析，利用线性与梯度洗脱结合的 方式对纤维素酶液进行分离，层析缓冲液为pH7. 0?9. 0缓冲溶液。 3) 电泳纯条带检测：对接收液进行SDS-PAGE检测，当接收管所对应条带为单一条带 时，其接收管直接进入下一步的质谱鉴定；当接收管对应条带杂而多时，其接收管利用凝胶 柱层析进一步分离纯化，同样再进行SDS-PAGE检测，对单条带所对应的接收管保留。 4) 质谱鉴定：对所有单条带对应的接收管均进行质谱检测，即可得到确切的单酶组 分。
2. 根据权利要求1所述的纤维素酶蛋白的分离提纯方法，其纤维素酶是指商业酶制 齐IJ、各种微生物发酵培养所产酶液或其复配的酶液。
3. 根据权利要求1所述的纤维素酶蛋白的分离提纯方法，其步骤1)中所用的PH4.0? 6. 0缓冲液是指pH4. 0?6. 0能使酶蛋白处于适宜环境中，保持酶蛋白活力的缓冲液。
4. 根据权利要求1所述的纤维素酶蛋白的分离提纯方法，其步骤1)中调节纤维素酶液 蛋白浓度至3mg/mL?8mg/mL。
5. 根据权利要求1所述的纤维素酶蛋白的分离提纯方法，其步骤2)中所用的pH7.0? 9. 0缓冲液是指pH7. 0?9. 0能使酶蛋白颗粒带负电荷的缓冲液。
6. 根据权利要求1所述的纤维素酶蛋白的分离提纯方法，其步骤2)中纯化所用阴离子 交换柱是指Mono Q 5/50GL及能与纤维素酶蛋白发生离子交换作用的高精度强阴离子柱。
7. 根据权利要求1所述的纤维素酶蛋白的分离提纯方法，其步骤3)中进一步分离纯化 根据接收管条带是否单一而定，当接收管所对应条带为单一条带时，其接收管直接进入下 一步的质谱鉴定；当接收管对应条带杂而多时，其接收管进行真空冷冻浓缩至冻干粉，再用 pH4. 0?6. 0缓冲溶液进行溶解，进行凝胶柱层析，层析缓冲液为pH4. 0?6. 0缓冲溶液。
8. 根据权利要求1所述的纤维素酶蛋白的分离提纯方法，其步骤3)中纯化所用凝胶柱 是指Surperdex? 7510/300L及对纤维素酶蛋白起分子筛作用的葡聚糖凝胶层析柱。
【文档编号】C12N9/42GK104371990SQ201410665840
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月19日 优先权日:2014年11月19日
【发明者】孙付保, 白仁惠, 张云博, 张震宇, 沈松, 周邦炜 申请人:江南大学