一种测定富含蛋白质样品中四环素类抗生素残留的方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测富含蛋白质样品中四环素类抗生素残留的方法，该方法用胰蛋白酶溶液酶解法除蛋白质，消除了生物基质样品中蛋白质对测定四环素的干扰，避免了采用沉淀法除蛋白带来的损失，前处理步骤简单、快速，选用固相萃取技术对样品进行浓缩和净化，所用有机溶剂用量少，可有效防止样品间的交叉污染，具有回收率高，精密度好等特点，可适用于鸡饲料、动物组织的富含蛋白质的生物质样品中四环素类抗生素的检测，克服现了现有检测四环素类抗生素方法回收率严重偏低，不能满足分析要求的不足。
【专利说明】—种测定富含蛋白质样品中四环素类抗生素残留的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分析化学领域，具体为准确测定鸡肉、猪肉及其饲料中四环素类抗生素残留的方法。
【背景技术】
[0002]近年来，四环素类抗生素作为一类广谱抗生素，因其价格低、抗菌谱广、饲料报酬高等优点而在养殖业上被广泛地应用。其中土霉素、四环素、金霉素及强力霉素应用最多。四环素类抗生素进入机体后，一部分经过代谢反应生成无活性的产物，一部分则以原形及活性代谢物排到体外进入环境。人若长期摄入四环素残留超标的食品或长期生活在含有这些残留抗生素的环境中，会导致耐药菌的滋生，危害人体健康。因此，食品及环境中四环素等典型兽药残留的准确测定受到越来越多的关注。
[0003]针对含有四环素类抗生素的实际样品，人们提出了多种样品前处理方法和检测方法。马丽丽等采用液相色谱串联质谱测定了土壤中的土霉素、四环素、金霉素，其回收率在62.2%-85.4%之间(分析化学，2010,38(1):21-26);孙刚等也采用类似方法，测定了畜禽粪便中的土霉素、四环素、金霉素，三种抗生素的加标回收率介于51.3% -93.7%之间(环境化学，2010，29 (4):739-743)。由于生物样品基质成分复杂，干扰物质多，且通常四环素类抗生素在样品中的残留浓度很低，因此需采用适当的前处理方法来净化样品和消除干扰。邱彬等采用PH3.5的Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液，振荡离心提取、C18固相萃取柱净化除杂等前处理方法，再结合液质联用技术测定了鳗鱼中的土霉素、四环素、金霉素、强力霉素，其测定下限为10.0mg kg_H中国发明专利，CN102998159A);伍钧等利用高效液相色谱测定了土壤中四环素类抗生素残留量，试样经PH4.0Mcllvaine-Na2EDTA缓冲液提取，后用HLB固相小柱净化和富集，其加标回收率为81.7% (中国发明专利，CN102401818A)。
[0004]然而，对于富含蛋白质的动物组织及动物饲料样品，由于四环素类抗生素与蛋白质之间存在明显的相互作用，采用缓冲溶液直接提取的前处理方法，无法将样品中与蛋白质强烈结合的四环素类抗生素提取完全，需要再利用三氯乙酸等有机酸沉淀去除蛋白质。尽管三氯乙酸能高效沉淀蛋白，但在沉淀过程中与蛋白质结合紧密的四环素类抗生素，会与蛋白质一同被沉淀，无法被提取，造成测定结果仍然偏低。例如，Fedeniuk等人采用高效液相色谱法测定不同样品基质中土霉素含量时发现，对水样中土霉素的回收率可高达90% ;而在猪肉组织中的土霉素时，回收率却很低，不到70%。他们认为是猪肉组织中的蛋白质等成分影响了四环素的测定(J.Chromatogr.B, 1996,677,291-297)。Cherlet等人用三氯乙酸除蛋白、采用液质联用技术测定猪组织中的四环素类抗生素时，发现这些抗生素的回收率都很低，均小于25%，其中强力霉素的回收率最低，只有7% (Anal.Chim.Acta,2003,492,199-213)。因此，针对富含蛋白质的动物组织及鸡饲料样品，必需开发一种有效去除蛋白质且能准确测定其中四环素类抗生素含量的新方法。
【发明内容】
[0005]本发明的任务是提供一种检测富含蛋白质样品中四环素类抗生素残留的方法，即结合液相色谱技术，建立一种高效、准确的测定富含蛋白质样品中四环素类抗生素的方法，使其具有简便、快速、回收率高的除蛋白方法，以克服现有检测四环素类抗生素方法回收率严重偏低，不能满足分析要求的不足。
[0006]实现本发明的技术方案是:
[0007]本发明提供的检测富含蛋白质样品中四环素类抗生素残留的方法，包括以下步骤:
[0008](I)绘制四环素类抗生素液相色谱串联质谱法标准曲线，浓度范围为
0.4mgL L1.5mg L 1 ；
[0009]1、一种测定富含蛋白质的样品中四环素类抗生素的方法，包括以下步骤:
