马铃薯致病疫霉二酰甘油酰基转移酶基因dgat2-4及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种马铃薯致病疫霉二酰甘油酰基转移酶基因DGAT2-4及其应用，通过RT-PCR的方法，在马铃薯致病疫霉中分离到的与三酰甘油合成相关的二酰甘油酰基转移酶基因DGAT2-4，属于分子生物学和生物【技术领域】。通过酵母突变体互补实验鉴定和转基因酵母突变体细胞内三酰甘油含量测定表明，它是一个新的二酰甘油酰基转移酶基因，其编码的二酰甘油酰基转移酶能够将酰基CoA底物加到Sn-1,2-二酰甘油的Sn-3的位置上形成三酰甘油，可以用于提高植物、微生物中油份含量。
【专利说明】马铃薯致病疫霉二酰甘油酰基转移酶基因DGAT2-4及其应 用 (一） 发明领域
[0001] 本发明涉及马铃薯致病疫霉二酰甘油酰基转移酶（diacylglycerol acyltransferase,DGAT)DGAT2-4及其应用，属于分子生物学和生物【技术领域】。 (二） 技术背景
[0002] 马铃薯致病疫霉能够导致马铃薯和番茄等重要农作物发生晚疫病，但其菌丝体中 三酰甘油（triacylglycerol，TAG)含量高,并含有丰富的长链多不饱和脂肪酸（Yen，Stone etal. 2008 ;Sun，Liuetal. 2013)。马铃薯致病疫霉基因组测序完成，为克隆、鉴定马铃薯 致病疫霉TAG合成途径相关基因及进一步的基因工程应用奠定了基础。
[0003] 三酰甘油由3分子脂肪酸和1分子甘油酯化而成，是脂肪酸和能量的储藏库，普遍 存在于植物、动物和真菌中。TAG除作为重要的食用油外，还是重要的化工原料。
[0004] 近年来,通过植物和微生物生产的TAG来替代原油被作为一种可持续的绿色环保 能源而受到人们的重视。TAG合成途径主要有两条，依赖酰基CoA的途径和不依赖酰基CoA 的途径。依赖酰基CoA的途径又称为Kennedy途径，以酰基CoA作为底物在甘油骨架上进 行连续的酰化反应。
[0005]DGAT是一种跨膜蛋白（细胞溶质DGAT除外），在依赖酰基CoA的Kennedy途径 中催化TAG合成的最后一步反应，将酰基CoA底物加到Sn-1，2-二酰甘油的Sn-3的位置 上形成三酰甘油，是植物中储存油脂积累的限速步骤（Ichihara,Takahashietal. 1988; Sebei,Ouerghietal. 2006)oDGAT超表达能够增加拟南芥种子中油脂的含量（Xu,Francis etal. 2008)。另外，在大豆、油菜、玉米中也有同样的结果（Jako,Kumaretal. 2001; Zheng,Allenetal. 2008 ;Lock，Snyderetal. 2009)。
[0006] 克隆、鉴定新的DGAT基因，对利用转基因技术，在植物或微生物中过量表达高催 化活性的DGAT酶，从而提高植物或微生物中含油量具有重要的意义。
[0007] 本发明在马铃薯致病疫霉中克隆到1个编码DGAT的cDNA序列，在DGAT基因的突 变体酿酒酵母中诱导表达这个基因，发现其编码产物能够利用油酸（oleicacid，0A)合成 TAG，证明了其具有二酰甘油酰基转移酶活性。 (三）
【发明内容】
[0008] 本发明利用同源克隆的方法，从马铃薯致病疫霉（Phytophthorainfestans)中 克隆到了 1个DGAT基因的cDNA全长序列，其编码的氨基酸序列与其它物种中已鉴定的 DGAT氨基酸系列进行系统进化树分析表明，该基因属于DGAT2,因此将这个基因命名为 PiDGAT2-4。其核苷酸序列如SEQ.ID.NO1所示；其氨基酸序列如SEQ.ID.NO2所示。
[0009] 本发明通过RT-PCR的方法，在马铃薯致病疫霉中分离到的与三酰甘油合成相关 的二酰甘油酰基转移酶基因DGAT2-4 ;通过酵母突变体互补实验鉴定和转基因酵母突变体 细胞内三酰甘油含量测定表明，它是一个新的二酰甘油酰基转移酶基因，其编码的二酰甘 油酰基转移酶能够将酰基CoA底物加到Sn-1，2-二酰甘油的Sn-3的位置上形成三酰甘油， 可以用于提高植物和微生物中油份含量。
[0010] 该基因CDNA序列如下：
[0011] 序列表
[0012] (I)SEQIDNO1 的信息
[0013] (a)序列特征
[0014] *长度：1146碱基对
[0015] *类型：核酸
[0016] *链型：双链
[0017] *拓扑结构：线性
