表达jev免疫原基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗及其制备方法

专利名称：表达jev免疫原基因的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种表达JEV免疫原基因的重组减毒鼠 伤寒沙门氏菌载体疫苗及其制备方法。
背景技术：
JE (乙型脑炎)也称日本脑炎(Japanese enc印halitis)，是由JEV (日本脑炎病 毒)引起的人和动物共患的一种虫媒病毒性疾病。主要引起母猪出现繁殖障碍如流产、早 产、死胎、木乃伊胎)，也可引起公猪的睾丸急性炎症反应或不育，从而给我国养猪业造成了 巨大的经济损失。JEV属于黄病毒科，黄病毒属，是不分节段的单股正链RNA病毒。基因组长约11Kb， 有单一开放的阅读框，能编码、翻释、加工成3种结构蛋白(囊膜蛋白E、膜蛋白M以及衣壳 蛋白C)和7种非结构蛋白。E糖蛋白是JEV主要的免疫原，可诱发机体产生中和抗体和血 凝抑制抗体，保护机体免受病毒攻击，既可诱导体液免疫，又可诱导细胞免疫，是乙脑病毒 的基因工程疫苗研究首选蛋白。免疫接种是防控猪乙型脑炎的主要措施，目前猪乙型脑炎商品化疫苗主要是灭活 苗和弱毒苗两种传统常规疫苗。JEV弱毒苗具有免疫效果较好、免疫力较坚强、免疫期长等 优点，但弱毒苗对变异较大的异源毒株的攻击所产生的保护非常有限，不能阻止强毒感染， 并且存在散毒及潜在的毒力返强的可能性。许多国家已禁止使用弱毒苗，转而使用灭活苗。 但更多的研究报道结果表明，灭活疫苗虽然安全但是产生的保护力不强，仅有部分保护或 完全无保护作用。同时灭活苗需反复多次的免疫接种，免疫剂量大，成本较高，且灭活苗产 生的保护力多不适应JEV很强的变异性，对异源株免疫效果不理想。因此，研制更安全、高 效、廉价的新型疫苗已成为当今猪乙型脑炎研究领域的热点和重要方向。减毒鼠伤寒沙门氏菌能通过粘附、侵袭、定居在肠道相关淋巴组织，有效地刺激机 体产生粘膜、细胞和体液免疫应答，是携带抗原的良好载体和天然粘膜免疫佐剂，越来越广 泛地应用于疫苗接种。根据共同粘膜免疫理论，以减毒伤寒沙门氏菌为载体制成的口服疫 苗可在口腔、乳腺、生殖道、泪腺等粘膜部位诱发较强的粘膜免疫，且口服接种的方式安全。 特别是近来利用不以抗生素作为选择压力的载体-宿主平衡致死系统构建的减毒鼠伤寒 沙门氏菌载体疫苗已显示出良好的应用前景。

发明内容
本发明提供一种以减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的JEV 口服减毒鼠伤寒沙门氏菌 活载体疫苗，可作为预防猪乙型脑炎感染的口服活载体亚单位疫苗。本发明的提供的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗，其包含JEV结构蛋白E，其 中，上述的抗原亚单位E来源于JEV陕西分离株。本发明还提供一种上述重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗的制备方法，步骤包
3括1)制备E基因。制备方法为用PCR方法扩增了 JEV陕西株E基因，并将其克隆 到pGEM-T easy载体，构建了 pGEM-T-E质粒；2)将上述的E基因，插入到原核表达载体PYA3341的Ptrc启动子下游，构建含JEV 的E基因的重组表达质粒pYA3341-E ；3)将上述重组表达质粒PYA3341-E转入第一中间宿主菌内进扩增，所述的第一中 间宿主菌株优选为大肠杆菌X6212 ；4)将上述重组表达质粒PYA3341-E转入第二中间宿主菌内进行甲基化修饰，获得 经甲基化修饰的重组质粒DNA。作为优选，所述第二中间宿主菌株优选为减毒鼠伤寒沙门氏 菌 X3730 ；5)步骤4)中鉴定正确的甲基化修饰的重组质粒DNA转化终宿主菌株。将步骤4 得到的甲基化修饰的重组质粒DNA通过电转化方法转化终宿主菌株中，诱导表达，得到重 组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗。终宿主菌株优选为减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550，其中所述 的减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550优选为asd基因缺陷型菌株。此外，上述制备方法还包括如下鉴定步骤6)鉴定步骤5)中得到的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗中E的表达；7)通过Western免疫印迹检测，检测步骤5)中得到的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载 体疫苗中E的免疫原性；8)重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗攻毒保护实验；9)在有、无选择压力的情况下进行体外传代培养，鉴定重组减毒鼠伤寒沙门氏菌 载体疫苗稳定性。