专利名称：禽胚层细胞系的制作方法
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关于联邦政府赞助的研究或开发的声明本发明的完成使用了联邦政府的资金USDA 96-CRHR-0-6055。因此联邦政府享有本发明的某些权利。
背景技术：
本发明涉及能无限增殖的禽胚层细胞系和制造该细胞系的方法以及用于该方法的材料。这些细胞系对产生转基因禽类和保持种系基因组而言是理想的。
转基因技术是一种改善植物的商业价值的强效工具(如增加它们对疾病和除草剂的抗性)。然而，改善动物遗传性状的尝试落后于植物的，大部分早期研究者重于采用动物作为生产合成性人用药物的生物反应器。至今用转基因方法对家畜遗传质量的改善取得的进展极小。
这种努力的具体进展在于通常高密度饲育的家畜(如鸡、鸭、鹅、火鸡等)产业，而高密度饲养导致受疾病(如马立克病和鸡白血病)感染的危险性增加。因此商业饲养者设法选择(用天然饲养方法)疾病抵抗能力增加的家畜。
曾经作过某些设想将外源基因引入到家畜饲养的品种中，来增加对疾病的抵抗力。例如，采用对鸡白血病病毒某一亚型的抗性增加的突变型ALV病毒感染一胚系。参见M.Federspiel等人，65 J.Virol.313-19(1991)。本文将该出版物和所引用的其它所有出版物全部纳入作为参考。
还尝试过引入选定的外源基因，通过将它们克隆入逆转录病毒载体(如网状内皮病毒或鸡白血病病毒)，将此重组病毒注射入受精卵中，让病毒感染发育的胚胎(如原生殖细胞)，从而产生一种嵌合的性腺或卵细胞，并用如此得到的重组体设法将外源基因引入后代。然而，家畜业不愿将这种技术用作商业方法，因为病毒(天然状态时)是病原，即使变异复制的感受态病毒载体有时也会诱发肿瘤，而且复制非感受态变体需要很高的剂量或多次量。而且，甚至复制缺陷型病毒构建物可能具有与内源病毒包膜重组而变成重组感受态的某些危险。另外，最近这些病毒限于尺寸相对小的DNA插入物(如2千个或以下的碱基对)。
还企图将外源DNA注射入未发育的受精卵细胞，然后通过手术从母鸡中取出。参见M.Perry，331 Nature(1998)。然而，这种方法需要将发育的胚胎在一系列的替代容器中培养。另外，还需要特定的产蛋禽群和广泛实践来得到所需的手术和专业技术。
技术上需要较低的现有方法包括将外源DNA引入已产下的卵的胚胎中。通常参见J.Petitte等人，76 Poult.Sci.，1084-92(1997)；R.Etches等人，62MethodsMol.Biol.，433-50(1997)；M.Naito等人，113 J.Reprod.Fertil，137-43(1998)；M.Nakamura等人，67 Okajimas Folia Anat Jpn.，473-7(1991)；J.Petitte等人，108Development，185-9(1990)；和美国专利5,340,740和5,656,479，J.Petitte等人。
还包括在产蛋后48小时或立即(当原生殖细胞开始迁移到性腺肛原(analagen)时)将基因修饰的胚胎细胞或原生殖细胞注射入胚层。在该方法中，当掺入发育的胚胎时，产生的胚层细胞培养物保留了它们分化成能产生细胞的功能性卵细胞或精子的能力。
可将这种类型的胚层细胞培养物进行基因修饰然后注射入接收胚胎。接收胚胎通常已用γ射线预先进行修饰而削弱了内源性原生殖细胞，并给予注射的细胞在进入性腺肛原时有利的选择。然后被修饰的细胞成熟，产生能将转基因传递给至少下一代(和较佳地以后几代)的精子或卵细胞。
该方法成功的关键在于抑制分化时使培养物中的胚胎胚层细胞扩增的能力。因此一些试验小组开发了基于添加各种克隆化因子和饲养细胞的培养方法，在维持胚层细胞的原生殖细胞表型的同时进行胚层细胞的短期(几天到2周左右)扩增。这些培养的细胞成功地产生了嵌合种系细胞，但大部分用该系统来表达转染的DNA作为转基因的尝试都是不成功的。
