专利名称：：携带结核分支杆菌Ag85B的减毒伤寒杆菌载体疫苗的制作方法
技术领域：
：本发明属于分子微生物学，以及分子免疫和感染免疫领域。特别是利用分子生物学技术分子克隆设计和制备一种携带结核分支杆菌Ag85B的减毒伤寒杆菌载体疫苗。
背景技术：
：结核病(Tuberculosis，TB)是一种严重危害人类健康的传染病，由结核杆菌(Mycobacteroimtuberculosis，MTB)感染引起。据WHO估计，全球人口的1/3感染过结核分枝杆菌，每年新发病例数达800-1000万例，其中死亡约300万例，死于结核病的人数是其它传染病死亡人数的总和[1]。中国是除印度外的世界第二大结核病重灾区，我国目前结核病例每年递增已逾百万，年死亡人数达25万，约为其它传染病总死亡人数的2倍。目前由于对多种药物耐受的结核菌株正在不断增多，以及结核分枝杆菌与艾滋病毒的联合感染，使带菌者发展成为结核病的危险性增加等因素，世界卫生组织已经把结核病与艾滋病、疟疾一起列为人类的最主要杀手[2，3]。卡介苗(BCG)用于预防结核病已有60多年的历史，现行的BC6免疫保护效果不稳定(0-80％)[4]，它虽可较好地预防幼儿粟粒性结核和结核性脑膜炎，但却不能有效地预防成人肺结核，而且也不能应用于结核病的高危人群——艾滋病毒感染者[5]。寻找新型有效的预防、治疗性疫苗已成为当今抗结核疫苗研究领域急待解决的问题。鉴于当前TB流行的严重程度和BCG预防TB的缺陷，国内外学者已转向减毒活疫苗、MTB亚单位疫苗与基因工程重组活疫苗及DNA疫苗等的开发研究，以用于TB的防治[6，7]。在疫苗研究的发展中，减毒活疫苗的抗原成分多，免疫原性强，既能提供外源性抗原又能提供内源性抗原，从而诱导机体产生全面的免疫应答，具有良好的免疫保护作用，能诱发自身免疫性。伤寒杆菌是细胞内侵袭性致病菌，通过肠道或上呼吸道粘膜感染，侵入粘膜相关淋巴组织内，被抗原递呈细胞，主要是树突状细胞、巨噬细胞摄取，并在其中增殖，由于其感染的靶向性，减毒的伤寒杆菌可作为DNA疫苗的载体，含有病原体抗原基因的真核表达质粒的减毒伤寒杆菌将表达病原体的抗原蛋白，从而诱发机体对该蛋白的全面免疫应答(包括细胞免疫，体液免疫和粘膜免疫)，达到对感染性疾病的预防作用。机体抗御结核杆菌的感染主要依靠细胞免疫[8]。能诱发保护性细胞免疫应答结核杆菌蛋白大多存在于该菌对数生长早期的培养滤液中[9]。结核杆菌的DNA疫苗中迄今已有23种结核杆菌编码蛋白的基因被用作研究，其中一些可在动物体内诱发保护性免疫，包括特异性抗体的产生，Th1型和CD8+CTL介导的细胞免疫反应，并能抵抗毒株的攻击[10-12]。但至今还没有任何一种的结核病DNA疫苗的免疫保护效果超过BCG[13]。Ag85B又称MPB59，是结核杆菌主要分泌蛋白Ag85复合体(包括Ag85A，Ag85B和Ag85C组分)之一。目前，已知该复合体属于分枝菌酸转移酶，在结核杆菌细胞壁合成的晚期起关键作用。在结核杆菌众多的分泌蛋白中，Ag85B含量最大。Ag85B具有多个T细胞表位，能诱导机体产生保护性细胞免疫。它可诱导实验动物产生Th1型免疫应答，还可诱导PPD阳性健康人群外周血单个核细胞分泌高水平的IFN-γ[14，15]。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种新型的携带结核分支杆菌Ag85B的减毒伤寒杆菌载体疫苗，以便为当今抗结核疫苗研究领域急待寻找新型有效的预防、治疗性疫苗作出有力的贡献。本发明解决其技术问题采用以下的技术方案本发明提供的携带结核分支杆菌Ag85B的减毒伤寒杆菌载体疫苗，由包括以下步骤的方法制得(1)原核重组表达质粒pGEX-Ag85B的制备利用PCR方法对目的基因即Ag85B的BX842578基因序列中的121-975位进行扩增，再提取原核表达质粒pGEX-KG，并经酶切回收及鉴定，获得pGEX-Ag85B；(2)真核重组表达质粒pVAX1-Ag85B的构建将鉴定成功的原核重组质粒pGEX-KG-Ag85B转化感受态细菌E.coliBL21，经培养、阳性克隆和酶切鉴定后，使含有重组表达质粒的E.coliBL21在LB(Amp+)培养液中培养、接种和诱导培养，再经离心收集菌体及超声碎菌后，提取融合蛋白，然后经纯化和鉴定分析，即得到真核重组表达质粒pVAX1-Ag85B；(3)携带结核分支杆菌Ag85B的减毒伤寒杆菌载体疫苗的制备将鉴定正确的pVAX-1-Ag85B电转入减毒伤寒杆菌LB5000及SL7207菌株，并通过抗生素阳性克隆筛选及提取质粒酶切鉴定；再经动物攻毒实验检测疫苗的免疫保护效力，即得到所述疫苗。