用于提高链霉菌抗生素产量的方法及菌株的制作方法

专利名称：用于提高链霉菌抗生素产量的方法及菌株的制作方法
技术领域：
本发明属于利用链霉菌提高抗生素产量的技术领域。具体涉及高产链霉菌菌株的选育、中间载体的构建和利用培育的链霉菌菌株提高抗生素产量的方法。本发明利用破坏一个基因来达到提高链霉菌产抗生素水平的方法，申请人把这个基因命名为nsdA，它在天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)和阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)中是一个抗生素产生的负调节基因。本发明建立在天蓝色链霉菌和阿维链霉菌中将该基因破坏，利用新改造的菌株提高其抗生素的产量。
背景技术：
链霉菌属于一类极具商业价值的工业微生物。在微生物界产生的抗生素中，放线菌产生的占2/3，这其中，链霉菌产生的又占大多数，为80％(Kieser等，2000，Practical Streptomyces Genetics.The JohnInnes Foundation，Norwich，第10页)，它们分别在抗肿瘤、抗真菌、抗细菌、抗寄生虫等方面具有功效。例如用于抗家畜寄生虫及杀螨虫的阿维菌素，防治水稻纹枯病的井岗霉素，用于医疗和兽医的红霉素、四环素，用作动物生长促进剂的泰洛星，用于植物保护的春日霉素、多氧霉素，用做抗癌药物的柔毛霉素，用做免疫抑制剂的FK506和雷帕霉素等。
正是由于链霉菌具有如此大的商业价值，人们想出了多种方法来提高链霉菌的抗生素产量的方法，这些方法包括两大类，一类是通过物理化学方法对链霉菌进行诱变，然后在诱变后代中筛选高产菌株的方法，一类是通过遗传学的方法，对菌株进行直接的遗传改变，提高抗生素的产量。通过物理化学方法对链霉菌进行诱变虽然已经取得了很大的成绩，得到了大量的高产菌株，但是，这种方法的筛选工作量大，而且具有一定盲目性，因为，通过诱变得到的菌株多数是低产菌株，只有少数是高产菌株。随着细菌基因组研究的不断深入，对细菌基因功能的认识不断深刻，人们越来越倾向于用遗传学手段对菌株进行改造。用遗传学的方法可以将功能已知的基因进行改造，增强了操作的针对性，而且使工作量大大降低，筛选时间也得到缩短。
例如，在天蓝色链霉菌中，actII-ORF4是抗生素放线紫红素合成的途径专一性正调节因子，可以通过提高它的表达量来提高放线紫红素的产量(Gramajo HC等，1993，Stationary-phase production of theantibiotic actinorhodin in Streptomyces coelicolor A3(2)is transcriptionally regulated.MolMicrobiol.，7837-845)。在变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)中，actII-ORF4同样可以用来提高放线紫红素的产量(Bruheim P等，2002，High-yield actinorhodin production in fed-batch cultureby a Streptomyces lividans strain overexpressing the pathway-specific activator gene actll-ORF4.J Ind Microbiol Biotechnol.，28103-111)。在灰色链霉菌(Streptomyces griseus)中，ArpA蛋白抑制抗生素的产生，可以通过对arpA基因进行破坏，提高链霉素的产量(Onaka，H.等，1995，Cloning andcharacterization of the A-factor receptor gene from Streptomyces griseus.J Bacteriol，1776083-6092)。在阿维链霉菌中，可以通过将aveR1或aveR2基因进行破坏，提高阿维链霉菌中阿维菌素的产量(美国专利US6197591，Stutzman-Engwall)。
通过遗传学方法对链霉菌进行改造，提高抗生素产量，主要是通过改造抗生素产生的调节基因来进行的，这些调节基因，有的是起正调节作用的，有的是起负调节作用的，有的可以调节多种抗生素的产量，有的则只能调节一种抗生素的产量。对起正调节作用的基因，可以通过提高它在菌株中的拷贝数或者提高它的表达量来提高抗生素的产量，对起负调节作用的基因，则可以通过破坏该基因来提高抗生素的产量，但是，通过提高拷贝数的方法得来的菌株往往稳定性较差，因为高拷贝的遗传载体往往不稳定，容易丢失。而通过破坏负调节基因得来的菌株稳定性较强，因为对菌株的改造已经发生在染色体上。另外，对能同时调控多种抗生素产量的调节基因进行改造比改造只调控单一抗生素产量的调节基因更加有效。
本发明的工作是在天蓝色链霉菌和阿维链霉菌中进行的，天蓝色链霉菌的全序列已经测定，用于本发明的nsdA基因的全序列及两侧片段序列可以在公共数据库中得到，它在Genbank核苷酸数据库中为天蓝色链霉菌全基因组(登录号NC_003888.3)的一部分，即从6084219到6085721碱基，它所编码的蛋白序列在Genbank数据库中的编号为NP_629717，GI号为21223938，该蛋白在天蓝色链霉菌蛋白中的编号为SC05582。阿维链霉菌的全基因组也已经测定了，它在Genbank中的登录号为NC_003155.2，其中nsdA基因处在其中从3250639到3252114碱基处的互补链，它所编码的蛋白序列在Genbank数据库中的编号为NP_823828，GI号为29829194。
虽然天蓝色链霉菌和阿维链霉菌基因组序列已经测定并发表，nsdA的全序列已经可以在Genbank数据库中得到，但是，关于该基因的功能的描述还是模糊的，在Genbank数据库中对该基因编码蛋白的功能预测是“可能的调节蛋白”，在现有的文献中，还没有利用该基因提高链霉菌抗生素产量的报道。

发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提出一种提高链霉菌抗生素产量的方法，该方法属于分子生物学方法的一种，它通过破坏链霉菌中的一个基因nsdA，达到提高链霉菌中的抗生素产量的目的。
本发明进一步提供了该方法在天蓝色链霉菌和阿维链霉菌中的应用，并且提供了利用该方法得到的链霉菌抗生素高产菌株。
本发明的目的还涉及到在上述构建新的链霉菌菌株过程中所构建的中间载体。