另一方法依赖使用含有毒素的培养基。
因此，可以看出禽胚层细胞培养需要一种改进的培养条件。
发明概述本发明的一方面提供了一种表达EMA-1表位的未分化禽(较佳地家禽如火鸡、鸭、鹅和鸡)胚层细胞的培养物，其中该培养物当存在禽脐分离物时(如胚胎禽脐的分离物)能维持其未分化的特性和其在扩增期间(较佳地为6个月以上)表达EMA-1表位的能力。
本发明另一方面提供了一种产生能表达EMA-1表位的未分化胚层细胞的持续培养物。在形成原条前，从禽胚盘收集禽细胞。然后在存在禽脐分离物(如火鸡脐提取物)时培养这些禽细胞。
本发明的另一形式是提供了用于培养禽(如家禽)胚层细胞的培养基，含有禽脐分离物。较佳地，该培养基宜还含有标准胚层培养物中存在的其它成分。
本发明的另一形式是提供了一种保存禽种系基因组的方法。这可以通过冷冻上述培养物之一完成。
本发明的另一形式是提供了由这种培养物衍生的重组禽类。
通过用含有禽脐分离物的培养基培养胚层细胞，可以获得含有未分化原生殖细胞的持续培养物。这就提供了能用于产生重组细胞的有效培养物。
得到的重组胚细胞可用于产生重组禽类和保存种系基因组。另外，似乎这种重组禽类有可能将这些外来性状遗传给它们的后代。
因此本发明的目的包括提供(a)能在较长时间保持不分化而无需饲养层或毒素的持续的禽原生殖细胞培养物；(b)由这种细胞培养物衍生的重组禽类；(c)产生这种培养物的方法(d)通过冷冻这种培养物来保存基因组的方法；和(e)用于进行这些方法的培养基。
本发明的这些及其它目的和优点通过以下优选实施例的叙述将会显而易见。但应将权利要求书作为判断本发明整个范围的依据。
发明详述概述我们提供了一种稳定的禽胚层细胞(“BDC”)培养系统，其无需饲养层或毒素，能维持活的BDC 6个月以上。该培养的BDC能表达EMA-1表位(原生殖细胞的一种标记)。参见，A.Hahnel等人，15 Gamete Research 25-34(1986)和L.Urven等人，103Develop.299-304(1988)。用这种方法产生的培养细胞能提供造血细胞和各种其它细胞类型(当它们被转染，然后被插入到接收的鸡胚胎时)。
材料供体胚层细胞和受体受精卵来源于Avian Disease and Oncology Laboratory(ADOL)。我们使用它们的细胞系0(MHC＝B21B21)、C(MHC＝B12B12)、71(MHC＝B2B2)、15I5x71(MHC＝B2B15)、N(MHC＝B21B21)、P(MHC＝B19B19)，部分是因为这些细胞系是已知的维持无常见病原病毒的细胞系。
我们的培养基如下。用无血清和无蛋白质的杂交瘤培养基(SFPF，#S2897)来培养细胞系0 BDC。
用L-15 Leibovitz培养基/McCoy 5A改良培养基(L/M为1∶1，#L4386，#M4892)来培养细胞系0、细胞系7和15I5x71。
Dulbecco改良的eagle培养基/ham营养混合物(DMEM/F-12，#D0547)用于细胞系C。
极限必需培养基eagle(MEM，#M0644)用于细胞系P。
总的来说，这些培养基通常含有水、无机盐、维生素、氨基酸、缓冲液、葡萄糖、核苷酸前体/核苷酸、脂类、TCA循环中间体和各种微量添加剂。
在所有培养基中使用终浓度为1,000U/ml的青霉素和链霉素(Pen/Strep)来抑制细菌细胞的生长。
还添加毛喉素(#6886或#F3917)来促进细胞系C中BDC的生长(20μg/100ml终浓度)。
所有上述培养基试剂都从Sigma Chemical Co.，St Louis，MO购得，在所有培养基中加入终浓度为20％的胎牛(小牛)血清(FBS，Gibco BRL Life Technonogies，Grand Island，NY)。
