专利名称：与四环素结合的蛋白TetR在检测四环素类抗生素中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及与四环素结合的蛋白TetR在检测四环素类抗生素中的应用。
背景技术：
四环素类抗生素(tetracycline antibiotics)是由放线菌产生的一类广谱抗生素，包括金霉素(chlotetracycline)、土霉素(oxytetracycline)> 四环素(tetracycline)及半合成衍生物甲烯土霉素、强力霉素、二甲胺基四环素等，其结构均含并四苯基本骨架。四环素类抗生素具有如下应用作为预防和治疗畜禽疾病的兽药，作为促进畜禽生长的饲料添加剂，在水产养殖业中用于治疗多种鱼类疾病，在乳业中用于提高奶牛产奶 量，在养蜂业中用于预防蜜蜂的感染性疾病。四环素类抗生素过量使用不可避免的使母体、代谢产物等相关抗生素残留于动物的肌肉、蛋、奶、脏器组织中，影响人体健康。鉴于抗生素的作用与危害并存，动物性食品中四环素族抗生素的残留问题受到关注，各国制定了动物源性食品中兽药最高残留标准和检测方法。我国2002年农业部发布的235公告中规定土霉素/金霉素/四环素在所有动物性食品的肌肉中的含量不得高于IOOii g/kg，在牛奶及羊奶中的含量也不能超过IOOii g/kg。
发明内容
本发明的目的是提供与四环素结合的蛋白TetR (又称TetR蛋白)在检测四环素类抗生素中的应用。本发明公开了 TetR蛋白在检测四环素类抗生素中的应用；所述TetR蛋白是如下Ca)或(b)或(C)(a)由序列表中序列I自N末端第2至207位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c)将(a)或(b)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与四环素类抗生素结合的由(a)衍生的蛋白质。所述TetR蛋白可用于制备检测四环素类抗生素的试剂盒。本发明还保护一种检测四环素类抗生素的试剂盒，包括所述TetR蛋白(包被原)。所述试剂盒还包括洗涤液、样品稀释液、底物显色液和终止液中的至少一种。每I升洗涤液可按照如下方法配制得到将IOml吐温20、5g叠氮化钠和990ml磷酸盐缓冲液混合，得到洗涤液。所述磷酸盐缓冲液可为PH7. 2-7. 6,0. 005M-0. 015M的磷酸盐缓冲液，具体可为的浓度可为pH7. 4,0. 01M)的磷酸钠缓冲液。所述样品稀释液可为pH7. 2,0. IM的PBS缓冲液。所述底物显色液包括显色液A和显色液B，可为独立包装的显色液A和显色液B，也可直接将显色液A和显色液B等体积混合得到。所述显色液可为过氧化氢溶液或过氧化脲溶液；所述显色液B可为邻苯二胺(OPD)溶液或四甲基联苯胺(TMB)溶液。所述显色液A具体可为2% (g/100ml)过氧化脲水溶液。所述显色液B具体可为1% (g/100ml)四甲基联苯胺水溶液。所述终止液具体可为0. 2M硫酸水溶液。所述TetR蛋白可用于制备检测四环素类抗生素的试纸条。本发明还保护一种检测四环素类抗生素的试纸条，由样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫组成；沿试纸条的轴向，样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫依次按顺序连接，样品吸收垫的末端与胶体金垫的始端相连，胶体金垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水塾的始端相连；
所述胶体金垫上包被有胶体金标记的N末端具有His标签的所述TetR蛋白；所述反应膜上有检测区和质控区，检测区(T线)和质控区(C线)均为与试纸条轴向垂直的条带状；检测区位于靠近胶体金垫末端的一侧；质控区位于远离胶体金垫末端的一侧；检测区包被有包被原，质控区包被有His-tag单克隆抗体；所述包被原为四环素与载体蛋白的偶联物；所述试纸条上还可具有样品孔，所述样品孔位于样本吸收垫上远离胶体金垫末端
的一端。所述载体蛋白具体可为卵清白蛋白(0VA)。以上任一所述TetR蛋白具体可为采用以下方法制备得到的蛋白质培养重组菌，得到所述与四环素结合的蛋白TetR ;所述培养过程中加入IPTG作为诱导剂；所述重组菌为将重组质粒导入大肠杆菌得到的重组菌。所述重组表达载体具体可为在载体pET28b的多克隆位点插入所述与四环素结合的蛋白TetR的编码基因得到的重组质粒。所述重组表达载体更具体可为在载体pET28b的NdeI和XhoI酶切位点之间插入所述编码基因得到的重组质粒。所述编码基因具体可为如下I) -4)中任一所述的DNA分子I)序列表中序列2自5’末端第4至624位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)所述的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；4)与I)或2)所述的DNA分子具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。所述严格条件为在0. I XSSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌BL21 (DE3)。所述重组菌更具体可为LYP-BLR (又称重组菌LYP-BLR-6)。LYP-BLR属于大肠埃希氏菌(Escherichia coli),已于2012年2月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 5759。所述方法中，在培养体系的OD6tltl为0. 6时，加入所述IPTG，使IPTG在所培养体系中的浓度为ImM。以上任一所述四环素类抗生素具体可为具有并四苯骨架的化合物。以上任一所述四环素类抗生素具体可为四环素、土霉素、金霉素或强力霉素。本发明试剂盒和胶体金试纸卡具有灵敏度高、准确度高、精密度高、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点；能同时快速检测大批量样品，可实现现场高通量快速检测。因此，本发明的试剂盒、胶体金试纸及检测方法在四环素类抗生素的检测中将发挥重大作用。