(按规定，上述三个步骤应该同权利要求1；加之后增加的内容已经在具体实施方式阐述，没有必要在此重复描述)本发明之所以选择能表达GST融合蛋白的原核载体pGEX-KG，是从纯化和应用方面考虑的GST蛋白既可作为鉴定的标签，又可方便蛋白纯化。另外，真核表达质粒选择为DNA疫苗的发展应用专门设计的pVAX-1，来源于pcDNA3.1。pVAX-1是已得到美国食品与药品管理局FDA认可的可用于临床的载体。美国食品与药品管理局1996年12月22日的文件指出pVAX-1作为预防传染性疾病的DNA疫苗载体质粒，其具有以下特点①可将染色体整合的可能性最小化；②卡那霉素(kan)抗性代替安苄霉素(Amp)抗性，能避免Amp带来的某些个体的过敏反应，在临床应用上更有优势；③重组蛋白的表达水平可与pcDNA3.1相比；④pVAX-1载体片段小，仅3kbp，多个单一克隆位点，能接纳更大的插入片段。本发明运用电转化技术将鉴定正确的真核重组表达Ag85B质粒电转入减毒鼠伤寒沙门杆菌SL7207菌株中，通过抗生素阳性筛选出正确克隆并提取质粒DNA酶切鉴定，制备携带结核分支杆菌Ag85B减毒伤寒杆菌载体疫苗，作为有实用潜力的新型结核分支杆菌疫苗。发现并证实结核分支杆菌Ag85B的减毒伤寒杆菌载体疫苗经口服后可诱导较强的免疫保护力，并能在小鼠体内抵抗毒性结核杆菌的感染。本发明首次运用了以减毒鼠伤寒杆菌为载体的结核Ag85B疫苗的有效应用研究，开辟了一种新型有效的结核疫苗的途径。本发明提供了一种有发展潜力的结核杆菌减毒细菌载体疫苗。减毒的伤寒杆菌作为DNA疫苗的载体，将携带外源性基因的真核表达质粒传递给抗原递呈细胞，刺激机体的免疫应答。在鼠伤寒模型中，减毒鼠伤寒杆菌已被用来作为传递外源性抗原的载体，这些鼠伤寒杆菌经自然途径(如口服途径)感染，可引起系统和粘膜免疫应答，用它传递外源性抗原有很多优点①经口免疫即可诱导粘膜和系统免疫应答；②通常一次免疫即可诱发有效的免疫应答；③操作简便，经济有效。也就是说，减毒伤寒杆菌作为载体运用于疫苗研究具有自身的优势，其最大的优点是改良DNA疫苗肌肉注射的进入途径，提供更好的临床实用性。其口服的给药途径更适宜临床接受，并且疫苗的免疫效力，实验证明并没有受到影响，而且采用服用方式比采用注射疫苗方式更适于患者；其次选择的优势载体优势性载体，更有利于避免少数个体的过敏反应，也增强其临床实用性；选择最具有优势的结核杆菌分泌蛋白编码基因作为目的基因，有利于提高结核杆菌疫苗本身的免疫保护效力。且动物攻毒实验，通过半数生存时间，病理切片及肺脏菌落计数结果表明携带结核分支杆菌Ag85B的减毒伤寒杆菌载体疫苗具有一定的免疫效力。本发明提供的疫苗与现有技术相比，还具有以下的主要优点其一.可以刺激机体产生有效的细胞免疫和体液免疫应答；通过伤寒杆菌对粘膜组织的感染，从而还可提高粘膜免疫组织的合成IgA的能力。其二.与结核Ag85BDNA疫苗相比制备成本低，细菌易繁殖，通常一次免疫即可诱发有效的免疫应答，并具有安全、高效、简便和经济等优点。图1Ag85B基因片段PCR产物的琼脂糖电泳鉴定。其中编号1为PCR产物；编号2为DNA标记。图2重组质粒pGEX-Ag85B的酶切鉴定。其中编号1为pGEX-Ag85B/EcoRI+HindIII；编号2为DNA分子量标准.图3A图为GST-Ag85B融合蛋白的SDS-PAGE分析，其中编号1为蛋白质分子量标准；编号2为GST-Ag85B融合蛋白；编号3为GST蛋白。图3B图为GST-Ag85B融合蛋白的WesternBlot分析。其中编号1和2为GST-Ag85Bfusionprotein。图4重组质粒pVAX-1-Ag85B的酶切鉴定。