[0010](I)绘制相应的四环素类抗生素液相色谱串联质谱法标准曲线。
[0011](2)取待测的含蛋白质的液体样品或含水分的含蛋白质的固体样品或干燥的含蛋白质的固体样品用1wery法测定样品中蛋白质的含量。
[0012](3)酶解法除蛋白:称取经步骤(2)测得蛋白质含量的待测的含蛋白质的样品，按所称取样品中蛋白质摩尔量五十分之一的比例加入胰蛋白酶溶液，80W超声8min或100W超声酶解6min或120W超声4min，得到酶解液；
[0013](4)四环素类抗生素提取:向步骤(3)得到的酶解液中加入提取剂，用以提取样品中四环素类抗生素，再用盐酸调pH为2至3，然后离心收集上清液，所述的提取剂是柠檬酸-乙二胺二钠(Mcllvaine-Na2EDTA)缓冲液；
[0014](5)净化上清液:将步骤⑷得到的上清液通过亲水亲油固相萃取聚合小柱(HLB柱)分离，萃取富集收集洗脱液，过滤后得滤液；
[0015](6)利用高效液相色谱测定步骤(5)得到的滤液中的四环素抗生素浓度，将液相色谱仪中得到的峰面积代入步骤(I)所作标准曲线中，求得抗生素浓度。
[0016]上述方法中，所述的含蛋白质的液体样品是蛋白质溶液或血浆；所述的含水分的含蛋白质的固体样品是动物组织或内脏；如所述的固体样品具体可以是鸡饲料、鸡肉及猪肉等样品。将从养鸡场或超市采集或购买的样品，置于清洁的塑料样品袋中，经冻干后磨细，50目过筛。采用Lowery法测定其中蛋白质含量；所述的液体样品可以是已知蛋白质浓度的蛋白质溶液。所述的干燥的含蛋白质固体样品是饲料。
[0017]所述的四环素类抗生素是土霉素、四环素、金霉素、强力霉素或去甲基金霉素。
[0018]步骤(2)中所述的用1wery法测定样品中蛋白质含量的具体方法是:含蛋白质的液体样品直接测定；含水分的含蛋白质的固体样品冷冻干燥后研磨过50目筛取筛下部分测定；干燥的含蛋白质的固体样品研磨过50目筛取筛下部分测定。
[0019]步骤(5)中所述的将步骤(4)得到的上清液通过亲水亲油固相萃取聚合小柱(HLB柱)分离，萃取富集收集洗脱液，过滤后得滤液的具体方法是；将步骤(4)收集的上清液采用HLB固相萃取柱分离，先用甲醇和水活化小柱，上样后用5mL5%甲醇水溶液淋洗，再用8mL30%甲醇-乙酸乙酯洗脱，萃取富集收集洗脱液在40°C下氮吹至近干，用ImL甲醇复溶，之后溶液过0.22 μ m滤膜得滤液。
[0020]步骤(6)中所述的利用高效液相色谱测定步骤(5)得到的滤液中的四环素类抗生素浓度的具体方法是:流动相由甲醇、乙腈和0.1%甲酸组成，三者的体积比为1: 2: 7，柱温为30°C，进样量为20 μ L，紫外检测器波长设定为355nm，质谱检测器设置参数为毛细管电压:2.5kV ;锥孔电压:17V ;离子源温度:120°C ;脱溶剂气温度:350°C ;脱溶剂气流速:550L h'
[0021]上述方法中，所述的提取液为pH为4.0的柠檬酸-乙二胺四乙酸钠(Mcllvaine-Na2EDTA)缓冲液，配制方法为:称取13.8g磷酸氢二钠溶液，6.45g柠檬酸，
4.65g乙二胺四乙酸二钠用蒸懼水溶解并定容至250mL。
[0022]所述液质联用方法的测定条件为:仪器:Waters2695配有Waters Acquity TQD质谱检测器；色谱柱:Z0RBAX SB-C18 柱(4.6mmX 150mm，5 μ m)，柱温:30°C，进样量:20 μ L ;流动相:甲醇、乙腈和0.1 %甲酸水溶液，按10: 20: 70之比例均匀混合而成，流速为0.2ml HiirT1 ;毛细管电压:2.5kV ;锥孔电压:17V ;离子源温度:120°C ;脱溶剂气温度:3500C ;脱溶剂气流速:550L h-1。
[0023]本发明的优点:消除了生物基质样品中蛋白质对测定四环素的干扰，避免了采用沉淀法除蛋白带来的损失；前处理步骤简单、快速，选用固相萃取技术对样品进行浓缩和净化，所用有机溶剂用量少，防止了样品间的交叉污染。本发明方法的回收率高，精密度好，可适用于鸡饲料、动物组织的富含蛋白质的生物质样品中四环素类抗生素的检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1牛血清蛋白 溶液中四环素类抗生素回收率，由图可见，四种四环素类抗生素的回收率可达100%，说明本方法的准确性好；
[0025]图2 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素、去甲基金霉素总离子流图及提取离子流图，在该条件下，26min可完成样品分析过程，且没有其他杂质干扰。
【具体实施方式】