从管状(piping)胚胎得到火鸡脐。从环绕脐带附着处的腹部区域切下各脐(0.7-1cm直径)。除去残留的脐带。将脐合并置于冰冷的无血清培养基中(一个脐2ml培养基)，在冰浴中用组织粉碎器匀浆化，冷冻-解冻3次，并在4℃ 25，000×g离心30分钟。用于此目的的冰冻培养基为无血清无蛋白质的杂交瘤培养基(SFPF，#S2897)。关键特征是作为相关分离物的含水提取液是水溶性的。
保留上清液，用0.22μm膜除菌过滤(除去大于该尺寸的颗粒)，分成每个小瓶1ml等份，-20℃储存。将此无菌过滤的火鸡脐提取物(“TNE”)新鲜加到细胞培养物中，为400μl TNE/10ml培养基(相当于每100ml培养基2个脐)。
当要孵化禽胚胎时，卵黄囊开始通过腹部区域(通常称为脐区)中的一个小开口缩回入胚胎的体腔内。在卵黄囊缩回后几分钟内该开口将愈合。参见A.Romanoff等人，“禽胚胎结构和功能的发育”，1051-1079，The MacmillanCompany，New York(1960)。
我们相信禽脐组织的细胞分泌加速脐闭合的生长/愈合因子。如果脐不完全愈合，孵化出的小鸡在孵化后的早期易受感染。我们发现这些因子可用于我们的培养基。
对任选的添加剂而言，我们采用小鸡胚胎提取物。将7日龄的小鸡胚胎置于无血清无蛋白质的杂交瘤培养基(SFPF，#S2897)，在冰浴中匀浆化，冰冻-冻融3次，4℃25,000×g离心30分钟。用0.22μm膜除菌过滤。将无菌小鸡胚胎提取物以每个小瓶约一个胚胎的当量等份分装(取决于所得提取物的量)，-20℃储存。以相当于每100ml培养基一个胚胎的量任选地加入此提取物。据信这种添加剂能提高细胞的增殖。
EMA-1单克隆抗体是A.Hahnel等人，15Gamete Research 25-34(1986)描述的。它能与原生殖细胞反应。EMA-1表位被视为禽原生殖细胞的一种标记。由U.of Iowa Developmental Studies Hybridoma Bank.(Iowa City，IA)得到EMA-1抗体。
我们将含有2.5％FBS和1％Pen/Strep、Hepe缓冲盐水2x(HBS2x)溶液(140mM NaCl、1.5mM Na2H2PO4、50mM Hepe(#H9136，Sigma)，pH7.05)和2MCaCl2的去离子水溶液(dH2O)的培养基199(M199，#M7667)用作转染液。
作为载体的例子，我们使用含有标记蛋白质“绿荧光蛋白”(pEGFP，CLONETECH Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)的质粒。我们还使用含有其它感兴趣外源基因的载体。参见J.Fulton等人，25Eur，J.Immunol.2069-2076(1995)所述的ppZeoBFIVprom/FLAG/B21。
为了促进不同培养阶段细胞的分离，以无血清的L/M培养基将胶原酶(#17103，GibcoBRL Life Technologies)稀释至0.2mg/ml。用细胞刮擦橡皮(#14-105B，Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)从培养插件中取出细胞。
为了得到胚胎重组体，我们需要接近刚产下的(18小时)鸡蛋壳内的卵。由于这要打开蛋壳，我们需要得到蛋壳膜的修补片。为此目的，将蛋敲开，弃去内含物。从蛋壳剥下壳膜，并置于含有1％Pen/Strep磷酸盐缓冲盐水的150×20mm无菌培养板上。将壳膜切成约2cm2大小的片。