本发明提供的提高链霉菌中的抗生素产量的方法的流程图如图1所示，首先，从链霉菌的基因组文库筛选出含有nsdA基因的克隆，或是从链霉菌的总DNA中通过PCR的方法将含有nsdA基因的片段克隆下来，得到含有nsdA基因片段的重组载体。然后，构建nsdA基因被破坏了的重组载体。在本发明的实施例中构建了2个这样的重组载体，即pHZ2718和pHL214。包含pHZ2718的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α菌株已经于2005年1月13日保存在CCTCC，保藏号为CCTCC M205005；包含pHL214的大肠杆菌DH5α菌株已经于2005年1月13日保存在CCTCC，保藏号为CCTCC M205006。第三步，通过接合转移将第二步得到的重组载体转移到链霉菌菌株中。第四步，通过抗性筛选得到nsdA基因被破坏了的链霉菌菌株。第五步，通过Southern杂交或PCR验证第四步得到的链霉菌菌株。本发明的实施例得到两个这样的链霉菌菌株，分别是天蓝色链霉菌nsdA基因被破坏了的菌株YX2(学名为Streptomyces coelicolor)，于2005年1月13日保存在CCTCC，保藏号为CCTCC M205007；阿维链霉菌nsdA基因被破坏了的菌株WQ5(学名为Streptomyces avermitilis)，于2005年1月13日保存在CCTCC，保藏号为CCTCC M205008。第六步，对第五步得到的链霉菌菌株进行产抗生素的测定分析，得到抗生素高产的菌株。对该方法的具体说明请参考本发明的两个实施例，它们分别在天蓝色链霉菌和阿维链霉菌中实现了抗生素产量的提高。
本发明的优点是，克服了物理化学诱变育种的盲目性、和大工作量的不足，利用破坏一个链霉菌中的负调节基因，提高链霉菌的产抗生素水平，该基因是用于链霉菌的抗生素高产育种的一个新的基因，所以该方法是用于链霉菌的抗生素高产育种的一个新方法。利用该方法对天蓝色链霉菌进行改造，发现它能使放线紫红素的产量提高到出发菌株M145(Bentley SD等，2002，Complete genome sequence of the modelactinomycete Streptomyces coelicolor A3(2).Nature，417141-147)的6.7倍，同时能使改造后的阿维链霉菌的阿维菌素总量提高到出发菌株NRRL8165(美国专利，Method for the separation ofantibiotic macrolides.，Cole，专利号4,160,861；菌株保藏于NRRL，该菌株已公开发放使用。)的4.4倍。另外，该方法可以同时提高多种抗生素的产量，例如在天蓝色链霉菌中，利用该方法可以同时提高放线紫红素、钙依赖抗生素和次甲基霉素的产量。


附图1利用破坏nsdA基因提高链霉菌产素量方法的流程图。
附图2是本发明其中一个实施例中用于天蓝色链霉菌的中间载体pHZ2718的物理构建图谱。
附图3本发明其中一个实施例中天蓝色链霉菌中的nsdA基因破坏后放线紫红素产量提高的效果图。
附图4本发明其中一个实施例中天蓝色链霉菌中的nsdA基因破坏后放线紫红素产量的定量测定图。
附图5本发明其中一个实施例中天蓝色链霉菌中的nsdA基因破坏后钙依赖抗生素与次甲基霉素产量提高的定性测定效果图。
附图6是本发明其中另外一个实施例中用于阿维链霉菌的中间载体pHL214的物理构建图谱。
具体实施例方式
实施例1利用中断天蓝色链霉菌中的nsdA基因提高抗生素产量1.1)包含被破坏了nsdA基因的重组载体pHZ2718的构建天蓝色链霉菌是链霉菌研究的模式菌株，它已经有自己的一套基因组文库质粒。SC7A1(Redenbach等，1996，A set of ordered cosmids and a detailed genetic and physical map for the 8Mb Streptomycescoelicolor A3(2)chromosome.Mol Microbiol，2177-96)就是其中的一个，它的外源片段长46kb，其中含有nsdA基因。将含有SC7A1的大肠杆菌菌株DH5α(Hanahan D.Studies on the transformation ofE.coli with plasmids.J Mol Biol，1983，166557-580)在LB培养基(如后面所述)中37℃培养过夜，抽提质粒，用BglII酶切，回收18kb的片段，将此片段与pHJL401(Larson等，1986，The minimalreplicon of a streptomyces plasmid produces an ultrahigh level of plamid DNA.Plasmid，15199-209)用BamHI酶切的片断连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞得到转化子命名为pHZ2703。将pHZ2703用XhoI部分酶切然后自连，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞得到转化子，抽提转化子质粒并用XhoI酶切，选择丢失3kb XhoI片段的转化子命名为pHZ2706。将pHZ2706用PstI酶切，回收7.8kb的片段与pHJL401经PstI酶切得到的片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞得到转化子命名为pHZ2715，将pHZ2715转化大肠杆菌ET12567(Flett F，Mersinias V，Smith CP，1997，High efficiency intergeneric conjugaltransfer of plasmid DNA from Escherichia coli to methyl DNA-restricting streptomycetes.FEMSMicrobiol Lett.155(2)223-229)感受态，将转化子抽质粒，然后将质粒用BclI酶切，回收4.1kb的片段与ET12567菌株中抽提出的pHZ199(Xiaohua Li，Xiufen Zhou，Zixin Deng，2003，Vector SystemsAllowing Efficient Autonomous or Integrative Gene Cloning in Micromonospora sp.Strain 40027.Applied and Environmental Microbiology，693144-3151)质粒经BamHI酶切得到的片段连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞得到转化子命名为pHZ2717。用BamHI完全酶解pHZ2717，回收9.8kb的片段，与质粒pHP45Ωaac(3)IV(Blondelet-Rouault MH等，1997，Antibiotic resistance gene cassettes derivedfrom the omega interposon for use in E.coli and Streptomyces.Gene，190(2)315-317)经BamHI酶切得到的1.7kb的片断连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞得到转化子命名为pHZ2718。
