专利名称：能抑制伤寒杆菌侵入人体细胞的多肽及其制备方法
技术领域：
本发明属于分子微生物学和感染免疫领域。涉及一种能抑制伤寒杆菌(Salmonella Typhi)侵入人体细胞的多肽，该多肽能与感染人的伤寒杆菌特有的病原性毒力岛上IV型纤毛结构蛋白高亲和，同时还涉及该多肽的制备方法。
背景技术：
近2300种相关的沙门氏菌中，伤寒杆菌是最重要的致病菌，它是唯一只对人致病并导致伤寒肠热症的细菌。伤寒杆菌可通过污染的食物和水流行和传染。每年全世界感染伤寒杆菌的人数达16.6亿，我国伤寒也长期流行。大多数沙门氏菌只引起肠炎，但伤寒杆菌可侵入人体血管导致高烧及更严重的肠热症和败血症，是临床治疗中颇为棘手的问题。遗憾的是至今为止全世界还没有完善的伤寒疫苗；而近十几年来，伤寒杆菌出现对多种抗菌素耐药(如抗氯霉素抗性等)的趋势，这也成为非常严重的问题。
近年克隆和发现伤寒杆菌IVB型纤毛操纵子，该操纵子含有11个基因，其中pilS基因是负责编码伤寒杆菌IVB型纤毛的结构蛋白PilS，并已构建好了高水平表达谷胱甘肽硫转移酶PilS融合蛋白(GST-PilS融合蛋白)的重组质粒菌株。伤寒杆菌IVB型纤毛缺失突变株(Typhi J341pilS-)只有表达IVB型纤毛的伤寒杆菌(Serovar Typhi A21-6)侵入小肠细胞的5％-25％，加入可溶性的prePilS蛋白(该蛋白为PilS蛋白的前体)可抑制伤寒杆菌对细胞的侵袭。见参考文献Zhang X-L，Tsui I.S.M.，Yip C.M.C.，Fung A.W.Y.，Wong D.K.-H.，Dai X-Y，Yang Y-H，Hackett J，and Morris C.，Salmonella enterica serovar typhi uses type IVB pili to enter humanintestinal epithelial cells.Infect Immun 2000；Vol.68.No.6.3067-3073。
核糖体展示技术将编码(NNM)12随机12肽的DNA库在体外转录、翻译，转录产物mRNA由于缺乏终止子，不能从核糖体上释放，而与新生多肽、核糖体以共价键结合，形成一个稳定的复合体结构。利用固相化抗原或受体的特异性的单克隆抗体亲和筛选核糖体表面的随机多肽，分离特异性结合的mRNA-核糖体-多肽复合物，通过降低Mg2+浓度，核糖体解离，释放mRNA，回收核糖体富集库中的mRNA，逆转录成cDNA，PCR扩增，其产物可作为下一轮体外合成的模板，经过几轮筛选，找到与靶蛋白结合的受体。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能抑制伤寒杆菌侵入人体细胞的多肽。该多肽可特异性抵抗和抑制野生型伤寒杆菌对人体细胞的侵袭。
本发明的另一目的在于提供一种制备多肽的方法，该方法简便，其对于筛选和进化抗体，从随机寡核苷酸体外转录和翻译编码的短肽中筛选出能折叠、具有活性的抗体。除此之外，核糖体展示技术还可用于筛选配体和受体、确定抗原表位、新的蛋白酶抑制物和新的药物开发等。该方法的整个过程都在细胞外进行，不需转化细胞，即可以获得大容量库，从而提高了稀有克隆被分离出来的概率并增加了给定系统中被筛选序列的多样性。其次，核糖体展示技术避免了细胞内、外操作的转换，筛选过程简单，可以在较短时间内进行多轮筛选。而且，核糖体展示技术还能通过逆转录PCR确定基因型。再者，核糖体展示技术能筛选具有细胞毒性的分子。此外，核糖体展示技术还可以通过易错PCR(error-prone PCR)、DNA改组(DNA shuffling)和stEP(stagged extensionprocession)引入突变，从中筛选出编码具有新功能或高活性的表达产物新基因。