具体地说，本发明提供一种制备猪乙型脑炎病毒重组活载体疫苗的方法重组 表达质粒转化终末宿主菌X4550后，培养18h，离心收集菌体，测定重组菌的CFU，调整重 组菌的浓度使其达到101(lCFU/ml。可通过口服免疫或加强免疫，口服免疫具体可为约 1 X IO10CFU/只/次，每次间隔1 2周；加强免疫具体可为口服免疫2 4次后间隔一定 时间口服加强免疫一次，这里所述的一定时问视生物体的情况而定，可以为一周或一个月 等。上述的减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550优选为asd基因缺陷型菌株。综上所述，本发明采用平衡-致死系统构建了表达JEV E蛋白的重组减毒鼠伤寒 沙门氏菌载体疫苗株，并且构建的疫苗株无论有无选择压力均能稳定地在体外传代培养， 通过口服疫苗菌株免疫方案免疫小鼠和猪后证明该疫苗具有良好的免疫原性和免疫保护 效果。本发明的优点和积极效果为1)成功构建了重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体PYA3341-E，可在宿主菌中表达JEV 含有病毒中和表位的主要结构蛋白E。本发明的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗具有 下述优点可以口服，免疫者易于接受；能够快速产生抗体，且产生的抗体水平较高；所表 达的靶抗原不需纯化，可直接用于免疫保护试验，免去了蛋白质后处理的复杂工序；价格低 廉；易于生产、储存和运输；可以避免现有技术中表达系统表达目的蛋白分离纯化的繁琐 过程和缺陷例如费时费力，代价昂贵，不能大规模应用于目的蛋白的规模化生产等。2)本发明利用鼠伤寒沙门氏菌是肠道菌得到的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌可刺激小鼠产生有效的体液免疫和细胞免疫，尤其有效地激发粘膜免疫应答；3)该载体-宿主平衡致死系统表达的E蛋白可与JEV抗体发生特异性反应。4)本发明得到的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌对实验动物是安全的，无任何病理现象 出现。5)本发明得到的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌具有很好的体外遗传稳定性，经多次传 代后外源基因不丢失。6)本发明所使用的目的基因为JEV(自陕西分离)国内分离株，从而构建的重组减 毒鼠伤寒沙门氏菌可作为我国预防猪乙型脑炎的口服活载体疫苗。7)将E基因克隆入原核表达载体而不是真核表达载体，降低了操作难度，提高了 表达水平，制备方法易于大规模生产。


图1是重组表达质粒pYA3341-E构建流程图；图2是JEV E基因的克隆；图2中标号说明M为DNA分子量标准(Marker)，泳道 1为JEV E基因PCR结果(大约1500bp)。图3是重组表达质粒pYA3341-E经双酶切获得目的基因，表明重组表达质粒构 建成功；图3中标号说明M为DNA分子量标准(Marker)，泳道1为重组重组表达质粒 PYA3341-E经双酶切获得目的基因E经双酶切鉴定结果，泳道2为表达质粒pYA3341经双酶 切鉴定结果；图4是重组表达质粒pYA3341-E PCR鉴定；图4中标号说明M为DNA分子量标准 (Marker)；泳道1为重组质粒pYA3341_E PCR鉴定结果；图5是重组蛋白E的表达的SDS-PAGE分析；图5中标号说明M为蛋白分子量标 准；泳道1为重组鼠伤寒沙门氏菌PYA3341蛋白分析，无53ku的E蛋白表达；泳道2为重组 鼠伤寒沙门氏菌PYA3341-E蛋白分析，表达了 53ku的E蛋白；图6是重组E蛋白的Western blot分析；图6中标号说明泳道1为同JEV阳性血 清反应的重组鼠伤寒沙门氏菌PYA3341-E表达的E蛋白，2为重组鼠伤寒沙门氏菌pYA3341 表达的蛋白与JEV阳性血清不反应(负对照)；图7小鼠脾脏、肠系膜淋巴结、回肠末端免疫荧光检测结果，其中7A为小鼠脾脏阴 性对照(X200)，7B为免疫后小鼠脾脏免疫荧光检测(X200)，7C为小鼠肠系膜淋巴结阴性 对照(X200)，7D为免疫后小鼠肠系膜淋巴结免疫荧光检测(X200)，7E为小鼠回肠末端阴 性对照(X200)，7F为免疫后小鼠回肠末端免疫荧光检测(X200)；图8重组菌的生长曲线；图9免疫小鼠血清抗体水平；图10免疫猪血清抗体水平。
具体实施例方式本发明利用pYA3341的载体-宿主平衡致死系统表达JEV E保护性抗原，构建以 减毒鼠伤寒沙门氏菌为载体的JEV疫苗，并通过动物实验观察重组载体疫苗的免疫原性及 免疫保护性，为发展新型的JEV疫苗提供实验依据。