[0018] (b)分子类型：cDNA
[0019] (C)假设：否
[0020] (d)反义：否
[0021] (e)最初来源：马铃薯致病疫霉
[0022] (f)序列描述：SEQINNO. 1
[0023] ATGGCGAAGCTCACGAATGCGGCTTGCGGTCGCACATCTGCGTGGCCGGACTTTGATACT 60 CGCCCAGAGTTGCGAACGCTACGAGGGCGATTCATGCGACGCTTCGATCTCTTCATTCTC 120 TACGGTCTCTGGGTCGTCGGCCTCCXGTTTCTCGCAGTAATGTGGGTCTTCTCACTCTTC 180 TGTTTGGTGCAATGGAGTTGGAGACGAGCTACACACGACCATGCTCCTCCGATGGCATTT 240 TCAGCCCAGATATACCTGGGTTTCATCGTGCTGCACGAAAGCTACCACTACCTCACAAAA 300 CCTTCGTTGCATCAGTGGCCATTTATGAGACGTTTTTTTCGACAAGTTTTTCTTCATTAC 360 CCATACTTCCGCCTCAACGTCTTGGTTTTTGAAGAGCGTTCGAAAACTTCAAGTGAAAAT 420 GGCAAATGCAACAAAGAAATTGCCAGCAAGGCCGTTGAAGAGAACAATCTGTCGCCATTC 480 GTGACCCCCGATGATCGCGCTCTATTTGCCTTCCATCCGCACGGTGTCCTCTCCAGTGGA 540 TTCGCCTTCAACGGCGCGCACCACATGGGATTCTTGCATGCCCATTGTCGCTGGCTCGTA 600 TCGGAGAATCTCTTCTGGTTCCCCGTCATGCGCGACCTGTTGAACTGGATGGACTTCAGT 660 TGCGTATCTCGATCGACTTTCCATCGTTTCATGGCCACAGGTCAAAATGTGTGTTTGATC 720
[0024] CCTGGCGGCTTCGAAGACGCAACACTCTACGAACGAGGCAAACATCGTGTGTACATCAAG780AAACGCTTTGGCTTTATCAAGTTGGCTTTGCAGTATGGGTACAAGGTGCACCCAGTGTAC840 ACGTTCGGGGAGGAGTACGCTTATCACACCTTTCCTTATCTGCTCAAGTTGCGTCTCAAG900 CTGAACGAGTTCAAGATTCCTGGAGTCTTTTTCTTCGGTCTTCCGCATTGTTTCTTTCTG960 CCTCGCACCGACGTGGACCTTATCACTGTCGTTGGAGAACCCTTGGTCCTGCCGCGTATC1020 GAACAACCGACCMGGAAGACGTGCAGMATACCATGGTCAGTACGTCGAGGCTCTGCAA1080 AAGCTGTTCAACAAGTACAAGTCTGTGTACGCAGTCGACCCAGACGCTGAACTTGAATTA1140 TACTGA 1146
[0025] (?SEQINNO.2的信息
[0026] (a)序列特征
[0027] *长度：381氨基酸
[0028] *类型：氨基酸
[0029] *链型：单链
[0030] *拓扑结构：线性
[0031] (b)分子类型：蛋白质
[0032] 序列描述
[0033] MET Ala Lys Leu Thr Asn Ala Ala Cye Gly Arg Thr Ser Ala Trp 15 10 15 Pro Asp Phe Asp Thr Arg Pro Glu Leu Arg Thr Leu Arg Gly Arg 16 20 25 30 Phe MET Arg Arg Phe Asp Leu Phe lie Leu Tyr Gly Leu Trp Val 31 35 40 45 Val Gly Leu Leu Phe Leu Ala Val MET Trp Val Phe Ser Leu Phe 46 50 55 60 Cys Leu Val Gln Trp Ser Trp Arg Arg A丄a Thr His Asp His Ala 61 65 70 75 Pro Pro MET Ala Phe Ser Ala Gln lie Tyr Leu Gly Phe 工Ie Val 76 80 85 90 Leu His Glu Ser Tyr His Tyr Leu Thr Lys Pro Ser LeU His Gln 91 95 100 105 Trp Pro Phe MET Arg Arg Phe Phe Arg Gln Val Phe Leu His Tyr