pHZ2718的物理图谱如图2所示，它的大小为11.56kb，bla为氨苄青霉素抗性基因，ori为能在大肠杆菌中复制的复制子，oriT(Kieser等，2000，Practical Streptomyces Genetics.The John InnesFoundation，Norwich，第502页)为接合转移的起始位点，tsr(Kieser等，2000，Practical StreptomycesGenetics.The John Innes Foundation，Norwich，第457页)为能在链霉菌中筛选的硫链丝菌素抗性基因，hyg(Kieser等，2000，Practical Streptomyces Genetics.The John Innes Foundation，Norwich，第485页)为潮霉素抗性基因，aac(3)IV(Kieser等，2000，Practical Streptomyces Genetics.The JohnInnes Foundation，Norwich，第465页)为阿伯拉霉素抗性基因，可在大肠杆菌与链霉菌中进行筛选，用浅灰色的方框表示。图中黑色粗箭头所示的就是nsdA基因，但是它的中部从229到1099碱基处的区域被一个包含阿伯拉霉素抗性基因aac(3)IV的区域置换了。在aac(3)IV两端有两个与天蓝色链霉菌基因组同源的区域，它们分别有2.1kb和1.1kb，这两个区域用于质粒pHZ2718与天蓝色链霉菌染色体DNA进行同源重组，如果在这两段序列上分别发生一次同源重组，天蓝色链霉菌染色体DNA上的nsdA基因就会被质粒pHZ2718上的阿伯拉霉素抗性基因aac(3)IV所置换，这样天蓝色链霉菌染色体DNA上的nsdA基因就得到了破坏，并且可用只具有阿伯拉霉素抗性的特性来筛选nsdA基因得到了破坏的天蓝色链霉菌菌株。pHZ2718可以用酶切的方法进行验证，它用BamHI酶切可得到1.7kb+9.86kb的带型，用EcoRI酶切可以得到6.47kb+5.09kb的带型。
在本实施例中以下是应用到的一些培养基的组成(包含一些单项的制备方法)LB培养基配方(培养大肠杆菌，液态)胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 5g，加蒸馏水至1000ml，pH7.0。于121℃灭菌30分钟。
LA培养基配方(培养大肠杆菌，固态)胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 5g，琼脂15g，加蒸馏水至1000ml，pH7.0。于121℃灭菌30分钟。
大肠杆菌培养方法在LB培养基中，37℃摇床，200转/分钟，过夜。
大肠杆菌质粒抽提方法离心收集5ml大肠杆菌过夜培养物，将适量菌体悬浮于150μl的溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl，10mM EDTA，pH8.0)中，加入300μl溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)立即振荡混合均匀，然后加入230μl溶液III(3.0mol/L乙酸钾，pH4.8)混合均匀，12000转/分钟离心10min，上清液中加入1倍体积的异丙醇沉淀5分钟(或2.2倍体积无水乙醇沉淀1小时)，12000转/分钟离心8min，用70％乙醇洗涤沉淀两次，干燥后加一定量的无菌去离子水溶解。
限制性内切酶的酶切反应方法限制性内切酶酶切反应的体系为质粒DNA 0.5～2μg，10×酶切缓冲液2μl，限制性内切酶5单位，去离子水加到30μl，总体系为30μl。反应条件为37℃，5小时。
DNA的琼脂糖凝胶电泳分析方法将2μl DNA水溶液与0.5μl上样液(0.25％溴酚蓝，40％蔗糖)混合，用移液器(购自Gilson公司)将其加入到0.8％的琼脂糖凝胶(0.8克琼脂糖溶于100ml水中，在微波炉中加热，使其完全融化，然后在倒胶板中倒出)胶孔中，电泳缓冲液为1×TAE(0.04Mol Tris-乙酸，0.02Mol EDTA)，电泳电压为5V/cm，时间为1小时。将电泳完毕的凝胶放入EB溶液(2.5mg/L溴化乙锭)中处理10分钟，然后在凝胶成像系统(购自Kodak公司)中进行分析。
DNA的琼脂糖凝胶回收方法DNA的琼脂糖凝胶回收使用杭州维洁公司的试剂盒，回收方法如下，其中DE-A，DE-B，DNA制备管，W1溶液，W2溶液，洗脱液均为试剂盒中提供。
(a)将需要回收的DNA溶液进行琼脂糖凝胶电泳，在长波紫外灯下切下含有目标DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸干凝胶表面的液体并切碎。计算凝胶的重量，该重量作为一个凝胶体积(如100mg相当于凝胶体积100μl)；(b)根据凝胶的浓度，加3个凝胶体积的DE-A溶液，混匀后于75℃加热，(低熔点琼脂糖凝胶于45℃加热)，间断时间混合均匀，直到凝胶熔化(6～8分钟)；(c)加0.5个DE-A体积的DE-B溶液，混匀，当分离的DNA片段小与400bp时，加入异丙醇至终浓度为20％；(d)吸取3中的混合液，转移到DNA制备管，3600转/分钟离心1分钟。如制备管中有残留，适当提高速度，再离心1分钟，去滤液；(e)将制备管置回离心管，加0.5ml W1溶液，3600转/分钟离心30秒，弃滤液；(f)将制备管置回离心管，加0.7ml W2溶液，3600转/分钟离心30秒，弃滤液，重复一次；(g)将制备管置回离心管，最高速度离心1分钟；(h)将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在DNA制备膜正中央加25μl水或洗脱液，室温静置1分钟。以12000转/分钟离心1分钟洗脱DNA。
酶连反应方法T4DNA连接酶及连接缓冲液购自promega公司，酶连反应的体系为载体DNA 500ng，外源DNA 1000ng，T4DNA连接缓冲液1μl，T4DNA连接酶0.5μl，去离子水补足到10μl。反应条件为16℃，8小时。
大肠杆菌感受态的制备(CaCl2法)及转化方法从-70℃保存的菌种管中接种DH5α(或其它受体菌)在LA平板上划线。过夜培养后，挑取单菌落接种于5ml LB中，过夜培养。接种0.5ml过夜培养物于50ml添加20mM MgCl2的LB中，于37℃摇床培养2～3小时，至OD600＝0.5～0.8之间。将培养物置于冰中冷却10分钟(从此细胞应一直保持在0～4℃条件下)，将培养物倒入预冷的塑料管中，用冷冻离心机3000转/分钟离心4分钟。弃上清，加入1ml预冷的0.1mol/L的CaCl2，在冰上轻轻打散沉淀，再加入9ml CaCl2。冰上放置20分钟后，再用冷冻离心机3000转/分钟离心4分钟，弃上清，用1ml预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬浮。细胞即可贮存于冰上2～3天或立即用于转化。转化时，在插于冰上的1.5ml的离心管中加入100μl感受态细胞，每管加入5～10μl DNA溶液，轻弹混匀，冰上放置20分钟，42℃热激90秒，加入150μl LB，37℃恒温静置培养90分钟。吸出全部菌液涂布选择性培养基(含有抗生素的LA培养基)。37℃培养过夜即可见转化子出现(如果转化质粒，可减少DNA和感受态细胞用量，或涂布少量菌液)。