其中编号1为DNA分子量标准；编号2为pVAX1-Ag85B/BamHI+EcoRI；编号3为pVAX-1空载；编号4为LB5000(pVAX1-Ag85B)/BamHI+EcoRI；编号5为SL7207(pVAX1-Ag85B)/BamHI+EcoRI。图5间接ELISA检测血清抗体效价。血清抗体效价是指当阳性血清OD植等于阴性对照血清OD值2倍时的稀释倍数。pVAX1-Ag85B和SL(Ag85B)的血清效价与对照组相比具有统计学差异(*p＜0.05)。图6脾细胞颗粒酶释放实验结果显示，减毒伤寒杆菌SL7207(pVAX1-Ag85B)组释放颗粒酶最高(6.6％)，其比pVAX1-Ag85B(5.2％)、减毒伤寒杆菌SL7207对照组(37％)、pVAX-1空载对照组(3.7％)、生理盐水组(N.S)(0.6％)和BCG组(5.9％)均高。图7感染小鼠肺脏病理切片HE染色。其中a为生理盐水感染组；b为链霉素治疗组；c为pVAX-1质粒空载组；d为pV-Ag85BDNA疫苗组；e为SL7207空载组；f为SL(Ag85B)疫苗组。图8感染小鼠肺脏病理切片抗酸染色。其中a为生理盐水感染组；b为链霉素治疗组；c为pVAX-1质粒空载组；d为pV-Ag85BDNA疫苗组；e为SL7207空载组；f为SL(Ag85B)疫苗组。具体实施例方式本发明提供的携带结核分支杆菌Ag85B的减毒伤寒杆菌载体疫苗，由包括以下步骤的方法制得1.原核重组表达质粒pGEX-Ag85B的制备及蛋白表达鉴定利用PCR方法对目的基因即Ag85B的BX842578基因序列中的121-975位进行扩增，先去掉Ag85B的BX842578基因序列中的1-120位编码产物及最后3位终止密码TGA，再对目的基因进行扩增；PCR所用的上游引物p1、下游引物p2分别具有SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，即上游引物p15’-TGAATTCAAATGTTCTCCCGGCCG-3’，含有EcoRI酶切位点，下游引物p25’-AAAGCTTTCAGCCGGCGCCTAA-3’，含有HindIII酶切位点。再提取原核表达质粒pGEX-KG，并经酶切回收连接鉴定，而获得所述pGEX-Ag85B。将鉴定成功的原核重组质粒pGEX-Ag85B转化感受态细菌E.coliBL21，经培养、阳性克隆和酶切鉴定后，使含有重组表达质粒的E.coliBL21在LB(Amp+)培养液中培养、接种和诱导培养，再经离心收集菌体及超声碎菌后，提取融合蛋白，然后经纯化和鉴定分析。以质粒pMD-Ag85B为模板进行PCR扩增，所获产物在10g/L琼脂糖凝胶中电泳，经EB染色，在紫外灯下观察到1条约860bp的带，同预期的目的片段的大小相符(图1)。将原核重组质粒pGEX-KG-Ag85B用EcoRI和HindIII进行双酶切，pGEX-KG的大小为5.0kb，扩增产物Ag85B基因的大小约为0.8kb，pGEX-KG-Ag85B经EcoRI和HindIII双酶切后，分成5.0kb和0.8kb两个片段，同预期值相符，表明目的基因已正确插入pGEX-KG载体中(图2)。GST-Ag85B融合蛋白的表达与分析培养含有重组表达质粒的E.coliBL21，用IPTG诱导融合蛋白表达，表达产物纯化后用SDS-PAGE分析.结核分枝杆菌Ag85B蛋白分子量为30kD，GST蛋白分子量为29kD，GST-Ag85B融合蛋白分子量为59kD，结果表明，在Mr59kD处有1条明亮条带，29kD处为GST蛋白，均与预期的分子量相符(图3A)。表达蛋白的WesternBlot分析纯化的融合蛋白经SDS-PAGE电泳后，电转移至PVDF膜上，用结核病人血清检测，在Mr59kD处有1条明亮条带，(图3B)。GST-Ag85B融合蛋白与预期的分子量相同，说明得到了正确表达。2.真核重组表达质粒pVAX1-Ag85B的构建由质粒pMD-Ag85B用BamHI和EcoRI酶切下Ag85B片段，真核表达载体pVAX-1用BamHI和EcoRI酶切回收，T4DNA连接酶作用下定向将Ag85B基因片段与pVAX-1连接，以连接产物转化入DH5α感受态细菌，在LB(kan+)培养基中筛选培养。