本发明技术方案如下1、制备和纯化PilS-GST-Sepharose 4B将谷胱甘肽硫转移酶-IVB型纤毛结构蛋白融合蛋白重组质粒菌株(见参考文献Zhang X-L，Tsui I.S.M.，Yip C.M.C.，Fung A.W.Y.，Wong D.K.-H.，Dai X-Y，Yang Y-H，Hackett J，and Morris C.，Salmonella enterica serovar typhi uses type IVB pili to enter human intestinalepithelial cells.Infect Immun 2000；Vol.68.No.6.3067-3073。)，接种于浓度为50μg/ml的氨苄抗菌素的2×YT液体培养基中，30℃振荡培养至600nm吸光度值为1～2，加入异丙基硫代β-D半乳糖苷(IPTG)使其浓度为0.1mmol/L诱导，30℃振荡培养4～6小时，浓缩菌株，超声破碎，加入TritonX-100使其浓度为1％，轻混30分钟，12000转/分钟离心10分钟，取上清，加入谷胱甘肽琼脂糖4B(Gluthathion-Sepharose 4B)，25℃混合30分钟，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，即得到纯化的PilS-GST-Sepharose 4B。
上述2×YT液体培养基为1升水中溶解蛋白胨16g，酵母提取物10g，NaCl5g。
2、随机单链DNA(ssDNA)文库的构建和引物合成构建长度为90个碱基的随机单链DNA(ssDNA)文库3’-CCT CTA TAT AGGTACCGA TCG(NNM)12AGGCCGGTA GTA GTA GTA GTA GTACCT AGGCCA-5’(N代表A、C、T、G，M代表A、C)，第一轮PCR的上游引物U15’-GCTCGTATAATGTGTGGCCACAACGGAAGGAGATATATCCATG-3’，下游引物D15’-GGCATACACTTGAAGGTGAGCCACTACCACTTCCACTACCGGATCCATGATG-3’.第二轮PCR的上游引物U25’-GCGCTGCAGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTG-3’，下游引物为D1。随机ssDNA文库和引物由上海博亚生物有限公司合成。
3、双链DNA(dsDNA)文库的PCR扩增以单链DNA文库为模板，引物U1和D1扩增得到第一轮PCR产物。用2％琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳，用Qiagen公司提供的DNA纯化回收试剂盒纯化；已回收的DNA为模板，用引物U2和D1进行扩增，得到的产物纯化回收，即为双链DNA文库。
4、核糖体文库的构建将PCR扩增的随机DNA文库于体外转录—翻译偶联的E.coli S30 Extract System中表达。采用的E.coli S30 Extract System是适用于线性DNA模板的体外转录翻译系统，将随机DNA文库8.5μL，氨基酸混合液(无甲硫氨酸)5μL，S30 Premix without Amino Acids 20μL，[35S]-甲硫氨酸(10.2mCi/mL) 1.5μL，S30 Extract 15μL加入到用0.1％DEPC处理过夜的EP管中，30℃温育2小时30分钟后，冰上放置5分钟终止反应。
5、筛选在体外转录翻译混合物中加入DNase去除DNA模板，将体外转录/翻译混合物加入到经无RNase的洗液(PBS pH7.4，1％Tween-20，5mM醋酸镁)洗涤过的PilS-GST-Sepharose 4B中，4℃摇动1小时，经洗液洗涤3次后收集沉淀，沉淀溶于无RNase的水中，加入无RNase的洗脱液(50mM Tris-醋酸pH7.5，150mM NaCl，10mM EDTA)，4℃温育10分钟使mRNA与核糖体解离，用RNaid Kit回收mRNA。以回收的mRNA为模板进行RT-PCR。