方法A.产生原生殖细胞系我们制备了本发明的胚层细胞培养物。用显微解剖剪(#11-1020，BiomedicalResearch Instruments，Inc.，Rockville，MD)从IX-XIV期(H.Eyal-Giladi等人，49Develop.Bio.321-337(1976))未孵化的受精卵中切下胚盘的中央部分，用显微解剖镊子(#10-1605，BRI)取出，并置于5ml培养基中。将约30个胚盘合并，用装在3ml针筒上的22G号针头轻轻地抽吸几次来分散细胞。
然后将这些细胞分布在细胞培养插件上(F.Villars等人，12 CellBiol.Toxicol.(1996))。为此目的，我们使用Transwell多孔细胞培养插件，75mm直径，0.4μm孔径，聚碳酸酯膜，#3419，Coming Incorporated，Corning，NY。
将15ml含有新鲜火鸡脐提取物(任选含有小鸡胚胎提取物)的培养基加到37℃培养的培养物中。BDC在2天内附着到插件膜上，且在一周内铺满。
另一合适培养基的例子含有82％杂交瘤培养基、15％胎牛血清、1％Pen/Strep、2个火鸡脐的提取物和1个小鸡胚胎的提取物。
铺满后，每5到7天用细胞刮棒从培养插件上刮下BDC，用新鲜培养基以1∶2到1∶3的比例稀释。各代BOC对胰蛋白酶或胶原酶处理都敏感，因此至少在原代和早期代次培养物时应避免用酶分离。
然后我们测试了培养不同时间这些细胞的EMA-1表位的表达。这些测试可以用各种标准方法完成。例如，可以从培养物中除去培养基(留下接种的培养物)。用PBS洗涤培养物3次。然后可将EMA-1抗体溶液加到培养板中。在室温培养该系统15分钟(或4℃培养半小时)。
然后从板中除去EMA-1溶液，用PBS洗涤3次。再加入FITC偶联的羊抗小鼠IgM抗体，室温培育15分钟。用PBS洗涤3次后，在配有UV滤色镜的显微镜下观察培养板。结合的抗体是可见的并表示EMA-1表达。
B.冷冻在早期培养阶段，得到的胚层细胞系不能成功地冷冻，因为细胞中有高含量的脂质颗粒。然而，在培养2个月后，我们能够成功地冷冻、储存然后再培养。
就冷冻而言用胶原酶分离从培养插件上取出胚层细胞，并重悬于冷冻小管中的冰冻培养基中。-70℃在泡沫聚苯乙烯盒中冻结这些小管过夜，然后短期保藏于-70℃。对长期保存而言，我们认为细胞应保存在液氮中。
我们用杂交瘤培养基50％(无小鸡胚胎提取物或火鸡脐提取物)和10％二甲基亚砜(DMSO，#D2650，Sigma Chemical)和40％胎牛血清作为细胞冻存培养基。经冰冻和解冻实验，我们确定BDC培养2个月后能成功地冻存。
C.转染然后我们用载体使我们的培养细胞重组。我们用改良的磷酸钙沉淀方法开始转染。用于转染的胚层细胞已培养了2-6个月。将在20μl dH2O、120μl 2MCaCl2、860μl dH2O和1ml HBS 2x中的20μg测试质粒/载体加到Falcon12×75mm无菌聚乙烯圆底试管中(#2058，Becton Dickinson Labware，Lincoln Park，NJ)。
用1ml移液管将空气通入试管中1分钟。室温培育该试管30分钟。然后将质粒溶液(2ml)加到培养板中，板中用含有2.5％FBS的M199置换培养基，并在37℃持续培养8小时。然后，弃去M199培养基，用M199培养基洗涤该板，再将初始培养基加到培养板中。此方法的一个重要方面是使胚层细胞培养物反复转染(无化学选择)。这大大提高了这些脆弱细胞的存活，同时将转染的效率提高至30％。
D.注射外源宿主的胚胎用70％乙醇消毒新生受精卵的蛋壳，用照蛋器确定此气胞并标记。孵化18小时后，从孵卵器(Jamsway，强制通风型)取出鸡蛋置于室温中。用皮带砂光机(3型，#7451，3”×24”皮带，amps 5.2，皮带FT./分钟1200，Black & Decker In.，Towson，MD 21210)在气胞区域的蛋壳上磨出1cm直径的孔。用平头镊子取出壳膜。