1.2)将重组载体pHZ2718通过接合转移的方法导入野生型天蓝色链霉菌菌株M145中将由第5.1.1得到的pHZ2718质粒转化含有pUZ8002质粒(夏焕章，吴胜，2002，黑暗链霉菌DNA转移系统的建立。微生物学报，42(2)181-185)的大肠杆菌ET12567感受态，得到含有pHZ2718和pUZ8002两个质粒的大肠杆菌ET12567菌株。将此菌株与天蓝色链霉菌M145进行接合转移。得到含有pHZ2718质粒的天蓝色链霉菌菌株。
MS培养基配方(用于接合转移和链霉菌的培养)
琼脂15g，甘露醇20g，黄豆饼粉100g，蒸馏水1000ml，pH7.2～7.3。
先将100g黄豆饼粉用蒸馏水煮2-3小时，8层纱布过滤，收集滤汁补加水至1000ml，分装到预先乘有琼脂和甘露醇的三角瓶中，121℃高压灭菌30分钟。
2×YT培养基配方(用于接合转移)胰蛋白胨16g，酵母抽提物10g，NaCl 5g，加蒸馏水至1000ml，pH7.0。于121℃灭菌30分钟。大肠杆菌和链霉菌的两亲本属间接合转移方法(a)将含有pHZ2718和pUZ8002两个质粒的大肠杆菌ET12567菌株接种于5ml LB培养基(含有50μg/ml卡那霉素、25μg/ml氯霉素和100μg/ml氨苄青霉素)中，37℃培养过夜；(b)按1∶100的比例将过夜培养物接种于含有50μg/ml卡那霉素、25μg/ml氯霉素和100μg/ml氨苄青霉素的5ml新鲜LB中，于37℃继续培养至OD600＝0.4～0.6；(c)将培养物在3000转/分钟离心3分钟，去掉上清，用5ml的新鲜LB培养基悬浮大肠杆菌细胞；(d)重复(c)；(e)将大肠杆菌悬液在3000转/分钟离心3分钟，去掉上清，用0.5ml的新鲜LB培养基悬浮大肠杆菌细胞；(f)在洗细胞的同时，可将每次接合转移所需的108链霉菌孢子悬浮于500μl 2×YT培养基中，50℃热激10分钟，冷却至室温；(g)将处理好的大肠杆菌和天蓝色链霉菌孢子混和，5000转/分钟离心2分钟，吸去上清，用残留的液体重新悬浮细菌沉淀块，涂布含有10mM MgCl2的MS平板(20ml培养基)；(h)于30℃培养16～20小时后，用含有1000μg/ml萘啶酮酸(购自Sigma公司)和1000μg/ml的阿伯拉霉素(购自Sigma公司)的1ml水溶液均匀覆盖平板表面，在超净工作台上打开平板盖子吹平板15分钟使平板表面干燥；(i)继续置30℃培养2～3天，即可观察接合转移子。
1.3)筛选nsdA基因被破坏了的天蓝色链霉菌将由5.1.2得来的含有pHZ2718质粒的天蓝色链霉菌菌株接种到含有50μg/ml萘啶酮酸的MS培养基上，在30℃培养7天待其产生孢子，将孢子用粘取了20％甘油的无菌棉花棒收集起来，将孢子收集到2ml20％甘油溶液中。稀释得到的孢子到10-5，10-6，10-7，10-8这些不同的稀释度，涂在含有50μg/ml阿伯拉霉素的MS平板上，在30℃培养7天后待这些平板上的菌落产生孢子，选取每个平板上长出100～250个单菌落的平板，将这些单菌落影印到含有10μg/ml硫链丝菌素(购自Sigma公司)的MS培养基上。在30℃培养4天观察，选取在含有10μg/ml硫链丝菌素的MS培养基上没有生长但在影印前的含50μg/ml阿伯拉霉素的MS平板上能生长的菌落，重新接种到含50μg/ml阿伯拉霉素的MS平板上在30℃培养。这些具有阿伯拉霉素抗性但对硫链丝菌素敏感的菌落即是nsdA基因被破坏了的天蓝色链霉菌，将其命名为YX2。
天蓝色链霉菌菌株YX2的一般菌学特征为，革兰氏阳性，丝状细菌，菌落圆形、表面粗糙，菌落生长后期有灰色孢子产生，且有大量蓝色色素产生，好氧，异养型，最适生长温度为30℃，适合的pH值为7.2。
1.4)YX2菌株的Southern杂交验证提取菌株YX2的总DNA，以来自pHP45Ωaac(3)IV的含aac(3)IV的BamHI片段为探针，进行Southern杂交验证，用BamHI酶切质粒pHZ2718和菌株YX2的总DNA都可以杂交出一条1.7kb的带，即aac(3)IV片段，用BclI酶切菌株YX2的总DNA会出现一条5kb的阳性带，用BclI酶切野生型菌株M145的总DNA没有杂交信号。
Southern杂交的方法(更详细的说明请参考《分子克隆实验指南》第二版第九章第四节，基因组DNA的Southern杂交分析，萨姆布鲁克，科学出版社，1996年)(a)琼脂糖凝胶电泳，照相后切去凝胶的多余部分，并将其右下角切去一小块以便以后确定方向，量好凝胶大小。先用脱嘌呤缓冲液(0.25mol/L HCl)处理凝胶15min两次；蒸馏水漂洗凝胶1次；然后用变性缓冲液(0.5mol/L NaOH，1mol/L NaCl)处理凝胶15min两次；蒸馏水漂洗凝胶1次，再用中和缓冲液(1mol/L NH4Ac，20mMol/L NaOH)处理凝胶20min两次。凝胶放置在玻璃板上，点样孔朝下，依次铺上用中和缓冲液浸湿的龙膜，两张中和缓冲液浸湿过的滤纸和一叠吸水纸，再在吸水纸上放一重物(约0.5kg)。印迹时间总DNA≥2h；质粒DNA酶切片段≥1h。印迹完毕取出尼龙膜，有DNA面朝上，置于紫外交联仪中将DNA交联固定在尼龙膜上(一般能量值设为1500，时间30秒～2分钟即可)。
(b)探针标记先在冰上冷却的1.5ml Eppendorf管中依次加入2μl六核苷酸随机引物混合物，3μl dNTP(不含dCTP)混合物，变性的15μl探针DNA和1μl DNA聚合酶I的大片段，1μl[α-32P]dCTP，37℃标记2～20小时。使用前100℃干浴变性10min，冰上冷却后立即使用。
(c)预杂交和杂交在DNA杂交炉(Techne hybridizer HB-1Oven)中进行。配制SBP溶液(Na2HPO446.8g；NaH2PO421.8g；加水至1000ml，调至pH 7.2)，用10ml预杂交液(100ml SBP溶液中加入0.2ml 0.5mol/LEDTA(pH8.0)和7g SDS)65℃预杂交至少1h，然后直接向杂交管中加入已标记好的变性的探针，放回杂交炉65℃杂交过夜。
(d)洗膜及压片在65℃用洗膜液(8ml SBP溶液中加入1g SDS，定容至100ml)洗膜(探针与摸板DNA的同源性较低时，可适当降低洗膜温度)，边洗边检测。洗膜结束后，用滤纸吸干尼龙膜上残余液体，用保鲜膜包好，并将尼龙膜和X光片固定在X光片暗夹中，-70℃放射自显影，视杂交信号的强弱决定何时冲洗X光片。
