专利名称：：鼠伤寒沙门菌X3306lux及其在活体成像中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于微生物
技术领域：
，特别涉及鼠伤寒沙门菌X33061UX及其在活体成像中的应用。
背景技术：
：鼠伤寒沙门菌{Salmonella是一种重要的人畜共患病原菌，主要经水和食物传播，可引起食物中毒、胃肠炎等肠道传染病，其感染发病率居沙门菌感染的首位。X3306是携带毒力质粒pStSRIOO的鼠伤寒沙门菌强毒株，可作为标准毒株，应用于鼠伤寒沙门菌致病机制的研究。近年来，活体动物体内光学成像技术以其操作简便及直观性在生命科学研究中得以不断发展。这种成像技术可以直接实时观察标记的基因及细胞在活体动物体内的活动及反应。利用光学标记的细菌建立动物模型可以实时动态追踪病原菌在动物活体内的感染过程，深入研究病原菌致病机制，进行药物研究及筛选等。主要采用荧光(fluorescence)与生物发光(bioluminescence)两种技术。荧光发光是通过激发光激发荧光基团到达高能量状态后产生发射光。荧光技术操作简便，信号较强，但应用于体内试验时在受到激发光激发时生物体很多物质都会产生荧光，如皮肤、毛发和各种组织及食物等。特别是当被标记的靶点深藏于组织内部需要较高能量的激发光时也产生很强的非特异性荧光，且病原菌在动物体内有复杂的定位，荧光的激发光需要穿过组织到达靶点，发射光需要从体内出来，路径较长。信号水平取决于激发光的强度、发光细胞的数量、靶点的深度、光线穿过的组织对其的吸收及散射等因素，使得荧光强度很难定量。生物发光是用荧光素酶(Iuciferase)基因标记。以荧光素酶作为体内报告源的生物发光是以酶和底物的特异作用而发光，特异性极强，因动物本身没有任何自发光，使得生物发光具有极低的背景，极高的信噪比。生物发光成像相对于荧光成像，其最大的特点就是体内检测的高灵敏度。因此，生物发光技术成为目前研究的热点。细菌操纵子由荧光素酶基因和其底物合成酶基因组成，带有这种操纵子的细菌会持续发光不需要外源性底物。近年来研究者们陆续将其克隆至多种载体导入病原菌中，应用生物发光技术和小动物成像系统监测病原菌感染过程。但以质粒为基础的生物发光技术在无抗生素选择下不稳定，不能用于体内的长期研究。对实验小鼠注射抗生素来筛选携带完整发光质粒的沙门菌，会造成小鼠的耐药性，且会在某种程度上干扰实验结果。又因质粒的拷贝数不同，单细胞发光强度不稳定，无法以发光强度来定量检测病原菌。2010年，KevinHowe构建质粒pBEN276,利用该质粒可将Zm操纵子克隆至细菌染色体(图I),其生物发光信号可以用于精确定量，本发明由此在鼠伤寒沙门菌X3306基础上构建了具有稳定生物发光性能的菌株X33061ux。
发明内容解决的技术问题本发明针对荧光标记的体内检测特异性低，背景高，难定量等缺陷，及以往以基于质粒的生物发光检测需外加筛选压力和底物，且难以定量等不足，提供了一种可以稳定发光的鼠伤寒沙门菌X33061ux及其在活体成像中的应用。技术方案鼠伤寒沙门菌{Salmonellatyphimurium)X3306lux,该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2012年3月13日，保藏单位名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.5895。鼠伤寒沙门菌typhimurium)X3306Iux在活体成像中的应用。鼠伤寒沙门菌(5^7^9/7(9773皿η·")X3306下文简称X3306;鼠伤寒沙门菌{Salmonellatyphimurium)X33O6Iux下文简称X33O6Iux0有益效果该鼠伤寒沙门菌具有稳定的生物发光性能，弥补了生物荧光的细菌检测需激发光源且在体内特异性低，背景高，难定量等缺陷。经位点特异性重组，将管家基因E.coli/rr启动子和操纵子插入宿主菌染色体中稳定表达(同时插入位点不破坏基因组基因功能，对细菌无不利影响)。操纵子在其上游连接的管家基因E.co7i/rr启动子的调控下，组成性表达荧光素酶和底物，无需外加筛选压力和底物维持细菌发光。并通过实验检测到细菌的数量与其发光强度成正比，且在小鼠活体内能持续检测到细菌的生物发光。弥补了以往质粒标记的生物发光细菌需外加筛选压力和底物，影响发光检测，且单位细胞发光量不稳定等不足之处。荧光酶基因插入染色体中稳定表达，单位细胞的发光数量很稳定。加上生物发光技术极高的特异性和信噪比，即便标记细胞在动物体内有复杂的定位，亦可从动物体表的信号水平直接得出发光细胞的相对数量。可广泛应用于体外细胞感染模型和体内实验动物模型的建立。结合利用活体成像仪器可实时动态的持续监测鼠伤寒沙门菌在小鼠活体内的入侵、增殖及扩散情况。为鼠伤寒沙门菌及伤寒沙门菌致病机制的深入研究，药物研究和筛选及相关疾病防治策略的研究等提供便利的工具。