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本发明用PCR方法扩增了 JEV陕西株E基因(具体序列见SEQ IDN0. 1)，并将其 克隆到pGEM-T easy载体，构建了 pGEM-T-E质粒。酶切pGEM_T_E质粒，回收E基因。将 回收的E插入到表达载体pYA3341的Ptrc启动子下游，构建含JEV的E的重组表达质粒 PYA3341-E ；将构建的重组表达质粒转入宿主-载体平衡致死表达系统感受态大肠杆菌 X6212内，使其进行大量克隆，并用萘啶酮酸进行营养筛选。筛选后的重组质粒再次转入宿 主-载体平衡致死表达系统的中间宿主菌沙门氏菌X3730甲基化修饰，同样用萘啶酮酸进 行营养筛选。筛选的经甲基化修饰的重组质粒最后转入宿主-载体平衡致死表达系统的终 末宿主菌沙门氏菌X4550，萘啶酮酸进行营养筛选。重组表达质粒分别经聚合酶链式反应 (PCR)、酶切鉴定、免疫蛋白印记(western blot)试验进行检测，筛选获得阳性重组表达质 粒菌株；将筛选的阳性重组表达质粒菌株分别免疫BALB/c小鼠和猪并进行了免疫学指标 的检测。本发明所用的减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550具有如下特征其为asd基因缺陷型细 菌，由于asd基因是DAP ( 二氨基庚二酸，革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分)生物合成途径 中必需的酶，该基因的缺失可导致该突变株在无外源性DAP存在的条件下溶菌死亡，从而 高效减毒。减毒鼠伤寒沙门氏菌能表达外源抗原，在哺乳动物中经口、鼻、直肠等粘膜途径 免疫能诱导强大而特异的免疫反应。能够定居在宿主小肠和肠相关淋巴组织，不致病并且 能稳定表达外源基因。所表达的靶抗原不需纯化，可直接用于免疫保护试验，免去了蛋白质 后处理的复杂工序。下面结合具体实施例进一步阐述本发明，这些实施例仅以举例的方式提供，用于 对本发明中的制备方法进行详细描述，以便更容易地理解本发明，应理解的是，这些实施例 仅用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明制备方法的 简单改进，都属于本发明要求保护的范围。下面叙述本发明的具体实施方法实施例1、JEV陕西株E基因的克隆1. 1引物的设计参考发表的JEV SA14标准株(GenBank :U14163)的基因组序列，设计1对特异性 引物(P1/P2)。上游引物 Pl -CCG GAATTCGCATGGGGAATCGGGATTTCATAGAAG-3‘ 5'端加 上 EcoR I 酶切位点。下游引物 P2 5 ‘ -ACGGTCGAC GGCATGCACATTGGTCGCTAAAAAC-3 ‘，5 ‘ 端加上Sal I酶切位点。预期扩增片断为1500bp，含有完整E基因。1. 2病毒基因组的提取取出_80°C保存的JEV陕西分离株细胞毒，按照Trizol提取试剂盒提取病毒RNA。 取 RNA 作模板 3 μ L，加入 E 下游引物 Ρ2 1 μ L、dNTP 4 μ L、RNase-Inhibitor 0. 5 μ L、AMV 0. 5 μ L,5 X AMV Buffer 4 μ L，力口 DEPC H20 至 20 μ L，42°C lh，即得 cDNA 模板；PCR 反应体系如下10 X PCR Buffer 5 μ L、dNTPs 4 μ L、P1/P2 各 1 μ L、Taq DNA 多聚酶 lyL、cDNA 6 μ L、加水至 50 μ L。反应程序95°C变性 5min ;94°C lmin,56°C lmin, 72°C 2.511^11，共30个循环；最后721延伸101^11。反应结束后取1(^1^ PCR产物加入IyL 6XLoading Buffer于0. 8%琼脂糖凝胶电泳，分析扩增产物。1. 3PCR产物的纯化与回收参照上海生工UNIQ-10胶回收试剂盒说明书回收目的基因。
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2.大肠杆菌DH5 α感受态细胞的制备(氯化钙法)以无菌接种环刮取冻存于-80°C冰箱的大肠杆菌DH5ci菌种，划线接种于不含氨 苄青霉素(Amp)的LB琼脂平板，37°C培养16h左右。挑取单一菌落，接种到100ml LB培养 基中，37°C、250r/min振摇培养到0D600 = 0. 4 0. 6，在无菌条件下将细菌培养液转移到 两个无菌并以冰预冷的聚丙烯离心管中(以下操作均需无菌)，冰浴lOmin，使培养物冷却 到 0°C ；4°C、2000r/min 离心 lOmin，弃上清，以 IOml 用冰预冷的 75mmol/L CaC12、IOmmol/ L(pH6. 5)溶液重悬沉淀，冰浴10min,4°C,2000r/min离心lOmin，弃上清，以2ml用冰预冷 的，含 15% ν/ν、)甘油的 75mmol/L CaC12、10mmol/L Tris 'Cl (pH6. 5)溶液重悬每管沉淀， 用无菌吸头将感受态细胞分装于无菌微量离心管中，每管200μ 1 ；标明菌株、体积和日期， 置-80°C冰箱冻存备用。3. E基因片段与pGEM-T easy载体的连接反应取0. 5yg pGEM-T载体，加3 5倍摩尔量的E DNA片段，2 μ 1 5 X连接缓冲液 加水定容至10 μ 1，最后加入1 Weiss单位T4DNA连接酶，混勻并离心，16°C连接1 4h，取 7 μ 1连接反应液转化上述Ε. coli DH5 α感受态细胞。4.