1.5)YX2产生放线紫红素的定性定量测定及与野生型菌株M145的比较对放线紫红素的定性测定采取下面的方法放线紫红素是有颜色的色素，它在偏碱性的环境下是蓝色的，将M145和YX2菌株接种在MS和R2YE培养基上，在30℃培养，数天后观察M145和YX2菌株的表型(如图3所示)。可以发现，在MS平板上培养5天(图3A)；在平板背面观察，YX2产生大量的蓝色色素放线紫红素但是M145只能少量产生。在R2YE培养基(如后面所述)上，虽然YX2与M145在培养5～6天后都产生较多的放线紫红素，但是YX2的产素要比M145快2天左右。在R2YE平板上培养3天时，YX2菌株比M145菌株产生了更多的放线紫红素(图3B)。
对放线紫红素的定量测定采取下面的方法在SMMS(如后面所述)平板上铺好灭过菌的玻璃纸，然后在玻璃纸上分别接种5×106数量的链霉菌M145和YX2的孢子。在30℃培养，分别在33、60、94、124、166、215小时将玻璃纸上的链霉菌菌体收集下来，每个时间点每种菌株收集6个平板的菌体，其中用3个平板的菌体分别收集在已经称取重量(称为始重)的1.5ml离心管中，然后在50℃烘箱中烘48小时，使其完全干燥，然后称取重量(称为终重)，用终重减去始重得到菌体的干重(以克为单位)。另外3个平板的菌体首先收集在1.5ml离心管中，然后加入1.5ml 1Mol/L的KOH溶液，充分振荡，放置2小时，12000rpm离心3分钟，取上清用分光光度计在640nm测定其光吸收值A640。放线紫红素的摩尔消光系数为25320L/Mol/cm，每克干重菌体产生放线紫红素的计算方法为A640÷25320×1.5÷干重，单位为mMol/g。如图4与表1所示，在生长第60小时，YX2产生的放线紫红素已经开始多于M145菌株，在第124个小时，YX2产生放线紫红素的速度逐渐放慢，此时，YX2产生放线紫红素的量是同时期M145菌株的6.7倍。由此可见，nsdA基因被破坏以后，天蓝色链霉菌的放线紫红素产量提高了。
表1本发明的天蓝色链霉菌YX2产生放线紫红素与野生型链霉菌M145的比较

R2YE培养基(用于培养链霉菌)配方蔗糖103g，K2SO40.25g，MgCl2·6H2O 10.12g，葡萄糖10g，酪蛋白氨基酸(购于BD公司)0.1g，琼脂22g，微量元素溶液*2ml，酵母膏(购于BD公司)5g，蒸馏水1000ml。于114℃灭菌15分钟。*微量元素溶液(每升)ZnCl240mg，FeCl3·6H2O 200mg，CuCl2·2H2O 10mg，MnCl2·4H2O 10mg，Na2B4O7·10H2O10mg，(NH4)6Mo7O24·4H2O 10mg。
灭菌后每100ml上述溶液补加以下无菌溶液0.5％KH2PO41ml，CaCl2·2H2O(5mol/L)0.4ml，5.73％TES(购于sigma公司)缓冲液(pH7.2)10ml，pH7.2。
SMMS培养基(用于培养链霉菌)配方Difco酪蛋白氨基酸2克，TES(购于Sigma公司)5.73克，琼脂15克，蒸馏水1000ml。121℃灭菌30分钟。使用前，每升培养基加入下面试剂1mMol/L NaH2PO4+K2HPO410ml，1Mol/L MgSO44ml，50％葡萄糖14.4ml，微量元素溶液(0.1g/L的下面每种成份ZnSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，MnCl2·4H2O，CaCl2·6H2O，NaCl)1ml。
1.6)YX2产生钙依赖抗生素与次甲基霉素的定性测定及与野生型菌株M145的比较对钙依赖抗生素的定性测定采取下面的方法(a)接种106数量的M145和YX2孢子于SMMS培养基上，在30℃培养2.5天。(b)在平板上倒入含有12.5毫摩CaCl2的DNA培养基(如后面所述)，同时倒不加CaCl2的DNA培养基作为对照平板，培养基凝固后，将3ml软琼脂(如后面所述)与30ul蕈状芽孢杆菌Flugge(Bacillus mycoides Flugge，保存于美国典型培养物保藏中心ATCC，编号为ATCC6462)在LB培养基的过夜培养物混合，覆盖在上面的DNA培养基上。(c)从(a)得到的SMMS培养基上链霉菌菌苔挖取相同面积，将菌块置于从(b)得到的检测平板上，先将平板在4℃放置4小时(有助于增强抑菌效果)，再放到30℃培养10小时可以看到抑菌圈。
如图5A所示，在不加CaCl2的DNA培养基上，M145和YX2都几乎没有抑菌圈产生，或只产生很小的抑菌圈，因为钙依赖抗生素只有在存在钙离子的情况下才能发挥抑菌作用。在加有12.5毫摩CaCl2的DNA培养基上，M145同样几乎没有抑菌圈产生，但是YX2却产生较大的抑菌圈，这说明YX2产生的钙依赖抗生素产量超过了野生型菌株M145的产量。
对次甲基霉素的定性测定采取下面的方法(a)用天蓝色链霉菌菌株J1506(S.D.Bentley等，2004，SCP1，a 356 023bp linear plasmid adapted to the ecology and developmental biology of its host，Streptomyces coelicolor A3(2).，Molecular Microbiology，511615-1628)的孢子(约108)与等量的天蓝色链霉菌菌株YX2孢子混合，涂布在不添加组氨酸和尿嘧啶的MM培养基(如后面所述)上，于30℃培养直到产生孢子(约4-10天)。得到的菌株为YX2/SCP1(SCP1为天蓝色链霉菌的包含次甲基霉素生物合成基因簇的线性质粒，请参考Kieser等，2000，Practical Streptomyces Genetics.The John InnesFoundation，Norwich，第434页)菌株；(b)用菌株J1506的孢子(约108)与等量的M145孢子混合，涂布在不添加组氨酸和尿嘧啶的基本培养基(MM)上，于30℃培养直到产生孢子(约4-10天)。得到的菌株为M145/SCP1菌株；(c)将一定数量的YX2/SCP1孢子(约106)涂布于CM培养基(如后面所述)上在30℃培养3天；(d)将一定数量的M145/SCP1孢子(约106)涂布于CM培养基上，在30℃培养3天；(e)把次甲基霉素敏感的天蓝色链霉菌菌株J1501(Kieser等，2000，Practical Streptomyces Genetics.TheJohn Innes Foundation，Norwich，第423页)孢子(约108cfu)涂布到CM培养基上；(f)从(c)或(d)得到的CM培养物平板中挖取圆柱形、直径约6mm的菌块，放置于从(e)得到的检测平板上，然后放到30℃培养。3天后观察抑菌圈。
DNA培养基(用于钙依赖抗生素的测定)配方4.6g Difco营养琼脂(购自BD公司)，200ml去离子水，pH7，121℃灭菌30分钟。
软琼脂配方Difco营养肉汤粉0.8g，琼脂0.5g，去离子水100ml，pH7，121℃灭菌30分钟。