图I为pBEN276质粒图谱，tnsABCD为编码Tn7转座子的基因。操纵子luxCDABE编码荧光素酶和底物，引入多克隆酶切位点Xhol和Notl，将其连接于Tn7转座子侧翼。Lux操纵子3’端连接Ε.coli管家基因frr的启动子，启动Zm操纵子的组成性表达。图2为菌落生物发光检测结果(I和2依次为X33061ux单菌落在whitelight和luminescence条件下成像，3和4依次为X3306单菌落在whitelight和luminescence条件下成像)。图3为菌液生物发光检测结果(1、2:whitelight模式成像X33061ux;3:whitelight模式成像X3306;4、5:luminescence模式成像X33061ux;6:luminescence模式成像X3306)。图4为X33061ux发光性能稳定性检测结果(光强与在无选择压力条件下传代天数的关系)图5为稳定发光菌在活体内信号检测结果(1，2，3依次为将感染X33061UX的小鼠于whitelight模式成像，luminescence模式成像和merge图像)。图6为光子数与细菌数关系的发光检测图(I飞倍比稀释X33061ux菌液；6X3306阴性对照)。图7为光子数与细菌数关系图(I5:10倍稀释X33061ux菌液；6:X3306阴性对照)。具体实施例方式实施例I菌株具体构建及鉴定I、材料准备I.I质粒与菌株质粒PBEN276由法国自然资源研究所动物传染病和公共健康病原菌研究实验室PierreGermon教授惠赠。KevinHowe,AttilaKarsi,PierreGermon,et.al.DevelopmentofstablereportersystemcloningluxCDABEgenesintochromosomeofSalmonellaentericaserotypesusingTn7transposon[J].BMCMicrobiology2010,10:197鼠伤寒沙门菌typhimurium')X3306由美国亚利桑那州立大学生物科学学院ROYCURTISSIII教授惠赠。HIDEN0RIMATSUI,CHRISTOPHERM.BACOT,WENDYA.VirulencePlasmid-BornespvBandspvCGenesCanReplacethe90-KilobasePlasmidinConferringVirulencetoSalmonellaentericaSerovarTyphimuriuminSubcutaneouslyInoculatedMice[J].Journalofbacteriology,2001，15(183):4652-4658.1.2仪器与试剂仪器电转仪(Bio-RadGenePulserIIsystem)为美国Bio-Rad产品；高速冷冻离心机Beckaman公司产品；柯达多模式小动物活体成像系统DXS4000pro；试剂质粒提取试剂盒QIAGENPlasmidMaxKit购自Qiagen公司。2方法2.1目的菌株的转化2.I.I感受态细胞制备平板划线法接种鼠伤寒沙门菌X3306至LB固体培养基，37°C倒置培养过夜。挑取个体圆润有光泽的单菌落接种到3mLLB液体培养基，37°C，200r/min培养过夜。将培养物以1:100的比例接种到IOOmL生长培养基中，37°C，250r/min培养至0D600为0.3时取出培养物，立即冰浴30min。4°C,4000r/min离心lOmin，收集菌体。用4°C预冷的超纯水洗三遍，以50μL预冷的超纯水重悬，冰上放置待用。2.I.2电转化方案将质粒PBEN276加入到50μL感受态细胞中，混合均匀后转入预冷的Imm电极杯。再调节电压、电阻及电容参数为2.5kV，400Ω，50μF，电击后迅速加入30°C预热的SOC培养基lmL。将电击后的菌液转移至试管，37°C，100r/min培养f3h。取100μL涂布于含40μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37°C培养过夜。2.2转化子鉴定阳性克隆从含50μg/mLAmp的LB琼脂平板上挑出接种至2mL含50μg/mLAmp液体LB培养基30°C，200rpm培养1416h，将菌液转移至24孔板检测生物发光。同时提取质粒进行酶切鉴定和PCR鉴定，并接种于SS固体培养基进行鼠伤寒沙门菌生化鉴定。2.3诱导转座子重组将上述经鉴定的转化子接种至含O.l%wt阿拉伯糖的LB液体培养基30°C，200rpm培养1416h。诱导后的菌液于无抗生素LB固体培养基平板上划线，42°C培养1416h。各挑选6个单克隆接种于液体LB培养基42°C，200rpm培养1416h，菌液转移至24孔板检测生物发光。2.4筛选稳定表达Lux操纵子的克隆挑选出重组后能发光的菌液于含50μg/mLAmp固体LB培养基上划线，同时在无抗生素培养基中继续传代37°C培养，定量检测细菌发光情况。