转化将适量连接产物DNA (体积质粒< 1 μ 1，连接产物< 10 μ 1，DNA < 50ng)加入 200 μ 1上述感受态细胞中，轻轻混勻，冰浴30min ；42°C水浴热冲击90s，冰浴冷却2min ； 加入200 μ 1 37°C预热的LB培养基，37°C 150r/min振摇培养50min ；取培养液涂布于含 Amp (50 μ g/ml)的LB琼脂平板，37°C培养14 16h后，得到转化菌落。5.质粒的提取(碱裂解法)挑取单个上述转化菌落，接种到2ml含50 μ g/ml Amp的LB培养液(下同)中， 370C 250r/min振摇培养12 16h ；将1. 5ml转入微量离心管中，12000r/min离心30s，弃 上清。以 200 μ 1 冰预冷的溶液 I (50rnmol/L 葡萄糖；25mmol/L Tris 'Cl,pH8. O ； 10mmol/L EDTA，pH8. 0)重悬沉淀，加入200μ 1新配制的溶液11(0. 2mol/L NaOH，1 % SDS)，颠倒数次 混勻，加入200 μ 1用冰预冷的溶液III (3mol KAc, 5mol/L冰乙酸)，颠倒混勻，4°C 12000" min离心lOmin，取上清，分别用等量饱和酚/氯仿/异戊醇(25 24 1)，氯仿/异戊醇 (24 1)各抽提一次；加2倍体积冷无水乙醇，混合均勻，置-20°C 30min，4°C 12000r/min 离心lOmin，弃上清，沉淀用70%冷乙醇洗涤抽干。以20 μ 1含终浓度20 μ g/ml RNA酶(无 DNA 酶)的 TE(10mmol/L Tri s · HC1，ρΗ8· 0，lmmol/L EDTA，ρΗ8· 0，下同)溶解沉淀，并于 37°C水浴中作用30min，琼脂糖凝胶电泳检查或-20°C保存。6.重组质粒pGEMT-E的酶切鉴定 将1. 0 μ g质粒DNA与适量水混勻，使其总体积为18 μ 1，分别加入2 3单位EcoR I和Sal I限制性内切酶及1 μ 1相应的10Χ限制性内切酶反应缓冲液，轻弹管壁混勻并离 心，置最适反应温度水浴2 3h，琼脂糖凝胶电泳检查。酶切结果均与预计完全相同者，即 为目的重组质粒。完全酶切后，-20°C保存，以备进一步鉴定或回收片段之用。7.携带JEV E基因重组表达载体质粒的构建用EcoRI和Sal I双酶切pGEMT_E质粒，回收E基因，将其插入到同样经过EcoRI和 Sal I双酶切的表达载体PYA3341，进行连接反应，构建含有E基因的表达载体pYA3341-E。 具体构建过程如下
7. 1 制备 “NA” LB 平板将高压蒸汽灭菌后的LB液体培养基(含1. 5%琼脂粉)置超净台内，待其温度冷 却至50°C左右时加入萘啶酮酸(NA)至终浓度为20 μ g/mL混勻后立即铺制平板。7. 2大肠杆菌X6212感受态细胞的制备(氯化钙法)同大肠杆菌DH5ci感受态细胞的制备方法。7. 3E基因片段与pYA3341载体的连接反应取0. 5 μ g pYA3341载体，力Π 3 5倍摩尔量的E DNA片段，2 μ 1 5 X连接缓冲液 加水定容至10 μ 1，最后加入1 Weiss单位Τ4 DNA连接酶，混勻并离心，16°C连接1 4h， 取7 μ 1连接反应液转化上述大肠杆菌Χ6212感受态细胞。7. 4 转化过程与步骤4相同。取培养液涂布于含NA(20 μ g/ml)的LB琼脂平板，37°C培养 14 16h后，得到转化菌落。7. 5质粒的提取(碱裂解法)同步骤5方法7. 6重组质粒pYA3341-E的酶切鉴定将1. 0 μ g质粒DNA与适量水混勻，使其总体积为18 μ 1，分别加入2 3单位EcoR I和Sal I限制性内切酶及1 μ 1相应的IOX限制性内切酶反应缓冲液，轻弹管壁混勻并离 心，置最适反应温度水浴2 3h，琼脂糖凝胶电泳检查。酶切结果均与预计完全相同者，即 为目的重组质粒。完全酶切后，-20°C保存，备用。8.甲基化修饰8. 1中间宿主菌X3730感受态的制备采用电转化法制备减毒鼠伤寒沙门氏菌X3730感受态细胞，整个过程要求在无菌 条件下完成。具体实验步骤如下(1)从-80°C冰箱取出减毒鼠伤寒沙门氏菌X3730，手握解冻，用无菌钼丝直接蘸 取X3730菌种在LB平板(含50 μ g/ml DAP)表面划线接种，37°C恒温倒置培养16 18h ；(2)挑取1个直径约为2 3mm的单菌落接种至4ml LB培养液(含50 μ g/ml DAP) 中，37°C，230r/min恒温振荡培养过夜； (3)按1 100比例将培养物接种至50ml LB培养液(含50 μ g/ml DAP)中，37°C、 230r/min恒温振荡培养2 3h ；(4)取出100 200 μ 1培养物检测0D600，当0D600介于0. 8 1. 0之间时，将 培养物置于冰浴中lOmin，使培养物冷却到0°C ；(5) 40C，5000r/min离心IOmin收集菌体，弃去培养液；(6)用2 5ml 10%的灭菌甘油洗涤后离心，重复3次，用10%的灭菌甘油悬浮细 菌，使细菌数约2X 1010个/ml，100 150 μ 1/管分装，标明菌株、体积和日期，置_80°C冰 箱冻存备用。8. 2pYA3341-E 转化 X3730 感受态(1)取2 3 μ 1 ρΥΑ3341-Ε加入到Χ3730感受态细菌中，混勻；(2)将混合液立即转移到预冷的0. 2cm电转化杯中，吸干电转杯外面水迹，然后放 入电转仪样品槽中；