MM培养基配方L-天冬酰胺0.5g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.2g，FeSO4·7H2O 0.01g，蒸馏水至1000ml，将每250ml溶液分装到装有2.5g琼脂的500ml三角瓶中，121℃灭菌30分钟，使用时每瓶加入50％葡萄糖5ml，调pH至7.2。
CM培养基(用于链霉菌培养)配方KH2PO45g，NaCl 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，胰蛋白胨2g，酵母抽提物1g，酪蛋白氨基酸(购自BD公司)1.5g，酵母核酸水解物(在15ml 1Mol/L的HCl中煮沸2g酵母核酸10分钟，另在15ml 1Mol/L的NaOH中煮沸2g酵母核酸10分钟，将两种溶液混合，调pH到6，在溶液还是热的时用滤纸过滤，用水稀释到40ml)5ml，维生素溶液(核黄素100mg，尼克酰胺100mg，p-氨苯甲酸10mg，维生素B6 50mg，盐酸硫胺素50mg，生物素20mg，去离子水100ml，115℃灭菌10分钟，在培养基pH值调好后再加入)1ml，葡萄糖25g，琼脂15g，去离子水加到1000ml，pH7.2。
实施例2利用中断阿维链霉菌中的nsdA基因提高阿维菌素产量2.1)从阿维链霉菌的总DNA通过PCR克隆包含nsdA基因的片断(a)在25ml YEME培养基(如后面所述)中接种阿维链霉菌NRRL8165，在30℃培养40小时，收集得到的菌丝体，抽提总DNA；(b)以阿维链霉菌NRRL8165的总DNA为模板，用引物5’CAGCCAGTCGTCGGTCAGTT，5，CTCTCCCGCTCGCAGAACGC进行PCR扩增，PCR反应程序为96℃预变性10min；96℃变性1分钟，58℃复性1分钟，72℃延伸9分钟30秒，25个循环；72℃延伸5分钟，4℃结束反应。琼脂糖凝胶电泳检测，得到了5.7kb左右的带；(c)将(b)得到的5.7kb的条带进行琼脂糖凝胶回收，与载体pGEM-T Easy(购于promega公司的AT克隆试剂盒)进行酶连反应；(d)将(c)得到的酶连产物转化DH5α感受态细胞，得到质粒pHL205。
YEME培养基(用于培养链霉菌，液态)配方Difco酵母粉3克，Difco蛋白胨5克，Oxoid麦芽糖3克，蔗糖340克，加蒸馏水至1000ml。114℃灭菌15分钟后，每升培养基补加2.5mol/L的MgCl2·6H2O 2ml，调pH到7.0～7.2。
链霉菌总DNA抽提方法用500μl溶菌酶溶液(配方为2mg/ml溶菌酶，0.3Mol/L蔗糖，25mMol/L Tris(pH8.0)，25mMol/LEDTA(pH8.0)，RNase 50μg/ml)重新悬浮5mg菌丝体，在37℃温育直至细胞成为半透明状。加入500μl 2％SDS，混合振荡约1min直到溶液的粘度显著下降，55℃温育15min，加入0.1倍体积的3Mol/L醋酸钠(自然pH)然后加入150μl中性苯酚/氯仿，混合振荡均匀后，12000rpm离心5min，移取上清液，弃去白色中间层。用中性苯酚/氯仿重复抽提直至看不见(或非常少)中间层为止，最后，加入1倍体积的异丙醇(或2.2倍体积的无水乙醇)，上下颠倒混合直至出现白色絮状DNA沉淀团，用玻棒挑出DNA沉淀团，用70％乙醇洗涤DNA沉淀团两次，最后弃去所有上清液，待乙醇挥发后，用一定量无菌去离子水溶解DNA沉淀。
2.2)包含被破坏了nsdA基因的重组载体pHL214的构建(a)将pIJ773(Gust等，2003，PCR-targeted Streptomyces gene disruption identifies a proteindomain needed for biosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin.Proc.Natl.Acad.Sci.，1001541-1546)用EcoRI和HindIII双酶切，然后通过琼脂糖凝胶回收1.4kb的片段，作为PCR的模板。设计两条引物，一条为5’CAGCGCACAA GTGGTTTCAG GGATGGGGGC GTTCCAGTG ATTCCGGGGATCCGTCGACC，另一条为5’ACCAAGGGGC CCTTGGGTGG CCGGCGGGAC CGGGGGTCA TGTAGGCTGGAGCTGCTTC，用PCR的方法扩增。PCR反应程序为94℃2min；94℃变性45秒，55℃复性45秒，72℃延伸3分钟，循环25次；72℃延伸5分钟；4℃终止反应。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物得到一条1.4kb的条带，将此条带通过琼脂糖凝胶电泳回收。(b)将由5.2.1得到的质粒pHL205转化含有质粒pIJ790(Gust等，2003，PCR-targetedStreptomyces gene disruption identifies a protein domain needed for biosynthesis of thesesquiterpene soil odor geosmin.Proc.Natl.Acad.Sci.，1001541-1546)的大肠杆菌BW25113(Gust等，2003，PCR-targeted Streptomyces gene disruption identifies a protein domain neededfor biosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin.Proc.Natl.Acad.Sci.，1001541-1546)感受态细胞，得到含有pHL205和pIJ790两个质粒的BW25113菌株，用BW25113/pIJ790/pHL205表示。(c)制作由(b)得到的BW25113/pIJ790/pHL205的电转化感受态细胞，用(a)得到的1.4kb的回收片段通过电转化的方法导入BW25113/pIJ790/pHL205细胞中，用含50μg/ml阿伯拉霉素的LA平板作为选择培养基进行筛选，选择转化子。(d)将转化子抽提质粒，然后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有50μg/ml阿伯拉霉素的LA平板筛选，得到的转化子，将转化子命名为pHL209。(e)用PstI酶切pSET152(Bierman等，Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomycesspp.1992，Gene，11643-49)质粒，得到0.8kb的片段，回收该片段与pHJL401(Larson等，1986，The minimal replicon of a streptomyces plasmid produces an ultrahigh level of plamid DNA.Plasmid，15199-209)质粒用PstI酶切的片段连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有100μg/ml氨苄青霉素的LA平板筛选，得到的转化子，将转化子命名为pHL212。(f)将由(d)得来的pHL209用EcoRI酶切，回收5.7kb的片段，与由(e)得来的pHL212用EcoRI酶切并回收得来的片段连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含有100μg/ml氨苄青霉素的LA平板筛选，得到的转化子，将转化子命名为pHL214。