筛选出无抗生素抗性且多次传代能稳定发光的菌落。菌株的培养增殖方法鼠伤寒沙门菌X3306Iux为兼性厌氧菌，在普通LB培养基中可生长，培养基成分蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，溶于IL水，pH=7±0.2，培养温度37°C条件下可稳定增殖。菌种形态与生化特性检测液体LB培养基37°C培养过夜细菌均匀浑浊。取一环菌液适当稀释后革兰染色镜检，该菌为革兰阴性杆菌。用固体LB培养基37°C培养18h，形成乳白色菌落，表面光滑，边缘整齐，直径f3mm。SS培养基37V培养1824h上菌落形态为中等大小、圆形、光滑、乳白色、菌落中心黑色，硫化氢阳性。挑取单菌落接种于生化管37°C培养过夜，检测生化特性，该菌不发酵乳糖和蔗糖，能发酵葡萄糖、甘露醇、麦芽糖。挑取单菌落接种于半固体琼脂，37°C培养18^24h，细菌呈羽毛状生长，动力阳性。单菌落生物发光检测分区划线法将鼠伤寒沙门菌X33061ux接种于LB平板，37°C，培养1416h。待长出单菌落后，将平板置于多模式活体成像仪中进行生物发光检测。在生物发光检测模式下，可见发光菌单菌落(鼠伤寒沙门菌X33061ux)，而普通细菌单菌落(鼠伤寒沙门菌X3306)不可见(图2)。菌液生物发光检测单菌落接种至液体LB培养基37°C，200rpm培养1416h，菌液转移至24孔板检测生物发光。生物发光模式下只可见发光菌(鼠伤寒沙门菌X33061ux)，普通细菌(鼠伤寒沙门菌X3306)不可见(图3)。生物发光稳定性检测将X33061uX单菌落接种至无抗生素液体LB培养基，每天传代培养至12天，每3天收集菌液，以OD6tltl为标准稀释至相同体积相同浓度，在活体成像仪中进行生物发光检测，记录发光强度。X33061ux具有稳定的生物发光性能(如图4)。实施例2鼠伤寒沙门菌iSalmorwllaX33061ux活体成像1.细菌培养从固体LB琼脂平板上挑选单克隆接种至LB液体培养基中，37°C，200rpm培养1416h至对数生长期。4000rpm，4°C，10min离心收集菌体，经生理盐水洗两遍(4000rpm，4°C，lOmin)后，用适量生理盐水重悬，测0D600计算细菌浓度。用生理盐水梯度稀释待用。2.小鼠感染方法(腹腔注射或口饲感染)2.I腹腔注射感染选取8-12周BALB/C或C57BL小鼠，以50μL浓度105CFU/mL的菌液腹腔注射感染小鼠。2.2.口饲感染8-12周BALB/C或C57BL小鼠禁食禁水6h后，以50μL10%wt的NaHCO3灌胃，中和胃酸，以体积O.2mL浓度107CFU/mL的菌液灌胃感染小鼠，半小时后恢复喂食。3.活体成像方法以10%wt水合氯醛O.ImL经腹腔注射麻醉小鼠，待麻醉生效(约30min)后利用小动物成像仪成像。首先在白光(whitelight)条件下成像，只可见小鼠。然后在生物发光(luminescence)条件下成像,只可见发光菌。将两次成像结果归并(merge),可见发光菌感染后播散到的部位(图5)。经光子量分析可计算发光菌在体内的增殖情况(图6，7)。权利要求1.鼠伤寒沙门菌{Salmonellatyphimurium)X33061ux，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2012年3月13日，保藏单位名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.5895。2.鼠伤寒沙门菌typhimurium)X33061ux在活体成像中的应用。全文摘要鼠伤寒沙门菌X3306lux及其在活体成像中的应用，该菌株已在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏日期为2012年3月13日，保藏单位名称中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCCNo.5895。鼠伤寒沙门菌X3306是携带毒力质粒pStSR100的强毒株，可作为标准毒株，应用于鼠伤寒沙门菌致病机制的研究。X3306lux是在X3306基础上构建的具有稳定生物发光性能的菌株。经位点特异性重组，将管家基因E.colifrr启动子和Lux操纵子插入X3306染色体中稳定表达(同时插入位点不破坏基因组基因功能，对细菌无不利影响)。Lux操纵子在其上游连接的管家基因E.colifrr启动子的调控下，组成性表达荧光素酶和底物，无需外加筛选压力和底物维持细菌发光。文档编号C12N1/20GK102757911SQ20121020624公开日2012年10月31日申请日期2012年6月21日优先权日2012年6月21日发明者储元元,叶颖,李嫄渊,黄瑞申请人:苏州大学