[0034] 106 HO lib 120 Pro Tyr Phe Arg Leu Asn Val Leu Val Phe Glu GIu Arg Ser Lys 121 125 13C 135 Thr Ser Ser G丄u Asn G丄y Lys Cys Asn Lys Glu He Ala Ser Lys 136 140 145 150 Aia Val Giu Glu Asn Asn Leu Ser Pro Phe Val Thr Pro Asp Asp 151 155 16C 155 Arg Ala Leu Phe Ala Phe His Pro His Gly VaI Leu Ser 5er Gly 166 170 175 130 Phe Ala Phe Asn Gly Ala His His MET Gly Phe Leu His Ala His 181 185 19C 195 Cys Arg Trp Leu Val Ser Glu Asn Leia Phe Trp Phe Pro Val MET 196 200 2：] 5 210 Arg Asp Leu Leu Asn Trp MET Asp Phe Ser Cys Val Ser Arg Ser 211 215 220 225 Thr Phe His Arg Phe MET Ala Thr Gly Gln Asn Val Cys Leu lie 226 230 235 240 Pro Gly Gly Phe Glu Asp Ala Thr Leu Tyr Glu Arg Gly Lys His 241 245 250 255 Arg Val Tyr lie Lys Lys Arg Phe Gly Phe He Lys Leu Ala Leu 256 260 265 270 G_n Tyr Gly Tyr Lys Val His Pro Val Tyr Thr Phe Gly Glu Glu 27： 275 280 285 Tyr Ala Tyr His Thr Phe Pro Tyr Leu Leu Lys Leu Arg Leu Lys 286 290 295 300 Leu Asn Glu Phe Lys lie Pro G丄γ Va丄Phe Phe Phe G丄y Leu Pro 301 305 310 315 His Cys Phe Phe Leu Pro Arg Thr Asp Val Asp Leu lie Thr Val 316 320 325 330 Va丄G丄y G丄u Pro Leu /a丄 Leu Pro Arg 工丄e Glu G丄n Pro Thr Lys W丄 335 34C 345
[0035] Glu Asp Val Gln Lys Tyr His Gly Gln Tyr Val Glu Ala Leu Gln 34 6 350 355 360 Lys Leu Phe Aen Lys Tyr Lys Ser Val Tyr Ala Val Asp Pro Asp 361 365 370 375 Ala Glu Leu Glu Leu Tyr 376 380
[0036] 利用酵母载体pYES2将PiDGAT2-4基因转化到酿酒酵母突变体H1246中，进行突 变体互补实验以验证06八1'活性。酿酒酵母突变体!11246((^&1，11'〇1， &代1&11(1&代2)为4 基因突变体，由于酵母中的1个DGAT2、1个PDAT和2个ASAT基因被敲除，在此突变体酵母 细胞中不能合成TAG，因而在油酸存在下生长受到抑制。但是体内一旦有TAG合成，生长抑 制会得到缓解，酵母细胞就能在一定程度上恢复生长。
[0037] 结果显示（附图1)，酵母浓度在OD值为1.0时，转空载体pYES2的酵母突变体 H1246在含有油酸的酵母固体培养基上只有少量生长，经梯度稀释后生长几乎完全受到抑 制；而转空载体PYES2的野生型SCY62酵母和转PiDGAT2-4基因的酵母突变体H1246在OD 值为I. 0时正常生长，经梯度稀释后仍能不同程度继续生长，表明在转PiDGAT2-4基因酵母 细胞中都有TAG的合成，也即PiDGAT2-4具有二酰甘油酰基转移酶活性。
