专利名称：重组噬菌体在膜生物反应器的连续生产方法
技术领域：
本发明涉及一种重组噬菌体的生产方法，尤其涉及一种在膜生物反应器里连续生产重组噬菌体的方法，属于生物工程技术领域。
目前利用大肠杆菌生产重组蛋白质的过程，是将克隆了外来蛋白质的质粒转化大肠杆菌细胞，发酵培养大肠杆菌，在大肠杆菌细胞内表达外来蛋白质，然后提取分离所表达的蛋白质，达到生产蛋白质的目的。生产过程多为间歇发酵生产，而且所表达的蛋白质多是以不溶性的内含体形式存在，活性低，蛋白质的分离提纯较为复杂，蛋白质的活性需要以其他再折叠技术进行复性处理。
重组噬茵体技术在八十年代得到重视，并有利用重组的T4噬菌体制备蛋白质的专利出现。九十年代以来，噬菌体抗体技术迅速发展，利用DNA重组技术，可将外来蛋白融合在噬菌体的基因3蛋白上，它可以快速筛选和生产抗体可变片段和其他生物活性的蛋白质，如Bothmann H．and Pluckthun A．(NatureBiotechnology，1998，16376—380)介绍的方法，可用于生产可溶性的蛋白质，先是在大肠杆菌中转化噬菌粒，将有生物活性的蛋白质表达在大肠杆菌的周质，再进行分离提纯。其过程类似于蛋白质在大肠杆菌中的生产，也是间歇发酵生产。由于所表达的外来蛋白质对细胞的毒性，该方法的特点是产率较低，分离过程繁琐。连续生产重组噬菌体的技术迄今尚未见报道。
本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一种新的重组噬菌体的生产方法，这种方法可在膜生物反应器系统里实行高密度培养大肠杆菌宿主，连续生产重组噬菌体，进而生产外来稀有的具有高度生物活性的蛋白质。
为了实现这样的目的，本发明利用DNA重组技术构建融合蛋白基因，将外来的稀有目标蛋白融合在丝状噬菌体的基因3蛋白上，并在重组噬菌体的外来蛋白和基因3蛋白之间设计嵌入了一个蛋白酶酶切位点，利用蛋白酶水解重组噬菌体，进而分离纯化外来蛋白质，而且保持该蛋白质原来的生物活性，从而达到连续生产外来稀有的具有高度生物活性的蛋白质的目的。
本发明的具体方案为1、利用DNA重组技术，在含有噬菌体基因3蛋白基因的表达噬菌粒上克隆外来蛋白基因，即将外来的目标蛋白，如抗NP的单链抗体可变片段、GFP抗体融合蛋白等基因工程活性蛋白质，融合在丝状噬菌体的基因3蛋白上，该基因3蛋白为截断的基因3蛋白，去除了其N—末端的部分氨基酸，可以大大降低重组的噬菌体对大肠杆菌宿主细胞的超感染。
2、在重组噬菌体的外来蛋白和基因3蛋白之间的融合位置中设计有一蛋白酶酶切位点，将重组的表达噬菌粒转化大肠杆菌宿主细胞。
3、在膜生物反应器中，将包含重组噬菌粒的大肠杆菌细胞，如XL1—Blue，TG1，NF1829等，进行间歇搅拌发酵，并通入无菌空气，培养液的pH值控制在5～7之间。生产过程中发酵温度为28～42℃，培养基为适合大肠杆菌生产的培养基，如SB、限制性培养基等。
4、1～2个小时后添加辅助噬菌体，如M13KO7，VCSM13，R408等。在辅助噬菌体的参与下，融合有外来蛋白质的重组噬菌体可以寄宿于大肠杆菌宿主细胞进行繁殖，在膜生物反应器系统里实行连续高密度生产重组噬菌体。
5、间歇发酵5～8个小时后达到指数增长期，即开始料液循环，转为连续培养，选择微过滤膜的孔径约为0．2～0．3μm，每小时循环量约为反应器料液的1．5～3．0倍，连续生产的稀释率为0．1～0．2。