挑取阳性克隆，培养后小量提取质粒，用BamHI和EcoRI双酶切筛选阳性重组质粒，即得到真核重组表达质粒pVAX1-Ag85B。将真核重组质粒pVAX-1-Ag85B用BamHI和EcoRI进行双酶切，pVAX-1的大小为3.0kb，扩增产物Ag85B基因的大小约为0.8kb，pVAX-1-Ag85B经BamHI和EcoRI双酶切后，分成3.0kb和0.8kb两个片段，同预期值相符，表明目的基因已正确插入pVAX-1载体中(图4)。将电转入减毒伤寒杆菌LB5000中的真核重组质粒pVAX-1-Ag85B用BamHI和EcoRI进行双酶切后，分成3.0kb和0.8kb两个片段，同预期值相符，表明目的基因已转入减毒伤寒杆菌LB5000中(图4)。将电转入SL7207中的真核重组质粒pVAX-1-Ag85B用BamHI和EcoRI进行双酶切后，分成3.0kb和0.8kb两个片段，同预期值相符，表明目的基因已转入减毒伤寒杆菌SL7207中(图4)。3.携带结核分支杆菌Ag85B的减毒伤寒杆菌载体疫苗的制备将鉴定正确的真核重组表达质粒pVAX1-Ag85B电转入减毒伤寒杆菌LB5000及SL7207菌株(赵平，等，Enhancementbyaninvivo-activatedpromoterofimmunogenicityofrecombinantattenuatedSalmonellatyphimuriumexpressinghepatitisCviruscoreantigen，生物化学与生物物理学报，2003，35(3)266-70)中，并通过抗生素阳性克隆筛选及提取质粒酶切鉴定。将电转入减毒伤寒杆菌LB5000中的真核重组质粒pVAX-1-Ag85B用BamHI和EcoRI进行双酶切后，分成3.0kb和0.8kb两个片段，同预期值相符，表明目的基因已转入减毒伤寒杆菌LB5000中(图4)。将电转入SL7207中的真核重组质粒pVAX-1-Ag85B用BamHI和EcoRI进行双酶切后，分成3.0kb和0.8kb两个片段，同预期值相符，表明目的基因已转入减毒伤寒杆菌SL7207中(图4)。4.动物攻毒实验检测疫苗免疫保护效力实验小鼠随机设置空白对照组，阴性对照组及实验组，每隔两周免疫一次，共免疫三次，末次免疫两周后，实验小鼠在ABSL-3(AnimalBiosafetyLevel-3Laboratory)实验室进行人型结核杆菌H37Rv株攻毒实验，分别观察各组小鼠生存时间，于攻毒后第70天处死小鼠，作肺脏及脾脏菌落计数(CFU)，肺脏、脾脏、肝脏组织作病理切片，HE及抗酸染色观察病理变化。小鼠初次免疫两周后，取小鼠尾静脉血，分离血清，用间接ELISA检测特异性抗体效价(图5)。效价结果显示，质粒组pVAX-1-Ag85B及减毒伤寒杆菌SL7207(pVAX1-Ag85B)组均比各自空载对照组有明显的上升(*p＜0.05)。每隔两周免疫一次，共免疫三次，末次免疫后处死部分小鼠，制备脾细胞悬液，检测颗粒酶释放程度反应其细胞免疫水平，结果显示，pVAX1-Ag85B及减毒伤寒杆菌SL7207(pVAX1-Ag85B)组均比各自空载对照组有明显的上升，且SL7207(pVAX1-Ag85B)组略微高于BCG组(如图6)。术次免疫两周后小鼠H37Rv株攻毒实验，分别观察各组小鼠生存时间(表1)，于攻毒后第70天处死小鼠，作肺脏及脾脏菌落计数(CFU)(表2)，肺脏、脾脏、肝脏组织作病理切片，再用HE(图7)及抗酸染色(图8)观察病理变化。本发明提供的疫苗可为口服剂型产品。为口服剂型疫苗时，其服用方法建议为浓度2×108菌/ml，每次0.5ml。疫苗经口服后可诱导较强的抗结核的特异性抗体，并能抵抗毒性结核杆菌对机体的感染。下面再对本发明作进一步说明，但不限定本发明。一.重组质粒的构建鉴定根据GenebankAg85B基因序列(BX842578)Ag85B的基因序列共978bp，其中1-120位编码产物为信号肽，最后3位TGA为终止密码，去掉信号肽及终止密码，因此，Ag85B的扩增区段位于121-975位。