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(3)转化条件Cuvette Gap 0. 2cm, Voltage 2. 5kV, Field Strengh 12. 5kV/cm, Capacitor 25 Uf, Resistor 200 Ω , Time Constant 4.5 5. Omsec ;(4)电击后，马上取出电转杯，迅速加入37°C预热的SOC培养基中(含50 μ g/ml DAP)，并将菌液转移到无菌的印pendorf管中；(5) 370C、120r/min振摇培养45 60min，取100 150 μ 1菌液涂布于LB固体培 养基(含20μ g/ml ΝΑ)表面，将平板正放于37°C培养箱中，待培养液完全被吸收后，倒置培 养16 18h ；(6)从筛选出的含有重组质粒PYA3341-E的阳性菌X3730中提取出质粒。8. 3获得甲基化的重组质粒PYA3341-E阳性重组菌的鉴定因重组沙门菌中质粒拷贝数较低，利用PCR法进行鉴定，将PCR鉴定正确的重组子 电转入终宿主菌X4550中，方法同前，并经PCR方法和双酶切鉴定，具体方法同前述方法。9.构建口服活载体疫苗菌株9. 1终末宿主菌X4550感受态细胞的制备(电转化法)同8. 1方法中间宿主菌X3730制备方法9. 2甲基化重组质粒pYA3341-E转化X4550中间宿主菌X3730的转化方法同8. 2方法。同法构建空质粒菌X4550 (pYA3341) 作为阴性对照。9. 3阳性重组菌的鉴定因重组沙门菌中质粒拷贝数较低，利用PCR法进行鉴定，将PCR鉴定正确的重组子 电转入终宿主菌X4550中，方法同前，并经PCR方法和双酶切鉴定，具体方法同前述方法。10.重组工程菌的诱导将重组工程菌接种于3ml LB培养液中，37°C摇床培养过夜。次日将过夜培养的重 组工程菌按的比例转种于20ml LB培养液中，37°C摇床培养(200r/分钟)待0D_ = 0. 8时，加入IPTG至终浓度为lmmol/L开始诱导，于诱导后4小时取样并测定其0D600值， 同时作空载体菌诱导对照。实施例2、SDS-PAGE检测JEV E蛋白的表达重组菌X4550 (pYA3341-E)和空质粒菌 X4550 (pYA3341)分别接种于含 20 μ g/ml NA的LB液体培养基中37°C振摇18h后，离心弃上清，收集菌体，加0. 01M(pH7. 2) PBS溶液重 悬菌体后，加5 X蛋白上样Buffer，煮沸15min，离心收集上清，于12 %凝胶进行SDS-PAGE 电泳。配制SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶，待凝胶完全聚合后，拔出上样梳，用阴级缓冲液清洗 上样孔并用滤纸吸干孔内水分。待测样本与蛋白分子量标准同时上样，当考马斯亮蓝到达 凝胶底部时停止电泳。凝胶于固定液中固定30 60分钟，考马斯亮蓝加热至60°C染色20 分钟，脱色液脱色至背景无色。UVP扫描分析电泳结果。实验结果发现，SDS-PAGE电泳显示E基因在重组沙门氏菌X4550中有较高水平的 表达，有分子质量约为53ku的目的蛋白条带出现，与预期的去掉信号肽E蛋白分子量一致， 而对照组菌未出现该蛋白条带(图5)。该实验结果证明了重组沙门氏菌X4550(pYA3341-E) 中能够表达E蛋白。实施例3、Western免疫印迹检测E蛋白的免疫反应性按照上述方法先进行SDS-PAGE电泳，经SDS-PAGE分离蛋白后，将其电转移至PVDF膜上。5%脱脂奶粉或3%牛血清白蛋白缓冲液(10mmol/L Tri s Cl，pH7. 5，150mmol/ L NaCl，0. 05% Tween20)37°C封闭 2h，洗涤缓冲液(10mmol/L Tris · Cl ρΗ7· 5，150mmol/ L NaCl，0. 05 % Tween20)洗涤3次，每次10 15min，将猪抗JEV阳性血清用封闭缓冲 液稀释(1 300)覆盖膜上，室温感作2h，洗涤3 5次，辣根过氧化物酶标记的羊抗猪 IgG(l 2000)室温感作2h，洗涤3 5次后，每次10 15min，最后用蒸馏水清洗一次，夹 出PVDF膜稍晾干，配制ECL (enhanced chemiluminescence)工作液，在可见光下室温孵育 膜数分钟，将印迹膜用保鲜膜包被粘贴固定于X光片曝光暗盒。然后转入暗室将X光胶片 压在膜上曝光数秒到数分钟，显影定影后蛋白质条带可清晰显示在X光胶片上。Western blot结果显示，在53ku处位置上有相应的蛋白条带(图6)，证明了重组 沙门氏菌X4550 (pYA3341-E)中表达的E蛋白能很好地与JEV阳性血清特异性结合。实施例4、重组菌体外稳定性试验将37°C振荡培养过夜的菌体按10%接种于含50yg/ml DAP的LB培养基中，继续 培养12h，将上述培养物再按10%量接种于含50μ g/ml DAP的LB液体中培养12h，如此连 续培养四代至50h，相当于菌体传代100代。将培养物稀释IO6倍，取100 μ 1稀释液涂含 50 μ g/ml DAP的LB琼脂平板，过夜培养后，随机挑选100个单菌落，转种在DAP-的LB琼脂 平板上，如果质粒丢失，细菌不会在DAP-的LB琼脂平板上生长，以此测定重组质粒的稳定 性。