6、克隆和测序 经过一轮筛选，将获得的RNA-核糖体-多肽库经RT-PCR获得DNA库，用BamHI和PstI消化后连于质粒pUC19上，随机挑取单个克隆测序，得到的核苷酸序列均为相同，均为AGG CAG GAG AGG TCT TCT CTTTCG AAG CCG GTG GTG，相应的氨基酸序列为RQERSSLSKPVV，命名为多肽R，在西安美联公司合成多肽R和对照随机多肽YYKLPGHHHHYRP。
上述制备的多肽的作用和功能A细菌侵袭试验检测多肽R(12肽)和随机12肽Y对伤寒杆菌侵入人单核细胞THP-1细胞抑制能力将2、3、4、6μM的多肽R和Y分别与人伤寒杆菌Serovar Typhi J341(野生型人伤寒杆菌)、Typhi PilS-(IV型纤毛缺失的伤寒杆菌)室温温育15分钟后，将伤寒杆菌加入至THP-1细胞(细胞/细菌1/10)，37℃，5％CO2，2小时反应后，用PBS反复洗涤5次以去除胞外菌，再加入庆大霉素(100μg/ml)37℃，5％CO2，1小时温育以杀灭残存的胞外菌，再用PBS反复洗涤5次后收获细胞。将细胞重悬于1％TritonX-100的PBS溶液中，室温下振荡10分钟裂解细胞后，取总体积的1/200涂于20mm的LB琼脂平板上，37℃培养14-16小时后，计算平板上的菌落数。该侵袭实验共重复3次，每次试验每个试验组均重复3次。
B等温滴定量热法检测多肽和GST-PilS蛋白的亲和力37℃时多肽R与PilS-GST或GST蛋白相互作用的热力学性质的测定在美国MicroCal公司生产的VP型等温滴定量热仪上进行。滴定实验中，将多肽溶液装入250μL的滴定注射器，PilS-GST或GST蛋白溶液放入1.43mL的样品池，搅拌器以300r/min的速度搅拌，每间隔360s加入10μL多肽溶液到蛋白溶液中，共滴28次.参比池中加入去离子水作为样品池的热平衡参照.须另做一空白实验以扣除多肽稀释热的影响，即在样品池中加入缓冲液，用多肽溶液滴定.蛋白的稀释热经测定非常小，可略去.所有的溶液都在相应温度条件下真空脱气处理以减小信号噪音.积分每个峰面积并扣除稀释热后得到结合反应热，对多肽与蛋白的摩尔比作图得到反应等温线.以MicroCal公司提供的Origin软件(版本5.0)中的独立结合位点模型进行非线性最小方差拟合，可计算出多肽与蛋白作用的本征结合常数Kb。
发明优点和效果本发明提供了一种能能抑制伤寒杆菌侵入人体细胞的多肽。它在制备过程中采用了新的组合化学技术—核糖体展示技术进行特异性结合伤寒杆菌IV纤毛结构蛋白的多肽的筛选。其最大的优点是它能特异性结合在伤寒杆菌致病过程中发挥关键作用的IV型纤毛上，可显著抑制伤寒杆菌侵入人体细胞，是极有潜在临床应用价值的生物制剂，此外还可为进一步探讨伤寒杆菌的致病机制提供帮助。
图1.DNA文库的设计示意图。
以设计的随机寡核苷酸作为模板，用引物U1和引物D1进行第一轮PCR，再以第一轮PCR产物为模板，用引物U2和D1进行第二轮PCR。
图2.核糖体文库的制备和筛选的示意图。
含随机12肽的DNA文库在体外转录、翻译，转录产物mRNA由于缺乏终止子，不能从核糖体上释放，而与新生多肽、核糖体以共价键结合，形成一个稳定的复合体结构。利用PilS-GST-Sepharose4B亲和筛选核糖体表面的随机多肽，分离特异性结合的mRNA-核糖体-多肽复合物，通过降低Mg2+浓度，核糖体解离，释放mRNA，回收核糖体富集库中的mRNA，逆转录成cDNA，PCR扩增，其产物可作为下一轮体外合成的模板。
图3.核糖体展示系统的表达示意图。