[0038] 将上述转基因酵母经半乳糖诱导培养48h后，收集等量菌体，用普利莱基因技术 有限公司（ApplygenTechnologies)的甘油三酯酶法测定试剂盒Plasmatriglyceride assaykitE1003测定转基因酵母中TAG含量（附图2)。对照组中野生型酵母TAG含量为 54. 17μM，突变体酵母H1246中TAG含量为4. 90μM，转PiDGAT2-4基因的突变体酵母H1246 中TAG含量达到64. 17μM(附图3)，明显高于野生型酵母，说明PiDGAT2-4基因编码产物具 有较高的二酰甘油酰基转移酶活性。 (四）【专利附图】
【附图说明】
[0039] 图1 :酵母突变体互补实验
[0040]图 1 中：SCY62+pYES2:转空载体pYES2 的野生型酵母SCY62 ;H1246+pYES2 :转空 载体pYES2的突变体酵母H1246 ;H1246+PiDGAT2-4 :转pYES2:DGAT2-4载体的突变体酵母 H1246 ; 1/10、1/20、1/40、1/60、1/100 :不同稀释浓度的酵母。酵母浓度在OD值为1.0时，转 空载体PYES2的酵母突变体H1246在含有油酸的酵母固体培养基上只有少量生长，经梯度 稀释后生长几乎完全受到抑制；而转空载体PYES2的野生型SCY62酵母和转PiDGAT2-4基 因的酵母突变体H1246在OD值为I. 0时正常生长，经梯度稀释后仍能不同程度继续生长， 表明在转PiDGAT2-4基因酵母细胞中都有TAG的合成，也即PiDGAT2-4具有二酰甘油酰基 转移酶活性。
[0041] 图2:标准曲线
[0042] 图2中：经梯度浓度稀释的标准品进行颜色反应后，在550nm下测定相应吸光值， 绘制的标准曲线。
[0043] 图3:各转基因酵母TAG含量
[0044] 图3中：纵坐标表示测定的酵母细胞中TAG的含量，横坐标为不同类型的酵母； SCY62:转pYES2空载体的野生型酵母；H1246:转pYES2空载体的突变体酵母H1246;B:转 pYES2:DGAT2-4载体的酵母H1246;每个转基因TAG含量的测定都设三次重复，取平均值。 转PYES2空载体的野生型酵母SCY62细胞中TAG含量为54. 17μM，转pYES2空载体的突变 体酵母Η1246细胞中TAG含量为4. 90μΜ，转PiDGAT2-4基因的突变体酵母Η1246中TAG含 量达到64. 17μM，明显高于转pYES2空载体的野生型酵母和突变体酵母，说明PiDGAT2-4基 因编码产物具有较高的二酰甘油酰基转移酶活性。
[0045](五）具体发明实施方式
[0046] 实施例1:马铃薯致病疫霉DGAT基因DGAT2-4cDNA的获得
[0047] 1.马铃薯致病疫霉的培养：接种马铃薯致病疫霉到新鲜的燕麦培养基，20度，黑 暗培养。
[0048] 2.总RNA的提取：收集生长15天左右的菌丝体，利用TRIZOL法（Invitrogen)提 取总RNA。
[0049]3.取 2 微克总RNA,用MMLVReverse Transcriptase (Promega)，按试剂说明书使 用方法反转录成单链cDNA。
[0050] 4.以所获得的马铃薯致病疫霉的cDNA为模板，用引物5' -
[0051] GGTACCATGTTCTACATCCCCCTAGGGC-3'（SEQ. ID. NO. 4所示）和
[0052] 5' -GAGCTCCTAAACGATCACCAACGTTTCGTCC-3'（SEQ.ID.NO. 5 所示）进行PCR反 应，PCR体系：CldH2O35. 5μI;IOXperbuffer(含Mg2+) 5μI;dNTP(2. 5mM) 4μ1;引物 (5μM)各2μI;模板IμI;Taq酶0· 5μI。反应条件：94°C预变性3分钟；94°C变性30秒， 58°C退火30秒，72°C延伸1分钟，35个循环；72°C延伸10分钟。扩增得到PiDGAT2-4基因 cDNA全长序列，将扩增的该片段胶回收后，连接到克隆载体pMD18-T中。
[0053] 5.序列测定：本工作在上海生工生物工程技术服务有限公司进行。获得 PiDGAT2-4基因cDNA全长序列长度1146bp。