设计引物，上游引物为5’-TGAATTCAAATGTTCTCCCGGCCG-3’含有EcoRI酶切位点下游引物为5’-AAAGCTTTCAGCCGGCGCCTAA-3’含有HindIII酶切位点。引物由上海生工合成。扩增反应的条件为95℃预变性3min，以95℃变性50s，57℃退火36s，72℃延伸2min，29个循环后，再于72℃延伸10min。PCR产物以10g/L琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。将目的条带切下，用DNA回收试剂盒回收并纯化。将纯化的PCR产物和载体pGEX-KG用EcoRI和HindIII双酶切后，回收酶切产物，在T4DNA连接酶作用下定向将Ag85B基因片段与pGEX-KG连接，以连接产物转化入DH5α感受态细菌，在LB(Amp+)培养基中筛选培养。挑取阳性克隆，培养后小量提取质粒，用EcoRI和HindIII双酶切筛选阳性重组质粒。真核重组质粒构建方法同上，将鉴定成功的真核重组质粒pVAX-1-Ag85B电转化感受态细菌减毒伤寒杆菌LB5000，在LB(kan+及SM+)培养基中筛选培养。挑取阳性克隆，用双酶切鉴定，将鉴定正确的在LB5000中甲基化修饰的真核重组质粒pVAX-1-Ag85B再次电转化感受态细菌减毒伤寒杆菌SL7207中，在LB(kan+及SM+)培养基中筛选培养。挑取阳性克隆，用双酶切鉴定。二.原核重组质粒pGEX-KGAg85B在大肠杆菌中的诱导表达及鉴定1.重组质粒的诱导表达将鉴定成功的原核重组质粒pGEX-KG-Ag85B转化感受态细菌E.coliBL21，在LB(Amp+)培养基中筛选培养。挑取阳性克隆，用EcoRI和HindIII双酶切鉴定，将含有重组表达质粒的E.coliBL21在LB(Amp+)培养液中，于37℃振荡培养过夜。以1％接种于LB(Amp+)培养液中，于37℃培养至OD600nm约为0.6时，加入终浓度为1mM的IPTG，于30℃继续诱导培养4h.离心收集菌体，经超声碎菌后，提取融合蛋白，经Glutathione-Sepharose4B亲和层析柱进行纯化。2.SDS-PAGE分析将纯化的融合蛋白进行SDS-PAGE(浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为12％)分析，经SDS-PAGE后，用考马斯亮蓝R-250染色4h，甲醇-冰醋酸脱色液脱色并观察结果。3.WesternBlot分析将表达产物经过SDS-PAGE电泳后，电转移至PVDF膜上，用封闭液(含50g/L脱脂奶粉的TBST)室温震荡封闭2h，加入结核病人血清(1∶500)室温反应1h，再加入辣根过氧化物酶标记兔抗人IgG，室温反应1h，用二氨基联苯氨(DAB)底物液显色后，观察结果。三.人型结核杆菌H37Rv株攻毒实验将构建正确的减毒伤寒杆菌载体疫苗SL7202(pVAX1-Ag85B)、DNA疫苗pVAX1-Ag85B及阴性、空白对照，分别免疫实验小鼠，减毒伤寒杆菌载体疫苗组菌液浓度调整为2×108/ml，每只小鼠行灌胃500μl，DNA疫苗pVAX1-Ag85B组DNA浓度调整为100ug/μl，分别于小鼠左右股四头肌肌肉注射50μl。以减毒伤寒杆菌SL7202空载及空载pVAX-1作为阴性对照，生理盐水组作为空白对照，BCG组及链霉素治疗组作为阳性对照组。每隔两周免疫一次，共免疫三次，分别在每次免疫后两周取小鼠尾静脉血，末次免疫后两周处死部分小鼠进行体液免疫及细胞免疫学检测，ELISA法检测每次免疫后血清中特异性抗体的效价，颗粒酶实验检测其细胞免疫水平的变化。末次免疫两周后小鼠在ABSL-3(AnimalBiosafetyLevel-3Laboratory)实验室进行人型结核杆菌H37Rv株攻毒实验，用生理盐水配置成均悬液1mg/ml.经尾静脉每只小鼠注射同等剂量的菌悬液400μl(相当于湿菌0.4mg/只)，分别观察各组小鼠生存时间，于攻毒后第70天处死小鼠，作肺脏及脾脏菌落计数(CFU)，肺脏、脾脏、肝脏组织作病理切片，HE及抗酸染色观察病理变化。附表表1.感染BALB/C小鼠半数死亡时间(T50)及死亡率比较表1中*p＜0.01，*表示与生理盐水攻毒组相比较具有统计学差异。表2.