因为大肠杆菌宿主和基因工程重组噬菌体的尺寸上有大小差异，分别为0．5μm和50～100nm，合理选择微过滤膜的孔径，可使重组噬菌体连续渗透通过膜生物反应器的滤膜，而大肠杆菌宿主细胞则被循环发酵，繁殖重组噬菌体。这样在膜生物反应器系统中，大肠杆菌可以高密度发酵，并可连续生产重组噬菌体。
循环后同时进料，同时出料，保持稳态生产过程，可在较长时间内连续释放含外来蛋白的重组噬菌体，通过膜生物反应器的产品中不含大肠杆菌细胞，只含重组噬菌体及一部分可溶性的目标蛋白质。
6、在产品中加入一定比例的蛋白酶，如凝血酶、胰酶等，在酶反应器中进行蛋白酶解反应，然后利用亲和层析柱，通过亲和色谱分离和纯化目标蛋白质。
本发明具有显著的效果，由于在重组噬菌体上的外来蛋白和基因3蛋白之间预先设计了一个蛋白酶酶切识别位点，可利用凝血酶、胰酶等蛋白酶水解重组噬菌体，并将水解后的蛋白质溶液通过亲和凝胶过滤柱，从而利用亲和色谱分离和纯化外来蛋白质，使该蛋白质保持原有的高度生物活性，并且实现了连续生产外来蛋白质的目的。本发明提供的技术生产的蛋白质产量虽然总体上仍然较低，但是比间歇培养生产重组噬菌体的产量要高，有很大优越性，并且由于外来的蛋白质是分泌于大肠杆菌的胞外，蛋白质的生物活性较其他表达方式要高，故对于价格昂贵、活性要求高的蛋白质生产不失为一条可行之路。另外，本发明克服了间歇生产时外来蛋白分泌于周质，对宿主细胞产生的毒性问题。
本发明将基因工程技术、大肠杆菌高密度发酵培养、重组噬菌体的连续生长培养相结合，利用膜生物反应器系统可以高密度发酵大肠杆菌宿主，连续高密度生产重组噬菌体，进而连续生产外来稀有的具有高度生物活性的蛋白质。本发明可以实现大规模生产外来蛋白质而工艺成本较低，所生产的蛋白质为细胞外分泌，生物活性高，分离方便。
以下通过具体的实施例来对本发明的技术方案作进一步详细描述。
实施例1具有高度活性的抗体可变片段的生产。
利用DNA重组技术，将抗NP的单链抗体可变片段(ScFv)融合于表达噬菌粒的截断的基因3蛋白上，融合位置中设计有一凝血酶识别位点。噬菌粒转化大肠杆菌菌株XL1—Blue，培养时添加辅助噬菌体M13KO7，浓度为108pfu／ml。在一容积为2升的膜生物反应器系统连续生产重组了抗NP抗体可变片段的噬菌体，培养基为SB培养基。微过滤膜上的微孔直径为0．2μm。产量为300ml／hr，发酵温度为37℃，料液循环量为3000mL／hr，发酵6个小时后连续释放的重组噬菌体的单位为1013cfu／ml以上。对该重组噬菌体进行收集后，加以凝血酶酶解(每10mL约1个单位)，利用亲和分离柱分离纯化制备抗体可变片段。同时大肠杆菌周质中还可提取抗体可变片段。总的蛋白质产量为3mg／L。
实施例2具有高度活性的GFP抗体融合蛋白的生产。
利用DNA重组技术，将GFP抗体融合在表达噬菌粒的截断的基因3蛋白上，融合位置中设计有一凝血酶识别位点。将该噬菌粒转化大肠杆菌菌株TG1，添加辅助噬菌体VCSM13，浓度为108pfu／ml。在一容积为2升的膜生物反应器系统连续生产重组了GFP抗体融合蛋白的噬菌体，培养基为SB培养基和其他微量元素及无机盐。微过滤膜上的微孔直径为0．2μm。产量为300ml／hr，发酵温度为30℃，料液循环量为3000mL／hr，发酵7个小时后连续释放的重组噬菌体的单位为1013cfu／ml以上。对该重组噬菌体进行浓缩10倍收集，加以凝血酶酶解(每ml约1个单位)，利用亲和分离柱分离纯化制备GFP抗体融合蛋白。同时大肠杆菌周质中还可提取GFP抗体融合蛋白。总的蛋白质产量为5mg／L。