[0054] 6.同源检索：利用BLAST软件将上述获得的cDNA片段编码的氨基酸序列与基因 银行中的序列进行比较，其编码的氨基酸序列与其它物种中已鉴定的DGAT氨基酸系列进 行系统进化树分析表明，该基因属于DGAT2,因此将这个基因命名为PiDGAT2-4。
[0055] 实施例2 :马铃薯致病疫霉PiDGAT2-4基因，如下序列：
[0056] (I)SEQ ID NO. 1的信息
[0057] (a)序列特征
[0058] *长度：1146碱基对
[0059] *类型：核酸
[0060] *链型：双链
[0061] *拓扑结构：线性
[0062] (b)分子类型：cDNA
[0063](C)假设：否
[0064] (d)反义：否
[0065] (e)最初来源：马铃薯致病疫霉（Phytophthora infestans)
[0066] (f)序列描述：SEQINNO. 1
[0067] IATGGCGAAGCTCACGAATGCGGCTTGCGGTCGCACATCTGCGTGGCCGGACTTTGATACT 60 61 CGCCCAGAGTTGCGAACGCTACGAGGGCGATTCATGCGACGCTTCGATCTCTTCATTCTC 120 121 TACGGTCTCTGGGTCGTCGGCCTCCTGTTTCTCGCAGTAATGTGGGTCTTCTCACTCTTC 180 181 TGTTTGGTGCAATGGAGTTGGAGACGAGCTACACACGACCATGCTCCTCCGATGGCATTT 240 241 TCAGCCCAGATATACCTGGGTTTCATCGTGCTGCACGAAAGCTACCACTACCTCACAAAA 300 301 CCTTCGTTGCATCAGTGGCCATTTATGAGACGTTTTTTTCGACAAGTTTTTCTTCATTAC 360 361 CCATACTTCCGCCTCAACGTCTTGGTTTTTGAAGAGCGTTCGAAAACTTCAAGTGAAAAT 420 421 GGCAAATGCAACAAAGAAATTGCCAGCAAGGCCGTTGAAGAGAACAATCTGTCGCCATTC 480 481 GTGACCCCCGATGATCGCGCTCTATTTGCCTTCCATCCGCACGGTGTCCTCTCCAGTGGA 540 541 TTCGCCTTCAACGGCGCGCACCACATGGGATTCTTGCATGCCCATTGTCGCTGGCTCGTA 600 601 TCGGAGAATCTCTTCTGGTTCCCCGTCATGCGCGACCTGTTGAACTGGATGGACTTCAGT 660 661 TGCGTATCTCGATCGACTTTCCATCGTTTCATGGCCACAGGTCAAAATGTGTGTTTGATC 720 721 CCTGGCGGCTTCGAAGACGCAACACTCTACGAACGAGGCAAACATCGTGTGTACATCAAG 780 781 AAACGCTTTGGCTTTATCAAGTTGGCTTTGCAGTATGGGTACAAGGTGCACCCAGTGTAC 840 841 ACGTTCGGGGAGGAGTACGCTTATCACACCTTTCCTTATCTGCTCAAGTTGCGTCTCAAG 900 901 CTGAACGAGTTCAAGATTCCTGGAGTCTTTTTCTTCGGTCTTCCGCATTGTTTCTTTCTG 960 961CCTCGCACCGACGTGGACCTTATCACTGTCGTTGGAGAACCCTTGGTCCTGCCGCGTATC1020 1021GAACAACCGACCAAGGAAGACGTGCAGAAATACCATGGTCAGTACGTCGAGGCTCTGCAA1080 1081AAGCTGTTCAACAAGTACAAGTCTGTGTACGCAGTCGACCCAGACGCTGAACTTGAATTA1140 1141TACTGA
[0068] (3)SEQINNO. 2 的信息
[0069] (a)序列特征
[0070] *长度：381氨基酸
[0071] *类型：氨基酸
[0072] *链型：单链
[0073] *拓扑结构：线性
[0074] (b)分子类型：蛋白质
[0075] (C)序列描述