不同数量的随机DNA文库，用E.coli S30 Extract System体外偶联转录翻译后，[35S]-甲硫氨酸标记的翻译产物，于液体闪烁计数器中计数，结果见图3，随着DNA模板量的增加，随机12肽核糖体文库的翻译产物表达量增加。
图4.细菌侵袭试验检测多肽抑制伤寒杆菌侵入THP-1细胞示意图。
由图4可知，多肽R可抑制野生型伤寒杆菌进入THP-1细胞，其中6μM多肽R的抑制能力最强，而多肽Y不能抑制野生型伤寒杆菌进入THP-1细胞；多肽R和多肽Y均不能抑制IV型纤毛缺失的伤寒杆菌进入THP-1细胞。
图5.等温滴定量热法检测多肽和GST-PilS蛋白的亲和力示意图。
由图5A可知，1mM多肽R滴定10μM GST-PilS蛋白溶液的发应是放热的，多肽R和GST-PilS蛋白通过单位点结合，结合常数Kb值为0.4×105L·mol-1and2.2×105L·mol-1；由图5B可知，多肽R和GST蛋白无结合位点。
具体实施例方式
1、制备和纯化PilS-GST-Sepharose 4B将高表达PilS的pGEX-2T-pilS重组质粒菌株接种于含50μg/ml的Amp抗菌素的2×YT(配方1L水中溶解蛋白胨16g，酵母提取物10g，NaCl 5g)液体培养基上，30℃振荡培养至OD6001-2之间，加入IPTG至终浓度0.1mM诱导，30℃振荡培养4小时浓缩菌株后超声破碎，加入TritonX-100至终浓度为1％，轻混30分钟后，离心取上清，加入Gluthathion-Sepharose 4B，25℃轻混30分钟后用PBS洗涤三次，即得到纯化的PilS-GST-Sepharose 4B。
2、随机单链DNA(ssDNA)文库的构建和引物合成ssDNA库为3’-CCTCTA TAT AGGTACCGA TCG(NNM)12AGG CCGGTA GTA GTA GTA GTAGTACCT AGGCCA-5’(90)(N代表A、C、T、G，M代表A、C)，第一轮PCR的上游引物U15’-GCTCGTATAATGTGTGGCCACAACGGAAGGAGATATATCCATG-3’，下游引物D15’-GGCATACACTTGAAGGTGAGCCACTACCACTTCCACTACCGGATCCATGATG-3’.第二轮PCR的上游引物U25’-GCGCTGCAGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTG-3’，下游引物为D1。随机ssDNA文库和引物由上海博亚生物有限公司合成。
3、双链DNA(dsDNA)文库的PCR扩增通过两轮PCR将单链DNA文库合成双链DNA文库，2％的琼脂糖凝胶电泳后用DNA纯化回收试剂盒纯化。
4、核糖体文库的制备 将PCR扩增的随机DNA文库于体外转录—翻译偶联的E.coli S30 Extract System中表达。采用的E.coli S30 Extract System是适用于线性DNA模板的体外转录翻译系统，将随机DNA文库8.5μL，氨基酸混合液(无甲硫氨酸)5μL，S30 Premix without Amino Acids 20μL，[35S]-甲硫氨酸(10.2mCi/mL)1.5μL，S30 Extract 15μL加入到用0.1％DEPC处理过夜的EP管中，30℃温育2小时30分钟后，冰上放置5分钟终止反应。
5、筛选在体外转录翻译混合物中加入DNase去除DNA模板，将体外转录/翻译混合物加入到经无RNase的洗液(PBS pH7.4，1％Tween-20，5mM醋酸镁)洗涤过的PilS-GST-Sepharose 4B中，4℃摇动1小时，经洗液洗涤3次后收集沉淀，沉淀溶于无RNase的水中，加入无RNase的洗脱液(50mM Tris-醋酸pH 7.5，150mM NaCl，10mM EDTA)，4℃温育10分钟使mRNA与核糖体解离，用RNaid Kit回收mRNA。以回收的mRNA为模板进行RT-PCR。