不同疫苗免疫后，小鼠感染结核的肺、脾脏菌落计数比较表2中a表示均数±标准差；*p＜0.05，*表示与生理盐水攻毒组相比较具有统计学差异。参考文献1.DyeC，WattCJ，BleedD.Lowaccesstoahighlyeffectivetherapyachallengeforinternationaltuberculosiscontrol.BullWorldHealthOrgan，2002；80(6)437-444.2.Telenti，Amalio，Iseman，Michael.Drug-resistanttuberculosiswhatdowedonow.Drug，2000；59(2)171-179.3.WHOvaccinepreventabledisease-2000globalsummary.4.FinePE.VariationinprotectionbyBCGimplicationofandforheterologousimmunity.Lancet，1995；3461339-1345.5.RochePW，TriccasJA，WinterN.BCGvaccinationagainsttuberculosispastdisappointmentsandfuturehopes.TrendsMicrobiol.1995，3(10)397-401.6.McMurrayDN.Recentprogressinthedevelopmentandtestingofvaccinesagainsthumantuberculosis.IntJParasitol，2003；33(5-6)547-554.7.DouglasBY，GrahamRS.Tuberculosisvaccine.BritishMedicalBulletion，2002；6273-78.8.KaufmannSH，AndersenP.ImmunitytoMycobacteriaforrationaldesignofeffectivetuberculosisvacine.ChemImmunol.1998；70(1)21-59.9.HorwitzMA，LeeBW，DillonBJ，etal.ProtectiveimmunityagainsttuberculosisinducedbyvaccinationwithmajorextracellularproteinsofMycobacteriumtuberculosis.ProcNatlAcadSciUSA，1995；92(5)1530-1534.10.DenisO，TangheA，PalflietK，etal，.VaccinationwithplasmidDNAencodingmycobacteriualantigen85AstimulatesaCD4+andCD8+T-cellepitopicrepretoirebroaderthanthatstimulatedbyM.TuberculosisH37Rvinfection.InfectImmunol.1998；66(11)1527-1533.11.LozesE，HuygenK，ContentJ，etal.ImmunogenicityandefficacyofatuberculosisDNAvaccineencodingthecomponentsofthesecretedantigen85complex.Vaccine.1997；15(8)830-83312.BonatoVL，LimaVM，TasconRE，etal.IndentificationandcharacterizationofprotectionTcellsinhsp65DNA-vaccinatedandMycobacteriumtuberculosis-infectmice.InfectImmun，1998；66(1)169-175.13.MontgomeryDL，HuygenK，YawmanAM，etal.InductionofhumoralandcellularimmuneresponsesbyvaccinaionwithM.Tuberculosisantigen