载体pHL214的物理构建图如图6所示，它的大小为12.4kb，它由下面各部分组成tsr，硫链丝菌素抗性基因，用于在链霉菌中选择；bla氨苄青霉素抗性基因，用于在大肠杆菌中的选择；oripUC19大肠杆菌复制起始区。oriSCP2*链霉菌低拷贝质粒SCP2*(Kieser等，2000，Practical Streptomyces Genetics.The John Innes Foundation，Norwich，第258～259页)复制起始位点；oriT，大肠杆菌与链霉菌双亲本接合转移的起始位点。aac(3)IV，阿伯拉霉素抗性基因，可在大肠杆菌与链霉菌中进行筛选。图中所示阿伯拉霉素抗性基因aac(3)IV两端的黑色区域为阿维链霉菌nsdA基因两侧的DNA序列，分别有2.1和2.2kb大小，这两端序列用于质粒pHL214与阿维链霉菌染色体DNA进行同源重组，如果在这两段序列上分别发生一次同源重组，阿维链霉菌染色体DNA上的nsdA基因就会完全被质粒pHL214上的阿伯拉霉素抗性基因aac(3)IV所置换，这样阿维链霉菌染色体DNA上的nsdA基因就得到了破坏，并且可用只具有阿伯拉霉素抗性的特性来筛选nsdA基因得到了破坏的阿维链霉菌菌株。pHL214可以用酶切的方法进行验证，它用PstI酶切可以得到9.5KB+1.7KB+0.8kb+0.4kb的带型，用BamHI酶切7.3kb+3.0kb+2.1kb的带型，用EcoRI酶切可以得到5.7kb+6.7kb的带型。
SOB培养基配方胰蛋白胨20g，酵母抽提物5g，NaCl 0.5g，1M KCl 2.5ml，用蒸馏水定容到1L，121℃灭菌30分钟，用前加2Mol/LMgCl25ml。
SOC培养基配方胰蛋白胨20g，酵母抽提物5g，NaCl 0.5g，1M KCl 2.5ml，用蒸馏水定容到1L，121℃灭菌30分钟，用前加2Mol/L MgCl25ml，50％葡萄糖7.2ml。
BW25113/pIJ790/pHL205的电转化感受态细胞的制作方法(a)从平板上挑取BW25113/pIJ790/pHL205大肠杆菌单菌落接入5ml含25μg/ml氯霉素，100μg/ml氨苄青霉素的SOB-MgSO4(不加MgCl2的SOB培养基中加入MgSO4至20mMol/L)中，30℃摇床培养过夜；(b)取500μl过夜培养物至25ml新鲜的SOB-MgSO4培养基(含25μg/ml氯霉素，100μg/ml氨苄青霉素)中，添加250μl 1Mol/L的阿拉伯糖诱导λ/red重组系统(Gust等，2003，PCR-targeted Streptomycesgene disruption identifies a protein domain needed for biosynthesis of the sesquiterpene soilodor geosmin.Proc.Natl.Acad.Sci.，1001541-1546)；(c)于30℃，200rpm摇床培养3～5小时至OD600nm等于0.4～0.6；(d)将培养物倒入预冷的30ml离心管中，冰上置10分钟(以下步骤细胞温度要保持在0～4℃)；(e)4000rpm 4℃离心5min，弃掉上清；(f)加1ml预冷的10％甘油，在冰上打散沉淀，再加9ml 10％甘油，摇匀。4000rpm 4℃离心5min，弃掉上清；(g)重复上面(f)操作；(h)4000rpm 4℃离心5min，尽量弃去上清，用残留液将细胞打散。(感受态细胞浓度越高电转效果越好)此感受态细胞可以在-80℃冰箱中保存。
将1.4kb的回收片段电转化BW25113/pIJ790/pHL205细胞的方法(a)在预冷的0.2cm的电转化杯(电转化杯在70％乙醇中保存，用前先在无菌环境下用无水乙醇洗一下，再吹干，放冰上预冷。)中混合50μl电转化感受态细胞与1～2μl 1.4kb的回收片段，混匀后立即电击，电击条件200Ω，25μF，2.5kv，电击结果为4.5～4.9毫秒较理想。(b)立即在电转化杯中加1ml预冷的SOC，37℃培养40min。(c)将培养的菌体在4000rpm离心2分钟，去除900μl上清，将剩余的菌体沉淀打散，涂含有50μg/ml阿伯拉霉素的LA平板，37℃过夜培养，得到转化子。
2.3)将重组载体pHL214通过接合转移的方法导入阿维链霉菌NRRL8165中(a)将由第5.2.2得到的pHL214质粒转化含有pUZ8002质粒(夏焕章，吴胜，2002，黑暗链霉菌DNA转移系统的建立。微生物学报，42(2)181-185)的大肠杆菌ET12567感受态，得到含有pHL214和pUZ8002两个质粒的大肠杆菌ET12567菌株。将含有pHL214和pUZ8002两个质粒的大肠杆菌ET12567菌株接种于5ml LB(含有50μg/ml卡那霉素、25μg/ml氯霉素和100μg/ml氨苄青霉素)中，37℃培养过夜；(b)按1∶100的比例将过夜培养物接种于含有50μg/ml卡那霉素、25μg/ml氯霉素和100μg/ml氨苄青霉素的5ml新鲜LB中，于37℃继续培养至OD600＝0.4～0.6；(c)将培养物在3000转/分钟离心3分钟，去掉上清，用5ml的新鲜LB培养基悬浮大肠杆菌细胞；(d)重复(c)；(e)将大肠杆菌悬液在3000转/分钟离心3分钟，去掉上清，用0.5ml的新鲜LB培养基悬浮大肠杆菌细胞；(f)在洗细胞的同时，可将每次接合转移所需的108阿维链霉菌孢子悬浮于5ml 0.05M pH8.0的TES缓冲液中，50℃水浴热激10min，冷却到室温后加入等体积2×孢子预萌发培养基(BD公司酵母抽提物1％，BD公司酪蛋白氨基酸1％，CaCO30.01Mol/L，CaCO3在每次使用前加入)，37℃摇床培养1.5～3.5小时，离心收集孢子并重新悬浮于500μl水或0.05M pH8.0的TES缓冲液中，在振荡器上打散孢子；(g)将处理好的大肠杆菌和链霉菌孢子混和，5000转/分钟离心2分钟，吸去上清，用残留的液体重新悬浮细菌沉淀块，涂布改良的高氏培养基(20ml培养基，配方如后面所述)；(h)于30℃培养16～20小时后，用含有1000μg/ml萘啶酮酸(购自Sigma公司)和1000μg/ml的阿伯拉霉素(购自Sigma公司)的1ml水溶液均匀覆盖平板表面，在超净工作台上打开平板盖子吹平板15分钟使平板表面干燥；(i)继续置30℃培养2～3天，即可观察接合转移子。