6、克隆和测序将经过一轮筛选的DNA文库用BamHI和PstI酶切后，克隆到pUC19，挑取12个正确的克隆测序，得到的序列均为同一序列AGG CAG GAG AGG TCTTCT CTT TCG AAG CCG GTG GTG，相应的氨基酸序列为RQERSSLSKPVV，命名为多肽R，在西安美联公司合成多肽R和对照随机多肽YYKLPGHHHHYRP。
通过上述方法获得的氨基酸序列具有以下功能和作用A、细菌侵袭试验检测多肽抑制伤寒杆菌侵入THP-1细胞将2、3、4、6μM的多肽R和Y分别与人伤寒杆菌Serovar Typhi J341(野生型人伤寒杆菌)、Typhi PilS-(IV型纤毛缺失的伤寒杆菌)室温温育15分钟后，将伤寒杆菌加入至THP-1细胞(细胞/细菌1/10)，37℃，5％CO2，2小时反应后，用PBS反复洗涤5次以去除胞外菌，再加入庆大霉素(100μg/ml)37℃，5％CO2，1小时温育以杀灭残存的胞外菌，再用PBS反复洗涤5次后收获细胞。将细胞重悬于1％TritonX-100的PBS溶液中，室温下振荡10分钟裂解细胞后，取总体积的1/200涂于20mm的LB琼脂平板上，37℃培养14-16小时后，计算平板上的菌落数。该侵袭实验共重复3次，每次试验每个试验组均重复3次。
B、等温滴定量热法检测多肽和GST-PilS蛋白的亲和力37℃时多肽R与PilS-GST或GST蛋白相互作用的热力学性质的测定在美国MicroCal公司生产的VP型等温滴定量热仪上进行。滴定实验中，将多肽溶液装入250μL的滴定注射器，PilS-GST或GST蛋白溶液放入1.43mL的样品池，搅拌器以300r/min的速度搅拌，每间隔360s加入10μL多肽溶液到蛋白溶液中，共滴28次.参比池中加入去离子水作为样品池的热平衡参照.须另做一空白实验以扣除多肽稀释热的影响，即在样品池中加入缓冲液，用多肽溶液滴定.蛋白的稀释热经测定非常小，可略去.所有的溶液都在相应温度条件下真空脱气处理以减小信号噪音.积分每个峰面积并扣除稀释热后得到结合反应热，对多肽与蛋白的摩尔比作图得到反应等温线.以MicroCal公司提供的Origin软件(版本5.0)中的独立结合位点模型进行非线性最小方差拟合，可计算出多肽与蛋白作用的本征结合常数Kb。
SEQUENCE LISTING<110>武汉大学<120>能抑制伤寒杆菌侵入人体细胞的多肽及其制备方法<130>能抑制伤寒杆菌侵入人体细胞的多肽及其制备方法<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>12<212>PRT<213>人工序列<400>1Arg Gln Glu Arg Ser Ser Leu Ser Lys Pro Val val1 5 10<210>2<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>2aggcaggaga ggtcttctct ttcgaagccg gtggtg 3权利要求
1.一种能抑制伤寒杆菌侵入人体细胞的多肽，其具有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种能抑制伤寒杆菌侵入人体细胞的多肽，其特征在于核苷酸序列为SEQIDNO.2。