随机挑取20个菌落重培养，且进行PCR和酶切鉴定，以确定外源基因在鼠伤寒沙门氏 菌宿主表达的稳定性。稳定性分析结果显示，两种重组菌中有选择压力组的各100个菌株，在不含DAP的 平皿上生长的菌落数都为100个。各随机挑取20个菌落提取质粒，显示100%含有重组质 粒。在无选择压力组，重组X4550(pYA3341-E)和X4550 (pYA3341)菌传代后所挑取的100 个菌落，在不含DAP的平皿上仅分别生长86和85个菌落，表明DAP非依赖性细菌占86% 和85%。从中随机挑取20个菌落提取质粒，显示分别有16和15个含有重组质粒，DAP非 依赖性细菌重组质粒的阳性率分别为80%和75%。上述实验结果说明依赖asd基因的宿主质粒平衡致死系统保护的重组减毒沙门 氏菌质粒在体外不丢失，在体外能稳定传代。实施例5、重组菌生长曲线的测定挑取单克隆X4550 (pYA3341-E)和 X4550 (pYA3341)分别接种于含 20 μ g/ml NA 的 LB液体培养基中，37°C振荡培养IOh后，取50 μ 1接种于5ml含20 μ g/ml LB液体培养基 中，37°C振荡培养，每隔Ih测定0D600值，绘制两种菌的生长曲线。重组菌生长曲线的测定结果如图8，从图8可以看出两种重组菌在接种3h后细菌 呈对数生长，在12h以后0D600nm值开始稳定。重组菌生长曲线的测定结果表明，两种菌的生长状态基本一致，即表示在减毒鼠 伤寒沙门氏菌中转入重组质粒，不影响该菌的生长。实施例6、重组菌的安全性试验重组菌的安全性，通过BALB/c小鼠口服不同剂量来确定。取BALB/c小鼠各27只， 分为3组，其中2组分别口服两种重组菌1 X IO12Cfu/只，阴性对照组口服等体积PBS溶液， 观察小鼠口服菌株后的反应及成活率。试验结果，BALB/c小鼠 口服重组菌X4550 (pYA3341_E)和
10X4550(pYA3341) 1.0 X IO12Cfu 30d后，存活率仍为100%。与PBS对照组相比较，体重变化 无明显差别，且无活动异常等不良反应。由此可见，重组菌株对小鼠是安全的。实施例7、重组疫苗株口服免疫后在小鼠脾、肠系膜淋巴结、回肠末端定植的检测重组菌经LB培养液培养后，用灭菌生理盐水洗涤1次，重悬于灭菌生理盐水中，以 每只5 X IO9CFU活菌液口服免疫BALB/c雌性小鼠。免疫后随机分为6组，每组5只，于免 疫后第2、7、14、21、28和35日各取1组，无菌取小肠、肠系膜淋巴结和脾脏，研磨后分别涂 于含20 μ g/ml萘啶酮酸的LB平板上，37°C培养18h，菌落计数，统计分析。取疫苗免疫后的 小鼠脾、肠系膜淋巴结和回肠末端进行沙门氏菌免疫荧光检测。实验结果表明，口服免疫后第2日，肠系膜淋巴结和脾脏定居的重组菌尚较少，随 后渐增多，至第28日肠系膜淋巴结测不到定居的重组疫苗菌，脾脏于第35日也测不到重组 疫苗菌(参见表1)。由此可见，该重组疫苗能较持续在体内存活28天左右，这有利于持久刺 激机体的免疫应答。免疫荧光染色结果表明，重组菌X4550(pYA3341-E)免疫组小鼠脾脏、 肠系膜淋巴结和小肠可以看到较强的荧光，重组菌X4550(pYA3341)免疫组小鼠脾脏、肠系 膜淋巴结和小肠切片没有荧光(图7)，该现象证明重组菌定居在小鼠脾脏、肠系膜淋巴结 和小肠中，并表达出E蛋白。表1重组菌X4550(pYA3341_E) 口服免疫后在不同组织内的定居
.7±2.564413.4±26.03>1000>1000121.3 土 22.450实施例8、重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550 (pYA3341_E)小鼠免疫试验1、免疫小鼠BALB/c雌性小鼠15只，体重18 20g，随机分3组，采取口服免疫方式。小 鼠口服接种前，禁食过夜，禁水4 6h。先用10 %的NaHC03溶液100 μ 1灌胃以中和 胃酸，30min后分别灌胃免疫X4550 (pYA3341_E)菌液、X4550 (pYA3341)菌液及PBS各 100 μ KlX 109cfu/100 μ 1菌液)，上述3组均免疫二次，间隔14天。2、T淋巴细胞增值试验(1)脾细胞的制备颈椎脱臼处死小鼠，无菌条件下取出脾脏，置于盛有RPMI 1640培养基的平皿中，用玻片研磨，200目尼龙网过滤制成单细胞悬液，1500r/min，离心 5min,弃上清。用Hank，s液离心洗细胞两次，重悬于含10% NBS的RPMI 1640培养液中， 计数，调至2 X IO6个/ml备用。(2)在96孔板中每孔加入淋巴细胞悬液100 μ 1，对应孔中分别加入特异性刺激原 ConAdO μ g/ml) 100 μ 1作为阳性对照组，20 μ g/ml纯化JEV病毒特异性刺激原100 μ 1为 试验组以及1640培养基100 μ 1为非刺激抗原孔，不同刺激原重复3个孔；一只加200 μ 1 1640培养基无淋巴细胞的孔作为本底。