改良的高氏培养基(用于大肠杆菌与阿维链霉菌的接合转移)配方可溶性淀粉20g，KNO31g，K2HPO40.5g，MgSO40.5g，FeSO40.01g，NaCl 0.5g，琼脂20g，酵母抽提物2g，蛋白胨4g，葡萄糖1g，蒸馏水1000ml，调pH 7.0～7.2，121℃灭菌30分钟。
2.4)筛选nsdA基因被破坏了的阿维链霉菌将由5.2.3得来的含有pHL214质粒的阿维链霉菌菌株接种到含有50μg/ml萘啶酮酸的MS培养基上，在30℃培养7天待其产生孢子，将孢子用粘取了20％甘油的无菌棉花棒收集起来，将孢子收集到2ml 20％甘油溶液中。稀释得到的孢子到10-5，10-6，10-7，10-8这些不同的稀释度，涂在含有50μg/ml阿伯拉霉素的MS平板上，在30℃培养7天后待这些平板上的菌落产生孢子，选取每个平板上长出100～250个单菌落的平板，将这些单菌落影印到含有10μg/ml硫链丝菌素(购自Sigma公司)的MS培养基上。在30℃培养4天观察，选取在含有10μg/ml硫链丝菌素的MS培养基上没有生长但在影印前的含50μg/ml阿伯拉霉素的MS平板上能生长的菌落，重新接种到含50μg/ml阿伯拉霉素的MS平板上在30℃培养。这些具有阿伯拉霉素抗性但对硫链丝菌素敏感的菌落即是nsdA基因被破坏了的阿维链霉菌，将其命名为WQ5。阿维链霉菌菌株WQ5的一般菌学特征为，革兰氏阳性，丝状细菌，菌落圆形、表面粗糙，菌落生长后期有灰色孢子产生，好氧，异养型，最适生长温度为30℃，适合的pH值为7.2。
2.5)WQ5菌株的PCR验证抽提阿维链霉菌NRRL8165与WQ5的总DNA，用3条引物5’CTCTCCCGCTCGCAGAACGC3’，5’GCAATACGAATGGCGAAAAG3’，5’CAGGCGCCCCAATGAGCTTC3’进行PCR反应，PCR反应条件为94℃预变性5分钟；94℃变性1分钟，55℃复性50秒，72℃延伸3分钟50秒，25个循环；72℃延伸5分钟；4℃结束反应。琼脂糖凝胶电泳检测的结果为，野生型菌株NRRL8165的总DNA能扩增出3.6kb的特征带；nsdA基因被破坏了菌株WQ5的总DNA能扩增出3.0kb的特征带。
2.6)用HPLC测定WQ5产生的阿维菌素及与野生型菌株NRRL8165的比较首先在阿维菌素种子培养基(淀粉30g，酵母粉2.0g，豆饼粉20g，CoCl.6H2O 0.0005g，pH 7.0～7.2，蒸馏水加到1L，121℃灭菌30分钟。)中接种107的阿维链霉菌NRRL8165以及WQ5孢子，在30℃，220rpm培养36小时，然后将培养物2ml接种到30ml阿维菌素发酵培养基(淀粉50g，玉米粉10g，酵母粉10g，豆饼粉10g，CaCO32.0g，CoCl.6H2O 0.0005g，pH7.0～7.2，蒸馏水加到1L，121℃灭菌30分钟。)中，在30℃，220rpm培养3天，得到发酵产物。
取1ml的发酵液，加4ml的甲醇，充分振荡30min后，12000rpm离心5分钟取上清进行HPLC分析，HPLC使用仪器Waters alliance 2690高效液相色谱仪，Waters 2487双波长紫外检测器，515泵，7725进样器，Waters Millenium32工作站。色谱柱，C18(5um，4.6×300mm)，柱号，E1515910流动相，甲醇∶水＝85∶15；流速，1.0ml/min；检验波长，245nm；填料，hypersil DBS。
根据HPLC分析得到的各组份的积分面积，计算WQ5与野生型菌株NRRL816产生的阿维菌素总量的差别。如表2所示，两株WQ5菌株WQ5-1与WQ5-2的积分面积分别是出发菌株NRRL8165的4.9和3.8倍。总的来说，中断菌株总的阿维菌素产量与出发菌株相比提高到4.4倍(标准差为0.78倍)。
表2本发明的阿维链霉菌WQ5与野生型菌株NRRL816产生的阿维菌素总量的比较

权利要求
1.一种提高链霉菌抗生素产量的方法，其步骤是(a)从链霉菌的基因组文库筛选出含有nsdA基因的克隆，得到含有nsdA基因片段的重组载体；(b)构建nsdA基因被破坏了的重组载体；(c)通过接合转移将(b)步骤得到的重组载体转移到链霉菌中；(d)抗性筛选得到nsdA基因被破坏了的链霉菌菌株；(e)采用Southern杂交，验证(d)步骤得到的链霉菌菌株；(f)测定(e)步骤得到的链霉菌菌株的产抗生素的能力，得到抗生素高产的链霉菌菌株。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的链霉菌是天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)。
3.权利要求1所述的方法，其中(b)步骤中构建的nsdA基因被破坏了的重组载体是pHZ2718。
4.一种提高链霉菌抗生素产量的方法，其步骤是(a)从链霉菌的总DNA中通过PCR的方法将含有nsdA基因的片段克隆下来，得到含有nsdA基因片段的重组载体；(b)构建nsdA基因被破坏了的重组载体；(c)通过接合转移将(b)步骤得到的重组载体转移到链霉菌中；(d)通过抗性筛选，筛选出nsdA基因被破坏了的链霉菌；(e)通过PCR验证(d)步骤得到的链霉菌菌株；(f)测定(e)步骤得到的链霉菌菌株的产抗生素的能力，得到抗生素高产的链霉菌菌株。
5.权利要求4所述的方法，其中所述的链霉菌是阿维链霉菌(Streptomyes avermitilis)。
6.权利要求4所述的方法，其中(b)步骤中构建的nsdA基因被破坏了的重组载体是pHL214。
7.一种天蓝色链霉菌菌株YX2(Streptomyces coelicolor，保藏在CCTCC，保藏编号为CCTCC M205007)。
8.一种阿维链霉菌菌株WQ5(Streptomyesavermitilis，保藏在CCTCC，保藏编号为CCTCCM205008)。
9.权利要求7所述的菌株在提高链霉菌抗生素产量中的应用。
10.权利要求8所述的菌株在提高链霉菌抗生素产量中的应用。
全文摘要
本发明属于链霉菌技术领域，具体地说属于利用分子生物学方法提高链霉菌抗生素产量的方法及其高产链霉菌株的选育。本发明的方法包括从链霉菌的基因组文库或总DNA中将含有nsdA基因的片段克隆下来，得到含有nsdA基因片段的重组载体；构建nsdA基因被破坏了的重组载体；将此载体转移到链霉菌中；通过抗性筛选得到nsdA基因被破坏了的链霉菌菌株；对这些链霉菌菌株进行产抗生素的测定，得到产抗生素的高产菌株。所述的菌株为天蓝色链霉菌和阿维链霉菌，该两菌株及其中间载体均保藏在CCTCC。本发明解决了现有技术存在缺陷，提供了利用基因工程培育高产链霉菌株以及提高链霉菌产抗生素的新途径。
文档编号C12N1/21GK1831134SQ20051001835
公开日2006年9月13日 申请日期2005年3月8日 优先权日2005年3月8日
发明者陶美凤, 应新, 王茜, 李文成, 余贞, 邓子新, 周秀芬 申请人:华中农业大学