3.一种用于制备权利要求1所述的能抑制伤寒杆菌侵入人体细胞的多肽的方法，它包括以下步骤A、制备和纯化PilS-GST-Sepharose 4B将谷胱甘肽硫转移酶-IVB型纤毛结构蛋白融合蛋白重组质粒菌株接种于浓度为50μg/ml的氨苄抗菌素的2×YT液体培养基中，30℃振荡培养至600nm吸光度值为1～2，加入异丙基硫代β-D半乳糖苷使其浓度为0.1mmol/L诱导，30℃振荡培养4～6小时，浓缩菌株，超声破碎，加入TritonX-100使其浓度为1％，轻混30分钟，12000转/分钟离心10分钟，取上清，加入谷胱甘肽琼脂糖4B，25℃混合30分钟，用磷酸盐缓冲液洗涤3次，即得到纯化的PilS-GST-Sepharose 4B；B、随机单链DNA文库的构建和引物合成构建长度为90个碱基的随机单链DNA文库3’-CCT CTA TAT AGGTACCGA TCG(NNM)12AGG CCGGTA GTAGTA GTA GTA GTACCT AGGCCA-5’第一轮PCR的上游引物U15’-GCTCGTATAATGTGTGGCCACAACGGAAGGAGATATATCCATG-3’，下游引物D15’-GGCATACACTTGAAGGTGAGCCACTACCACTTCCACTACCGGATCCATGATG-3’.第二轮PCR的上游引物U25’-GCGCTGCAGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTG-3’，下游引物为D1；C、双链DNA文库的PCR扩增以单链DNA文库为模板，引物U1和D1扩增得到第一轮PCR产物，用2％琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳，用Qiagen公司提供的DNA纯化回收试剂盒纯化；已回收的DNA为模板，用引物U2和D1进行扩增，得到的产物纯化回收，即为双链DNA文库；D、核糖体文库的构建将PCR扩增的随机DNA文库于体外转录—翻译偶联的E.coli S30 Extract System中表达，采用的E.coli S30 Extract System是适用于线性DNA模板的体外转录翻译系统，将随机DNA文库8.5μL，无甲硫氨酸的氨基酸混合液5μL，S30 Premix without Amino Acids 20μL，10.2mCi/mL的[35S]-甲硫氨酸1.5μL，S30 Extract 15μL加入到用0.1％DEPC处理过夜的EP管中，30℃温育2小时30分钟后，冰上放置5分钟终止反应；E、筛选在体外转录翻译混合物中加入DNase去除DNA模板，将体外转录/翻译混合物加入到经无RNase的洗液洗涤过的PilS-GST-Sepharose 4B中，4℃摇动1小时，经洗液洗涤3次后收集沉淀，沉淀溶于无RNase的水中，加入无RNase的洗脱液，4℃温育10分钟使mRNA与核糖体解离，用RNaid Kit回收mRNA，以回收的mRNA为模板进行RT-PCR；F、克隆和测序经过一轮筛选，将获得的RNA-核糖体—多肽库经RT-PCR获得DNA库，用BamHI和PstI消化后连于质粒pUC19上，随机挑取单个克隆测序，得到的核苷酸序列和氨基酸序列。
全文摘要
本发明公开了一种能抑制伤寒杆菌侵入人体细胞的多肽及其制备方法。多肽具有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列，其制备步骤为首先是制备和纯化PilS－GST－Sepharose 4B；其次是随机单链DNA文库的构建和引物合成；第三是双链DNA文库的PCR扩增；第四是核糖体文库的构建；第五是筛选；第六是克隆和测序。本发明的多肽可特异性抵抗和抑制野生型伤寒杆菌对人体细胞的侵袭，制备方法简便，整个过程都在细胞外进行，不需转化细胞，即可以获得大容量库，提高了稀有克隆被分离出来的概率，增加了给定系统中被筛选序列的多样性，可以在较短时间内进行多轮筛选。
文档编号C12P19/34GK1683396SQ20051001838
公开日2005年10月19日 申请日期2005年3月16日 优先权日2005年3月16日
发明者章晓联, 吴红艳 申请人:武汉大学