实施例3具有高度活性的碱性磷酸酶的生产。
利用DNA重组技术，将碱性磷酸酶基因融合在表达噬菌粒的截断的基因3蛋白上，融合位置中设计有一胰酶识别位点。将该噬菌粒转化大肠杆菌菌株TG1，添加辅助噬菌体R408，浓度为108pfu／ml。在一容积为1升的膜生物反应器系统连续生产重组了碱性磷酸酶的噬菌体，培养基为SB培养基和其他微量元素及无机盐。微过滤膜上的微孔直径为0．2μm。产量为160mL／hr，发酵温度为37℃，料液循环量为2000mL／hr，发酵6个小时后连续释放的重组噬菌体的单位为1013cfu／mL以上。对该重组噬菌体进行收集后，加入胰酶酶解(每ml约3个单位)，然后利用亲和分离柱分离纯化制备碱性磷酸酶。同时大肠杆菌周质中还可提取碱性磷酸酶。总的蛋白质产量为10mg／L。
权利要求
1.一种重组噬菌体在膜生物反应器的连续生产方法，其特征在于(1)、利用DNA重组技术，将外来的目标蛋白融合在丝状噬菌体的基因3蛋白上，该基因3蛋白为截断的基因3蛋白，去除了其N—末端的部分氨基酸；(2)、在重组噬菌体的外来蛋白和基因3蛋白之间的融合位置中设计有—蛋白酶酶切位点，将重组的表达噬菌粒转化大肠杆菌宿主细胞；(3)、在膜生物反应器中，将包含重组噬菌粒的大肠杆菌细胞进行间歇搅拌发酵，并通入无菌空气，培养液的pH值控制在5～7之间，生产过程中发酵温度为28～42℃；(4)、1～2个小时后添加辅助噬菌体；(5)、间歇发酵5～8个小时后开始进行料液循环，转为连续培养，选择微过滤膜孔径为0．2～0．3μm，每小时循环量为反应器料液的1．5～3．0倍，连续生产的稀释率为0．1～0．2，循环后同时进料，同时出料，保持稳态生产过程；(6)、在产品中加入蛋白酶，进行蛋白酶解反应，然后通过亲和色谱分离和纯化目标蛋白质。
2.如权利要求1所说的重组噬菌体在膜生物反应器的连续生产方法，其特征在于所说的外来目标蛋白为抗NP的单链抗体可变片段(ScFv)、GFP抗体融合蛋白、碱性磷酸酶等基因工程活性蛋白质。
3.如权利要求1所说的重组噬菌体在膜生物反应器的连续生产方法，其特征在于所说的大肠杆菌宿主细胞为XL1—Blue，TG1，NF1829等。
4.如权利要求1所说的重组噬菌体在膜生物反应器的连续生产方法，其特征在于添加的辅助噬菌体为M13KO7，VCSM13，R408等。
5.如权利要求1所说的重组噬菌体在膜生物反应器的连续生产方法，其特征在于所说的蛋白酶解反应所加的蛋白酶为凝血酶或胰酶，培养基为适合大肠杆菌生产的培养基，如SB、限制性培养基等。
全文摘要
本发明是一种重组噬菌体在膜生物反应器的连续生产方法,利用DNA重组技术,将外来的目标蛋白融合在丝状噬菌体的截断的基因3蛋白上,在膜生物反应器系统里实行高密度培养大肠杆菌宿主,连续生产重组噬菌体,并在重组噬菌体上的外来蛋白和基因3蛋白之间预先设计一个蛋白酶酶切识别位点,利用蛋白酶水解重组噬菌体,水解后的蛋白质溶液通过亲和色谱分离纯化外来蛋白质,实现了连续生产外来稀有蛋白质,并使该蛋白质保持原来的高度生物活性。
文档编号C12N1/21GK1280188SQ0011948
公开日2001年1月17日 申请日期2000年7月20日 优先权日2000年7月20日
发明者张雪洪, 唐涌濂 申请人:上海交通大学