[0026]下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步的详细阐述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
[0027]按照本发明的
【发明内容】
实施本发明，所需试剂溶液的配制方法如下:柠檬酸-乙二胺四乙酸钠(Mcllvaine-Na2EDTA)缓冲液(ρΗ4.0):称取13.8g磷酸氢二钠溶液，6.45g柠檬酸，4.65g乙二胺四乙酸二钠用蒸馏水溶解并定容至250mL ;四环素类抗生素标准储备液(IOOmg L-1):分别称取土霉素、四环素、金霉素、强力霉素、去甲基金霉素各10mg，用蒸馏水定容至IOOmL ;胰蛋白酶储备液(300mg ?Λ?2.5μΜ):称取30mg胰蛋白酶，用用蒸馏水定容至IOOmL ;牛血清白蛋白储备液(100g L^a.SmM):称取2.5g胰蛋白酶，用蒸馏水定容至 25mL。
[0028]实施例1溶液样品中四环素类抗生素测定
[0029]以牛血清蛋白溶液为供试样品，考察在不同浓度牛血清蛋白溶液中，四环素类抗生素加标回收率情况。
[0030](I)绘制标准曲线:线性范围为0.5mg L_1-8mg L_S结果见表1。如表中所示,该法测定所得标曲线性良好，满足定量分析标准。
[0031]表1四环素类抗生素高效液相色谱标准曲线
[0032]
【权利要求】
1.一种测定富含蛋白质的样品中四环素类抗生素的方法，包括以下步骤: (1)绘制相应的四环素类抗生素液相色谱串联质谱法标准曲线。 (2)取待测的含蛋白质的液体样品或含水分的含蛋白质的固体样品或干燥的含蛋白质的固体样品用1wery法测定样品中蛋白质的含量。 (3)酶解法除蛋白:称取经步骤(2)测得蛋白质含量的待测的含蛋白质的样品，按所称取样品中蛋白质摩尔量五十分之一的比例加入胰蛋白酶溶液，80W超声8min或IOOW超声酶解6min或120W超声4min，得到酶解液； (4)四环素类抗生素提取:向步骤(3)得到的酶解液中加入提取剂，用以提取样品中四环素类抗生素，再用盐酸调PH为2至3，然后离心收集上清液，所述的提取剂是柠檬酸-乙二胺二钠(Mcllvaine-Na2EDTA)缓冲液； (5)净化上清液:将步骤(4)得到的上清液通过亲水亲油固相萃取聚合小柱(HLB柱)分离，萃取富集收集洗脱液，过滤后得滤液； (6)利用高效液相色谱测定步骤(5)得到的滤液中的四环素抗生素浓度:将液相色谱仪中得到的峰面积代入步骤(1)所作标准曲线中，求得抗生素浓度。
2.根据利要求I所述的方法，其特征在于:所述的含蛋白质的液体样品是蛋白质溶液或血浆；所述的含水分的含蛋白质的固体样品是动物组织或内脏；所述的干燥的含蛋白质固体样品是饲料。
3.根据利要求I所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的用1wery法测定样品中蛋白质含量的具体方法是:含蛋白质的液体样品直接测定；含水分的含蛋白质的固体样品冷冻干燥后研磨过50目筛取筛下部分测定；干燥的含蛋白质的固体样品研磨过50目筛取筛下部分测定。
4.按权利要求1所述的的方法，其特征在于，步骤(5)所述的将步骤(4)得到的上清液通过亲水亲油固相萃取聚合小柱(HLB柱)分离，萃取富集收集洗脱液，过滤后得滤液的具体方法是；将步骤⑷收集的上清液采用HLB固相萃取柱分离，先用甲醇和水活化小柱，上样后用5mL5%甲醇水溶液淋洗，再用8mL30%甲醇-乙酸乙酯洗脱，萃取富集收集洗脱液在40°C下氮吹至近干，用ImL甲醇复溶，之后溶液过0.22 μ m滤膜得滤液。
5.按权利要求1所述的的方法，其特征在于，步骤(6)所述的利用高效液相色谱测定步骤(5)得到的滤液中的四环素类抗生素浓度的具体方法是:流动相由甲醇、乙腈和0.1%甲酸组成，三者的体积比为1: 2: 7，柱温为30°C，进样量为20 μ L，紫外检测器波长设定为355nm，质谱检测器设置参数为毛细管电压:2.5kV ;锥孔电压:17V ;离子源温度:120°C ；脱溶剂气温度:350°C ;脱溶剂气流速:550L IT1。
6.按权利要求1所述的的方法，其特征在于，所述的四环素类抗生素是土霉素、四环素、金霉素、强力霉素或去甲基金霉素。
7.按权利要求1所述的的方法，其特征在于，所述的相应的四环素类抗生素液相色谱串联质谱法标准曲线的浓度范围为0.4mg L^1-L 5mg L'
【文档编号】G01N30/02GK103543218SQ201310334436
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年8月2日 优先权日:2013年8月2日
【发明者】朱丽华, 周茜, 王楠, 张英英, 唐和清 申请人:华中科技大学