[0076] MET Ala Lys Leu Thr Asn Ala Ala Cys Gly Arg Thr Ser Ala Trp 15 10 15 Pro Asp Phe Asp Thr Arg Pro Glu Leu Arg Thr Leu Arg Gly Arg 16 20 25 30 Phe MET Arg Arg Phe Agp Leu Phe 工Ie Leu Tyr Gly Leu Trp Val 31 35 40 45 Val Gly Leu Leu Phe Leu Ala Val MET Trp Val Phe Ser Leu Phe 46 50 55 60 Cys Leu Val Gln Trp Ser Trp Arg Arg Ala Thr His Asp His Ala 61 65 70 75 Pr ) Pro MET A丄a Phe Ser Ala Gln lie Tyr Leu G丄y Phe I丄e Val 76 80 85 90 Leu His Glu Ser Tyr His Tyr Leu Thr Lys Pro Ser Leu His Gln 91 95 100 105 Trp Pro Phe MET Arg Arg Phe Phe Arg Gln Val Phe Leu His Tyr 106 HO 115 120 Pro Tyr Phe Arg Leu Asn Val Leu Val Phe Glu Glu Arg Se Lys 121 125 130 135 Thr Ser Ser Glu Asn Gly Lys Cys Asn Lys Glu lie Ala Ser Lys 136 140 145 150 Ala Val Glu Glu Asn Asn Leu Ser Pro Phe Val Thr Pro Asp Asp 151 155 160 165
[0077] Arg Ala Leu Phe Ala Phe His Pro His Gly Val Leu Ser Ser 31y 166 170 175 180 Phe Ala Phe Asn Gly Ala His His MET Gly Phe Leu His Ala His 181 185 190 195 Cys Arg Trp Leu Val Ser Glu Asn Leu Phe Trp Phe Pro Val MET 196 200 205 210 Arg Asp Leu Leu Asn Trp MET Asp Phe Ser Cys Val Ser Arg Ser 211 215 220 225 Thr Phe His Arg Phe MET Ala Thr Gly Gln Asn Val Cys Leu工Ie 226 220 235 240 Pro GIy Gly Phe Glu Asp Ala Thr Leu Tyr Glu Arg Gly Lys His 241 245 250 255 Arg Val Tyr工Ie Lys Lys Arg Phe Gly Phe lie Lys Leu Ala Leu 256 260 265 270 Gln Tyr Gly Tyr Lys Val His Pro Val Tyr Thr Phe Gly Glu Glu 271 275 280 285 Tyr Ala Tyr His Thr Phe Pro Tyr Leu Leu Lys Leu Arg Leu Lys 286 290 295 300 Leu Asn Glu Phe Lys工Ie Pro Gly Val Phe Phe Phe Gly Leu Pro 301 305 310 315 His Cys Phe Phe Leu Pro Arg Thr Asp Val Asp Leu lie Thr Val 316 320 325 330 Val Gly Glu Pro Leu Val Leu Pro Arg工Ie Glu Gln Pro Thr Lys 331 335 340 345 GIu Asp Val Gln Lys Tyr His Gly GIn Tyr Val Glu Ala Leu Gin 346 350 355 360 Lys Leu Phe Asn Lys Tyr Lys Ser Val Tyr Ala Val Asp Pro Asp 361 365 370 375 Ala Glu Leu Glu Leu Tyr 376 380
[0078] 实施例3 :酵母表达载体pYES2:PiDGAT2-4的构建