用约40μm孔径的微细管针式移液管，将20μl含有10,000DiI饱和的或被转染的BDC的培养基注射到鸡胚胎的月牙区域。将DiI[DII1，1’-双十八烷基-3，3，3’，3’-四-甲基吲哚-羰花青-高氯酸酯；diI-C18-(3)](MolecularProbes，Eugene，OR)溶解于100％DMSO中。制备2.5mg/ml原液，在培养液中稀释至终浓度为2.5μg/ml，来染色培养板中的胚层细胞8小时(在37℃培养过程中)。除去含有DiI的培养液后，用PBS洗涤培养板5次。
需注意这种方法是用来检测组织中被DiI染色的细胞。例如，可以从胚胎中取出7日龄的胚胎性腺，固定在4℃的4％多聚甲醛中8小时，然后在4℃ 5％蔗糖PBS中过夜，然后在30％蔗糖PBS中8小时(4℃)，再在-70℃冰冻。在5μm冷冻切片上进行荧光镜检。可用罗丹明滤光器或窄带滤光器观察DiI(R.Penza等人，13Biotechniques 580-587(1992))。
注射后，将蛋壳膜补丁(如上所述)置于气胞的上端。待蛋壳膜干燥后，将OpSite带(高MVP透明敷料，#4008，Smith+Nephew，由地方药店购得)来包扎蛋壳膜的顶部，然后将鸡蛋放还到Jamesway孵卵器中继续孵化。第19天将胚胎转移到孵化篮中，将孵化出的小鸡套上标记环、编号(dubbed)并注射SB-1/HVTMarek病疫苗(按照制造商说明)。
结果流式细胞术(FC)分析显示在培养2周后约35-45％胚层细胞表达EMA-1表位。EMA-1阳性细胞的大小范围为15-30μm。
培养2个月后约30％胚层细胞保持EMA-1阳性。细胞能形成胚胎干细胞样集落，仍表现EMA-1表位。这些集落紧密且形态一致。它们看起来是稳定的(在以下所述的培养条件下)原生殖细胞。
在培养液中不添加禽脐提取物，胚层细胞能复制1次但存活时间不超过2个星期。在培养液中补充火鸡脐提取物，细胞能复制2到3次(取决于鸡蛋来源的品种)。然后生长速率降低，细胞将维持休眠状态约4星期。如果每天在培养物中加入火鸡脐提取物则可以将休眠期缩短至2星期。
4星期休眠后，细胞重新复制，将它们传代培养。在休眠复苏后，用胶原酶溶液来促进分离。培养2到6个月后，用供体细胞作细胞注射/移植。
当将大量培养的BDC从培养插件转移到常规组织培养板上(低细胞密度103个细胞/em2)时，BDC开始分化成成纤维样细胞、类黑色素细胞、类神经细胞和类肌肉细胞分化的细胞(可以通过形态鉴定)(没有显示资料)。这是多能性的表现。在本文所述培养液条件下的细胞培养插件使得BDC能从上部和下部多孔膜吸收营养，这看起来防止了自发分化过程。
当BDC从休眠回复并重新生长后，将它们传代3次以上，与DiI-C18红色染料一起培养，注射入18小时的胚胎中。在一实施例中，在注射后6天，取出胚胎组织并冷冻切片成5μm厚度。用荧光显微镜，在性腺和其它组织中检测到有红色染料的细胞。这表明培养的BDC能成熟或分化成性腺和各种其它胚胎组织。
在另一试验中，通过磷酸钙沉淀方法(无药物筛选)，用3种质粒/载体(pGFP、pHCl或BFIV-I类)转染培养的BDC(2个月或更长)3次(每次10天)。最后一次转染后3天，从培养插件中取出转染的BDC，用胶原酶溶液处理得到单细胞悬浮液。将BDC悬液重悬于含有1％小鸡血清的PBS中，注射入18小时胚胎的胚月牙区域。
注射流程后孵化率为9.2％(供体细胞为0系MHC＝B21B21，受体蛋为15I5x71MHC＝B2B15)。从四周龄的子代小鸡得到血液，并用流式细胞术分析。在受体B12B15血液中检测到供体嵌合性B21B21细胞。在一些小鸡中，供体细胞的百分比高达25％到33％。
