专利名称：一种南方红豆杉胚离体成苗技术及其所用的培养基的制作方法
技术领域：
本发明南方红豆杉胚离体成苗技术属于生物技术领域，涉及一种南方红豆杉胚的离体培养技术及其所用的培养基。
背景技术：
南方红豆杉(Taxus chinensis var. Maire ),为我国特有的第三纪子遗树种。在自然状态下，由于单性花、雌雄异株、异花授粉等原因，形成的种子数量较少；且种子休眠期长，自然条件下需两冬一夏才能萌芽，萌发率和幼苗成活率低；再加上其生长缓慢(一棵树成材需60年)，在种群中生长和竞争能力弱，致使其天然分布越来越少。此外，由于南方红豆杉具有特殊的材用和药用价值，20世纪80年代以来其资源遭到毁灭性的破坏，现存资 源很少，处于濒危状态，1992年国家林业局将其列为一级保护树种。因此，寻找快速、有效的南方红豆杉种苗繁殖方法对于保护和合理开发利用南方红豆杉资源具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述的技术问题而提供一种南方红豆杉胚离体成苗技术。本发明的技术方案
一种南方红豆杉胚离体成苗技术，即将胚直接从南方红豆杉种子中取出，在培养基上进行人工离体无菌培养，打破胚的休眠，促使其在当年萌发成苗，为南方红豆杉的大规模种植提供了快捷的途径。具体涉及胚的剥离、胚的培养、炼苗及大田种植。一种南方红豆杉胚离体成苗技术，具体包括如下步骤
(I )、南方红豆杉种子胚的剥离
将南方红豆杉种子去掉假种皮，依次用酒精、次氯酸钠消毒，去掉坚硬的外种皮，取出胚，并将胚在无菌水中冲洗干净；
(2)、南方红豆杉胚的培养
将步骤(I)所得的胚接种于培养基上，先在20-22°C条件下暗培养，萌发后移至光照强度约1500 lx，光照12h/d的光下条件进行培养至根长出，即得南方红豆杉试管苗；
所用试管培养基配方按每升计算，由400mg NH4N03>556mg Ca(NO3)2. 4H20、990 mgK2SO4^ 96 mg CaCl2. 2H20、170 mg KH2P04、0. 25 mg Na2MoO4. 2H20、370 mg MgSO4. 7H20、22. 4mgMnSO4. H20、8. 6mg ZnSO4. 7H20、0. 25mg CuSO4. 5H20、27. 8 mg FeSO4. 7H20、37. 3 mg Na2_EDTA、100 mg肌醇、I. Omg维生素B1、0. 5 mg烟酸、0.5 mg维生素B6、2. 0 mg甘氨酸、0. 5mg赤霉素(GA)、0.5mg吲哚乙酸(IAA)、0.5mg 6-苄基嘌呤(6_BA)、20 g蔗糖、6g琼脂及Ig活性炭和余量的水组成；
(3)、瓶内炼苗
将步骤(2)所得的南方红豆杉试管苗置于温度25°C、光强15001x、光照12h/d、RH 80%左右的环境中，打开瓶盖，使之适应环境7d，即可完成瓶内炼苗；(4)、瓶外基质炼苗
将步骤(3)完成瓶内炼苗的试管苗取出，栽植于基质中，所述的基质配方按质量比计算，即草碳蛭石山泥为2:2:6，炼苗室白天温度为20-25°C，晚间为15_18°C、午间光强25-40klx、RH 70% - 85%，经25d即可完成瓶外基质炼苗；
(5)、移栽大田
将步骤(4)完成瓶外基质炼苗的植株种植到大田中即可。
本发明的有益效果
本发明的一种南方红豆杉胚离体成苗技术，由于采用了将胚从种子中分离并进行离体培养的技术方案，因此能够避免胚乳中的萌发抑制物对种子萌发的抑制作用，使胚能够在当年萌发成苗。即解决了南方红豆杉种子采收后需经两冬一夏才能自然萌发的限制，为红豆杉种苗的快速繁殖提供了快捷的方法。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。本发明的实施例中的南方红豆杉种子采自安徽旌德庙首林场 实施例I
一种南方红豆杉胚离体成苗技术，具体包括如下步骤
(1)、南方红豆杉种子的消毒
将当年采收的种子去假种皮，用蒸馏水浸泡24h，依次用70%的酒精消毒2min、5%次氯酸钠消毒30min，无菌水冲洗干净备用；
(2)、南方红豆杉种胚剥离
将灭菌后的种子放置无菌滤纸上，去掉坚硬的外种皮，在显微镜下去除胚乳，并将胚在无菌水中冲洗干净；
(3)、南方红豆杉胚的培养
将步骤(2)所得的胚接种于试管培养基上，首先在20-22°C条件下暗培养，萌发后移至光照强度约1500 lx，光照12h/d的光下进行培养至根长出，即得南方红豆杉试管苗；
所用的试管培养基配方，按每升计算，由0. 5mgGA、0. 5mg IAA、0. 5mg6_BA、400mgNH4NO3,556mg Ca (NO3) 2. 4H20、990 mg K2SO4,96 mg CaCl2. 2H20、170 mg KH2PO4、0. 25 mgNa2MoO4. 2H20、370 mg MgSO4. 7H20、22. 4mg MnSO4. H20、8. 6mg ZnSO4. 7H20、0. 25mg CuSO4. 5H20、27. 8 mg FeSO4. 7H20、37. 3 mg Na2-EDTAUOO mg肌醇、I. Omg维生素B1、0. 5 mg烟酸、0. 5 mg维生素B6、2.0 mg甘氨酸、20 g蔗糖、6g琼脂、Ig活性炭和余量的水组成，用IM NaOH或IMHCI 调至 pH5. 6 ；
(4)、瓶内炼苗