[0079] 用KpnI和SacI从实施例I中构建的含有PiDGAT2-4cDNA全长片段的pMD18-T载 体上切下该PiDGAT2-4片段，与相同限制性内切酶酶切的酵母表达载体pYES2连接。连 接产物转化大肠杆菌XLlO感受态细胞，然后在含氨苄青霉素的LB固体平板上培养，对菌 落进行PCR筛选、鉴定和质粒DNA的酶切分析，获得带有PiDGAT2-4基因的酵母表达载体 pYES2:PiDGAT2-4。实施例4 :酵母突变体互补实验
[0080] 1.利用醋酸锂法将空载体PYES2分别转化到野生型酵母SCY62和突变体酵母 H1246中；用同样的方法将酵母表达载体pYES2:PiDGAT2-4转化到突变体酵母H1246中。
[0081] 2.取阳性酵母克隆于IOmlSC-U(SyntheticCompletemediumwithoutUracil) 液体培养基中，28 °C，过夜培养。
[0082]3.次日，取I. 5ml过夜培养物接种到25ml新鲜的SC-U培养液中（含1 %NP40)， 28〇C, 180rpm〇
[0083] 4.当培养液0D600到0· 4-0.6之间，添加Iml浓度为50%的半乳糖，22°C，180rpm， 继续培养48小时。使培养液OD值为I. 0,然后按1、1/10、1/20、1/40、1/60、1/100分别对培 养液进行酵母浓度梯度稀释，取各浓度的培养液2μL，点在含有油酸的酵母SC-U固体培养 基上，28°C培养72h。结果显示（附图1)，酵母浓度在OD值为I. 0时，转空载体pYES2的酵母 突变体H1246在含有油酸的酵母固体培养基上只有少量生长，经梯度稀释后生长几乎完全 受到抑制；而转空载体PYES2的野生型SCY62酵母和转PiDGAT2-4基因的酵母突变体H1246 在OD值为1.0时正常生长，经梯度稀释后仍能不同程度继续生长，表明在转PiDGAT2-4基 因的酵母突变体H1246细胞中有TAG的合成，也即PiDGAT2-4基因编码产物具有二酰甘油 酰基转移酶活性。
[0084] 实施例5 :PiDGAT2_4二酰甘油酰基转移酶活性在酵母中的测定
[0085] 1.收集实施例4中液体培养48h的酵母培养液，室温7000rpm离心IOmin,收集菌 体约0. 35g，然后用500μL磷酸缓冲液重新悬浮。用超声波细胞破碎仪破碎30min，已破碎 酵母细胞壁。破碎频率为振荡l〇s，间隔10s。
[0086] 2.选用普利莱基因技术有限公司（ApplygenTechnologies)的甘油三酯酶法测 定试剂盒PlasmatriglycerideassaykitE1003测定酵母中甘油三酯的浓度。按试剂盒 说明书配制工作液：按体积4:1比例，取4mL试剂Rl与ImL试剂R2混合即可，立即使用或 4°C保存〈ld，变色弃去。
[0087] 3.标准品稀释：4mM甘油三酯标准品用蒸馏水稀释为2000、1000、500、250、125、 62. 5、31. 25、15. 625 μ M，注意设置0浓度对照反应管。
[0088] 4.按照试剂盒操作说明向标准品和测定样品中添加试剂。
[0089] 5. 37?反应IOmin。
[0090] 6.用蒸馏水空白管调零，然后在550nm波长下测定各管OD值。
[0091] 7.绘制标准曲线（附图2)并计算待测样品的甘油三酯浓度。结果显示（附图3)， 转空载体PYES2的野生型SCY62酵母细胞中TAG含量为54. 17μM，转空载体pYES2的酵母 突变体Η1246细胞中TAG含量为4. 90μΜ，转pYES2:PiDGAT2-4载体的酵母突变体Η1246细 胞中TAG含量达到64. 17μM，明显高于野生型酵母，说明PiDGAT2-4基因编码产物具有较高 的二酰甘油酰基转移酶活性。
【权利要求】
1. 马铃薯致病疫霉二酰甘油酰基转移酶基因 DGAT2-4,其特征在于其核苷酸序列如 SEQ. ID. NO 1所示；其氨基酸序列如SEQ. ID. NO 2所示。
2. 如权利要求1所述的基因 DGAT2-4在提高植物和微生物中油份含量中的应用。
【文档编号】C12N1/19GK104357467SQ201410665651
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月19日 优先权日:2014年11月19日
【发明者】亓宝秀, 李新征, 孙美红, 宋宪亮 申请人:山东农业大学