图I为实施例5的步骤三得到的标准曲线图。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。载体pET28b购自德国Merk(Novagen)公司，产品目录号为69865。大肠杆菌BL21(DE3)购自德国Merk(Novagen)公司，产品目录号为69387。T4DNALigase购自美国Promega公司，产品目录号为M1801S。辣根过氧化物酶(HRP)购自美国Sigma公司。BCA蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司。载体PMD19-T购自TAKARA公司，产品目录号为D102A。His-tag单克隆抗体和HRP标记的羊抗鼠抗体购自天根生化科技(北京)有限公司，产品目录号分别为AB102-02和SAlOl-Ol。四环素购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为87128,结构见式(I )。土霉素购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为05875,结构见式(II )。 金霉素购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为C4881,结构见式(III)。强力霉素购自美国Sigma-Aldrich公司，产品目录号为44577，结构见式(IV)。
权利要求
1.TetR蛋白在检测四环素类抗生素中的应用；所述TetR蛋白是如下(a)或(b)或(c): Ca)由序列表中序列I自N末端第2至207位氨基酸残基组成的蛋白质； (b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (C)将(a)或(b)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与四环素类抗生素结合的由(a)衍生的蛋白质。
2.TetR蛋白在制备检测四环素类抗生素的试剂盒中的应用；所述TetR蛋白是如下(a)或(b)或(c) Ca)由序列表中序列I自N末端第2至207位氨基酸残基组成的蛋白质； (b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (C)将(a)或(b)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与四环素类抗生素结合的由(a)衍生的蛋白质。
3.—种检测四环素类抗生素的试剂盒，包括TetR蛋白；所述TetR蛋白是如下(a)或(b)或(C) Ca)由序列表中序列I自N末端第2至207位氨基酸残基组成的蛋白质； (b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (C)将(a)或(b)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与四环素类抗生素结合的由(a)衍生的蛋白质。
4.TetR蛋白在制备检测四环素类抗生素的试纸条中的应用；所述TetR蛋白是如下(a)或(b)或(c) Ca)由序列表中序列I自N末端第2至207位氨基酸残基组成的蛋白质； (b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (C)将(a)或(b)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与四环素类抗生素结合的由(a)衍生的蛋白质。
5.一种检测四环素类抗生素的试纸条，由样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫组成； 沿试纸条的轴向，样品吸收垫、胶体金垫、反应膜和吸水垫依次按顺序连接，样品吸收垫的末端与胶体金垫的始端相连，胶体金垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水塾的始端相连； 所述胶体金垫上包被有胶体金标记的N末端具有Hi s标签的TetR蛋白；所述TetR蛋白是如下(a)或(b)或(c): (a)由序列表中序列I自N末端第2至207位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(C)将(a)或(b)经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与四环素类抗生素结合的由(a)衍生的蛋白质； 所述反应膜上有检测区和质控区，检测区和质控区均为与试纸条轴向垂直的条带状；检测区位于靠近胶体金垫末端的一侧；质控区位于远离胶体金垫末端的一侧；检测区包被有包被原，质控区包被有His-tag单克隆抗体；所述包被原为四环素与载体蛋白的偶联物。
全文摘要
本发明公开了一种与四环素结合的蛋白TetR(又称TetR蛋白)在检测四环素类抗生素中的应用；所述TetR蛋白是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1自N末端第2至207位氨基酸残基组成的蛋白质；(b)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。所述TetR蛋白可用于制备检测四环素类抗生素的试剂盒或检测四环素类抗生素的试纸条。本发明试剂盒和胶体金试纸卡具有灵敏度高、准确度高、精密度高、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点；能同时快速检测大批量样品，可实现现场高通量快速检测。因此，本发明的试剂盒、胶体金试纸及检测方法在四环素类抗生素的检测中将发挥重大作用。
文档编号G01N33/68GK102680711SQ20121016665
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月25日 优先权日2012年5月25日
发明者徐飞, 李向梅, 李娜, 杨光, 王战辉, 赵宁 申请人:北京维德维康生物技术有限公司