(3)68h后，每孔加入MTT(5mg/ml)20l·! 1，避光培养4h ；每孔吸弃100 μ 1培养液， 再加入DMSO 100 μ 1, IOmin内用酶联免疫检测仪630nm测定个孔OD值。(4)结果计算SI =(特异刺激原的平均OD值-本底值)/(非刺激原的平均OD 值_本底值)实验结果，以刺激组A值/未刺激组A值表示各组的刺激指数(Si，表3)，将平 均值记入表2，SPSS软件分析结果显示，X4550(pYA3341-E)免疫组的SI值与PBS组和 X4550(pYA3341)免疫组均有显著性差异(P < 0. 05)。该结果证明X4550(pYA3341_E)疫苗株能诱导动物体产生细胞免疫应答，具有良 好的细胞免疫效果。表2T淋巴细胞增殖反应刺激指数 3、ELISA测定免疫小鼠血清中抗JEV IgG抗体ELISA试剂盒中的包被抗原为灭活的JEV全病毒，二抗为辣根过氧化物酶标记的 羊抗鼠IgG抗体。在酶联免疫仪492nm/630nm测量各孔OD值，以P/N > 2. 1判为阳性。小鼠口服免疫后各组抗体水平结果统计分析见图9。结果显示，口服免疫 X4550(pYA3341-E)小鼠在免疫后产生抗E特异抗体，且抗体水平逐步上升，在二免后 4周抗体水平达到最高，抗体效价可达到1 1250左右，二免后6周抗体水有所下降。 X4550(pYA3341)免疫对照组和PBS非免疫对照组的抗体水平没有明显的变化。上述结果证明X4550(pYA3341_E)疫苗株能诱导动物体产生相应的抗体，具有非 常好的免疫效果。4、血清中和试验采用固定病毒稀释血清的方法，JEV用200个TCID5Q/50 μ L，血清作连续2倍倍比 稀释。同时设定阴性、阳性血清以及正常细胞对照。中和试验的结果以不产生细胞病变的 血清最高稀释度作为该份血清的中和抗体效价。试验结果表明，重组菌X4550(pYA3341_E)免疫小鼠的血清中和滴度为1 16，重 组菌X4550 (pYA3341)免疫组和PBS空白组小鼠血清没有中和活性，各个血清中和活性结果 见表3。表3血清抗体的中和活性检测结果
12 实施例9、重组减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550(pYA3341_E)免疫猪试验1重组菌 X4550(pYA3341-E)和 X4550 (pYA3341)的大量制备挑取1个的单菌落接种至4ml LB液体培养基(含20 μ g/ml ΝΑ)中，37°C、230r/ min恒温振荡培养过夜；各按1 100比例将培养物接种至50ml LB液体培养基(含20 μ g/ ml ΝΑ)中，37°C、230r/min恒温振荡培养3 4h ；各按1 100比例将培养物接种至IOOOml LB液体培养基(含20 μ g/ml ΝΑ)中，37°C、230r/min恒温振荡培养15 16h ；4°C，5000" min离心IOmin收集菌体，弃去培养液；用IOOml灭菌PBS重悬沉淀，使细菌数约IOltlCfu/ ml ο2实验动物的分组与口服接种将试验猪随机分为三组，每组5头，各组实验猪口服免疫，免疫方法如下猪口服 接种前，禁食过夜，禁水4 6h，免疫前先用10%的NaHC03溶液IOOml灌胃以中和胃酸， 30min后分别灌胃免疫大量制备的X4550 (pYA3341_E)菌液、X4550 (pYA3341)菌液和PBS各 50ml (1 2X10ncfu/50ml菌液)，2次免疫时间间隔14天。18. 3实验猪血清中抗JEV E抗体水平的检测间接ELISA法测定血清抗体的OD49tl值。ELISA试剂盒中的包被抗原为灭活的JEV 全病毒，二抗为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG抗体(1 3000稀释)。分别于每次免疫 后2周自前腔静脉采血并分离血清。用间接ELISA方法检测实验猪血清抗E抗体效价，以 待检猪血清OD49c/阴性血清OD49tl平均值彡2. 1(P/N> 2. 1)判定为阳性，同组不同个体之间 取几何均数为本组实验猪抗体的平均效价。猪口服免疫后各组抗体水平结果统计分析见图9。结果显示，口服免疫 X4550(pYA3341-E)猪在免疫后产生抗E特异抗体，且抗体水平逐步上升，在二免后4 周抗体水平达到最高，抗体效价可达到1 250左右，二免后6周抗体水有所下降。 X4550(pYA3341)免疫对照组和PBS非免疫对照组的抗体水平没有明显的变化。该实验结果证明X4550(pYA3341_E)疫苗株能有效刺激诱导猪体产生相应的抗 体，具有良好的免疫效果。3试验猪攻毒途径和剂量及攻毒后体温变化于二免后6周对猪鼻内接种JEV SX株(1 X 106TCID5Q/0. ImL)，剂量为每头猪5mL。 攻毒后每天观察猪的食欲、精神、消化、呼吸等临床表现，每两天测量直肠温度，观察攻毒后 动物体温的变化。攻毒结果表明，攻毒8天后，PBS免疫对照组有4头对照猪的体温升到41°C以上， 分别达到 41. 4°C、41. 3 °C、41. 5 °C 和 41. 8 °C，X4550 (pYA3341)组有 3 头猪体温达到 41 · 6 °C、 41. 7°C、41. 6°C和41. 7°C，14天以后两组猪的体温都消退到40°C以下。X4550 (pYA3341_E) 免疫组的猪整个过程中体温变化幅度不大。结论X4550 (pYA3341_E)免疫组猪能抵抗JEV野毒的攻击，体温表现正常。4攻毒后免疫猪病毒血症的检测