将步骤(3)所得的南方红豆杉试管苗置于温度25°C、光强15001x、光照12h/d、RH 80%左右的环境中，打开瓶盖，使之适应环境7d，即可完成；
(5)、瓶外基质炼苗
将步骤(4)完成瓶内炼苗的试管苗取出，栽植于基质中，基质炼苗室内白天温度为20-25°C，晚间为 15-18°C、午间光强 25-40klx、RH 70 % - 85 %，经 25d 即可完成；
所述基质配方按质量比计算，即草碳蛭石山泥为2:2:6 ；(6)、大田移植
将完成瓶外基质炼苗的植株种植到大田中，最终成活率为95%。综上所述，本发明的一种南方红豆杉胚离体成苗技术通过将南方红豆杉胚从种子中取出后进行体外培养，打破了胚乳对胚的萌发限制，胚可在种子采收当年萌发，并生长成为健康的幼苗，经炼苗、大田移植后，成活率达95%。本发明操作简单，成本低，可作为红豆杉种苗的快速繁殖的方法。
上述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。
权利要求
1.一种南方红豆杉胚离体成苗技术，其特征在于具体包括如下步骤 (1 )、南方红豆杉种子胚的剥离 将南方红豆杉种子去掉假种皮，先用蒸馏水浸泡，然后依次用酒精、次氯酸钠消毒，去掉坚硬的外种皮，取出胚，并将胚在无菌水中冲洗干净； (2)、南方红豆杉胚的培养 将步骤(1)所得的胚接种于试管培养基上，先在20 _22°C条件下暗培养，萌发后移至光照强度约1500 lx，光照12h/d的条件下培养至根长出，即得到南方红豆杉试管苗； 所用试管培养基配方，按每升计算，由400mg NH4N03>556mg Ca(NO3)2. 4H20、990 mgK2SO4>96 mg CaCl2. 2H20、170 mg KH2PO4^ 0. 25 mg Na2MoO4. 2H20、370 mg MgSO4. 7H20、22. 4mgMnSO4. H20、8. 6mg ZnSO4. 7H20、0. 25mg CuSO4. 5H20、27. 8 mg FeSO4. 7H20、37. 3 mg Na2-EDTA>100 mg 肌醇、I. Omg 维生素 B1、0. 5 mg 烟酸、0.5 mg 维生素 B6、2.0 mg 甘氨酸、0.5mg GA、0.5mg IAA、0. 5mg 6_BA、20 g鹿糖、6g琼脂及Ig活性炭和余量的水组成; (3)、瓶内炼苗 将步骤(2)所得的南方红豆杉试管苗置于温度25°C、光强15001x、光照12h/d、RH 80%左右的环境中，打开试管瓶盖，使之适应环境7d，即可完成瓶内炼苗； (4)、瓶外基质炼苗 将步骤(3)完成瓶内炼苗的试管的苗取出，栽植于基质炼苗室的基质中经25d即可完成瓶外基质炼苗； 所述的基质配方按质量比计算，即草碳蛭石山泥为2:2:6 ； 所述的基质炼苗室白天温度为20-25°C，晚间为15-18°C、午间光强25-40klx、相对湿度为 70% -85% ； (5)、移栽大田 将步骤(4)完成瓶外基质炼苗的植株种植到大田中即可。
2.如权利要求I所述的一种南方红豆杉胚离体成苗技术，其特征在于步骤(I)中所述的红豆杉种子去假种皮后，先用蒸馏水浸泡24h，然后依次用70%的酒精消毒2min、5%次氯酸钠消毒30min。
3.如权利要求I或2所述的一种南方红豆杉胚离体成苗技术所用的红豆杉胚试管培养基，其特征在于所用的红豆杉胚试管培养基，按每升计算，由400mg NH4NO3^556mgCa (NO3) 2. 4H20、990 mg K2SO4>96 mg CaCl2. 2H20> 170 mg KH2PO4>0. 25 mg Na2MoO4. 2H20、370 mg MgSO4. 7H20、22. 4mg MnSO4. H20、8. 6mg ZnSO4. 7H20、0. 25mg CuSO4. 5H20、27. 8 mgFeSO4. 7H20、37. 3 mg Na2-EDTAUOO mg 肌醇、I. Omg 维生素 B1、0. 5 mg 烟酸、0.5 mg 维生素B6、2.0 mg 甘氨酸、0. 5mg GA、0. 5mg IAA、0. 5mg 6_BA、20 g 鹿糖、6g 琼脂及 Ig 活性炭和余量的水组成。
4.如权利要求3所述的红豆杉胚试管培养基，其特征在于红豆杉胚试管培养基的pH为.5.60
全文摘要
本发明公开一种南方红豆杉胚离体成苗技术。即将南方红豆杉种子去掉假种皮，依次用酒精、次氯酸钠消毒，去掉坚硬的外种皮，取出胚并在无菌水中冲洗干净后接种于特定的试管培养基上，先暗培养，萌发后移至光下培养至成苗后，将试管苗置于温度25℃、光强1500lx、光照12h/d、RH80%左右的环境中7d，完成瓶内炼苗，随后将试管苗栽植于特定基质中，控制昼夜温度20-25℃/15-18℃、午间光强25-40klx、RH70%-85%，经25d完成瓶外基质炼苗，最后再移栽大田即可。本发明的南方红豆杉胚离体成苗技术，使南方红豆杉胚在当年萌发成苗，为红豆杉种苗的快速繁殖和资源保护提供了快捷的方法。
文档编号A01H4/00GK102657091SQ20121015658
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月21日 优先权日2012年5月21日
发明者侯梅芳, 姜育龙, 宋丽莉, 张妤萍, 赵华强 申请人:上海应用技术学院