85DNA.CellMolBiol.1997；43(3)285-292.14.SinhaRK，Verma1，KhullerGk.Immunobiologicalpropertiesofa30KDsecretoryproteinofMycobacteriumtuberculosisH37Rv.Vaccine，1997；15689-699.15.SinhaRK，KhullerGK.Theprotectiveefficacyofaliposomalencapsulated30KDsecretoryproteinofMycobacteriumtuberculosisH37Raagainsttuberculosisinmice.ImmunolCellBiol，1997；75461-466.序列表<110>武汉大学<120>携带结核分支杆菌Ag85B的减毒伤寒杆菌载体疫苗<140><141><160>1<170><210>1<211><212>DNA<213>人工序列<220><221><222>(1)...(26)<223>PCR上游引物(p1)<400>15’-TGAATTCAAATGTTCTCCCGGCCG-3’<210>2<211><212>DNA<213>人工序列<220><221><222>(1)...(24)<223>PCR下游引物(p2)<400>25’-AAAGCTTTCAGCCGGCGCCTAA-3’权利要求1.一种减毒伤寒杆菌载体疫苗，其特征是一种携带结核分支杆菌Ag85B的减毒伤寒杆菌载体疫苗，该疫苗由包括以下步骤的方法制得(1)原核重组表达质粒pGEX-Ag85B的制备利用PCR方法对目的基因即Ag85B的BX842578基因序列中的121-975位进行扩增，再提取原核表达质粒pGEX-KG，并经酶切回收及鉴定，获得pGEX-Ag85B；(2)真核重组表达质粒pVAX1-Ag85B的构建将鉴定成功的原核重组质粒pGEX-KG-Ag85B转化感受态细菌E.coliBL21，经培养、阳性克隆和酶切鉴定后，使含有重组表达质粒的E.coliBL21在LB(Amp+)培养液中培养、接种和诱导培养，再经离心收集菌体及超声碎菌后，提取融合蛋白，然后经纯化和鉴定分析，即得到真核重组表达质粒pVAX1-Ag85B；(3)携带结核分支杆菌Ag85B的减毒伤寒杆菌载体疫苗的制备将鉴定正确的pVAX-1-Ag85B电转入减毒伤寒杆菌LB5000及SL7207菌株，并通过抗生素阳性克隆筛选及提取质粒酶切鉴定；再经动物攻毒实验检测疫苗的免疫保护效力，即得到所述疫苗。2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征是在采用PCR方法扩增时，先去掉Ag85B的BX842578基因序列中的1-120位编码产物及最后3位终止密码TGA，再对目的基因进行扩增；PCR所用的上游引物p1、下游引物p2分别具有SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，即上游引物p15’-TGAATTCAAATGTTCTCCCGGCCG-3’，含有EcoRI酶切位点，下游引物p25’-AAAGCTTTCAGCCGGCGCCTAA-3’，含有HindIII酶切位点。3.根据权利要求1所述的疫苗，其特征是为口服剂型的抗结核疫苗。全文摘要本发明公开了一种携带结核分支杆菌Ag85B的减毒伤寒杆菌载体疫苗，其由包括原核重组表达质粒pGEX－Ag85B的制备、真核重组表达质粒pVAX1－Ag85B的构建以及所述抗结核的减毒伤寒杆菌载体疫苗的制备步骤的方法制得。本发明首次运用了以减毒鼠伤寒杆菌为载体的结核Ag85B疫苗的有效应用研究，开辟了一种新型有效的结核疫苗的途径；与DNA疫苗等相比的优点是，本疫苗能口服，临床实用性强，制备简易、成本低，通常一次免疫即可诱发有效抵抗结核感染的免疫应答，并具有安全、高效、简便和经济等优点。文档编号C12N15/63GK101049508SQ20071005215公开日2007年10月10日申请日期2007年5月11日优先权日2007年5月11日发明者章晓联,王坤申请人:武汉大学