另外，49只推定的嵌合小鸡血液中有7只具有供体细胞类型的MHC抗原。在小鸡的外周血液中未检测到转染接收者I类抗原的表达。5只转染小鸡中有一只血液细胞表达pHcl，约4％。一只转染小鸡中表达12％绿荧光蛋白。所以，外来性状可由重组细胞培养物传递给活的后代禽类。
可以理解本发明适用于任何类型的禽类，但看来最有商业价值的商品禽类为鸡、火鸡、野鸡、鸭和鹅。
较佳地提取物是从胚胎禽类(尤其是胚胎火鸡)脐提取出的水解成分。但也可使用从其它禽类提取的类似提取物。提取物中物质的类型很可能负责所赋予的特性，本文为蛋白质(如很可能是生长因子如细胞因子)。
据信此细胞培养物含有原生殖细胞。但它们的最佳特征为EMA-1抗体的表达。
虽然已描述了上述优选实施例，但本领域技术人员将理解在本发明范围内可有其它改进。所以应参照权利要求书来判断本发明的范围。
工业应用本发明提供了能长期培养的禽类原生殖细胞系，和维持和冻存这些细胞系的方法，这些方法所使用的材料和用这些方法产生的禽类。
权利要求
1.一种表达EMA-1表位的未分化禽胚层细胞培养物，其特征在于，当存在禽脐分离物培养时，所述的培养物能维持其未分化的特性和其表达EMA-1表位的能力2个月以上。
2.如权利要求1所述的培养物，其特征在于，所述的禽脐是胚胎禽脐。
3.如权利要求1所述的培养物，其特征在于，所述的禽胚层细胞选自火鸡细胞、鸭细胞、野鸡细胞、鹅细胞和鸡细胞。
4.如权利要求2所述的培养物，其特征在于，当存在胚胎禽脐分离物培养时，所述的培养物能维持其未分化的特性和其表达EMA-1表位的能力6个月以上。
5.如权利要求2所述的培养物，其特征在于，当存在火鸡脐分离物培养时，所述的培养物能维持其未分化的特性和其表达EMA-1表位的能力2个月以上。
6.一种产生能表达EMA-1表位的未分化胚层细胞的持续培养物的方法，其特征在于，所述的方法包括在形成原条前，从禽胚盘收集禽细胞；和在存在禽脐分离物时培养这些禽细胞。
7.产生如权利要求6所述的持续培养物的方法，其特征在于，所述的禽脐是胚胎禽脐。
8.产生如权利要求6所述的持续培养物的方法，其特征在于，所述的分离物是火鸡脐提取物。
9.一种用于培养禽胚层细胞的培养基，其特征在于，所述的培养基包含禽脐分离物、无机盐、维生素、氨基酸和水。
10.如权利要求9所述的培养基，其特征在于，所述的禽脐是火鸡脐。
11.一种保存禽种系基因组的方法，其特征在于，所述的方法包括冻存权利要求1所述的培养物。
12.一种从表达EMA-1表位的未分化禽胚层细胞培养物衍生的重组禽类，其特征在于，所述的培养物含有禽脐分离物。
13.如权利要求12所述的重组禽类，其特征在于，所述的培养物能维持其未分化的特性和表达EMA-1表位的能力2个月以上。
14.如权利要求12所述的重组禽类，其特征在于，所述的禽脐是胚胎禽脐，重组禽类是从权利要求12所述的培养物衍生的。
15.如权利要求12所述的重组禽类，其特征在于，所述的禽胚层细胞选自火鸡细胞、鸭细胞、野鸡细胞、鹅细胞和鸡细胞。
16.如权利要求12所述的重组禽类，其特征在于，所述的禽脐是火鸡脐。
全文摘要
本发明公开了未分化禽原生殖细胞/胚层细胞的培养物。当存在禽脐(如火鸡脐提取物)分离物下培养时,这种培养物能长时间维持它们的未分化特性和它们表达EMA－1表位的能力。还公开了用禽脐提取物培养这种培养物的方法以及含有禽脐提取物的培养基。还公开了从这些培养物衍生的重组禽类。这些培养物可以长期冰冻来保存种系基因组。
文档编号A01K67/027GK1369006SQ00811492
公开日2002年9月11日 申请日期2000年6月15日 优先权日1999年8月11日
发明者H·察, H·D·亨特, L·D·培根, B·C·温特沃斯, A·L·温特沃斯 申请人:威斯康星校友研究基金会, 美国农业部