于攻毒前0天及攻毒后1、2、3、4、5、6周，采集各组猪的前腔静脉血，分离血清，按 照1. 2所述方法提取病毒RNA，用1. 2所述方法针对JEV SX株E的引物对进行RT-PCR，检 测血清中的JEV核酸。试验结果见表4，RT-PCR检测血清中的病毒血症，攻毒后1周在各免疫组和 对照组的血清中皆可检到JEV核酸，X4550 (pYA3341-E)免疫组JEV检出率为30 %， X4550(pYA3341)免疫组和 PBS 免疫组 JEV 检出率分别为 80%和 80%，X4550 (pYA3341_E) 免疫组的JEV检出率明显低于这两个对照组。结论X4550(pYA3341)免疫组攻毒后病毒血症阳性率滴于对照组，说明病毒在这 些免疫动物体内存活数量少，表明X4550 (pYA3341-E)沙门氏菌具有良好的免疫保护作用。表4染猪病毒血症的PCR检测结果 总结获得的重组菌X4550(pYA3341_E)提取基因组后进行PCR扩增，得预期大小的目的 片段。酶切鉴定和测序确证及Western blot检测均为阳性结果，说明构建的重组表达载体 PYA3341-E可表达JEV糖蛋白E囊膜蛋白。重组表达载体pYA3341_E可在减毒鼠伤寒沙门 氏菌的终末宿主菌X4550中表达，且经体外特性试验证实重组表达质粒pYA3341-E具有良 好的体外遗传稳定性；重组菌X4550(pYA3341-E)具有良好的生长特性及安全性。将重组菌 X4550(pYA3341-E)大量扩增后进行小鼠免疫实验，可在免疫小鼠血清中检测到抗JEV的抗 体，表明重组菌X4550 (pYA3341-E)刺激小鼠机体产生了特异性体液免疫。免疫小鼠淋巴细 胞增殖试验结果均显示小鼠产生了特异性细胞免疫。在本属动物猪体内检测的各种免疫学 指标和小鼠检测指标相似。研究结果表明，本发明所构建的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌是一 种安全、有效的口服活载体疫苗，具有开发成为用于预防猪乙型脑炎的疫苗的良好前景。以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范 围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明 的保护范围之内。
权利要求
一种重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗，其特征在于包含JEV E抗原亚单位，且所述重组减毒鼠伤寒沙门氏菌带有如SEQ ID NO.1所示的序列。
2.根据权利要求1所述的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗，其特征在于所述的抗原 亚单位来源于分离陕西株JEV。
3.—种在动物体内产生猪乙型脑炎病毒免疫应答的方法，所述方法包括将权利要求 1-2中任一项所述的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗以口服接种的方式给予动物。
4.根据权利要求3所述的在动物体内产生猪乙型脑炎病毒免疫应答的方法，其特征在 于所述的动物为人工养殖猪或野猪。
5.根据权利要求4所述的在动物体内产生猪乙型脑炎病毒免疫应答的方法，其特征在 于所述的人工养殖猪或野猪为怀孕母猪或断奶仔猪。
6.权利要求1所述的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗在制备预防或治疗猪猪乙型 脑炎疾病的药物中的应用。
7.—种权利要求1所述的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗的制备方法，其特征在于 包括以下步骤1)通过PCR方法获得JEVE基因；2)E基因与原核表达载体pYA3341连接，得到重组表达质粒pYA3341_E。3)重组表达质粒转化第一中间宿主菌株，获得重组子；4)重组子转化第二中间宿主菌株，鉴定阳性重组子；5)步骤4)中鉴定正确的阳性重组子转化终宿主菌株；6)诱导表达，得到重组减毒鼠伤寒沙门氏菌载体疫苗。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于步骤5)中所述的终宿主菌株为asd基 因缺陷型减毒鼠伤寒沙门氏菌X4550。
全文摘要
本发明公开了一种表达JEV免疫原基因的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌重组活载体疫苗及其制备方法和应用。具体地说涉及一种口服减毒鼠伤寒沙门氏菌，所述重组减毒鼠伤寒沙门氏菌带有SEQ ID NO.1所示的序列，该重组细菌能表达JEV囊膜蛋白E。将所述减毒鼠伤寒沙门氏菌接种LB培养基中培养18h，调整细菌浓度为1010CFU/ml，制得一种安全、有效的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗，用于预防猪乙型脑炎。
文档编号C12N15/40GK101926989SQ201010211128
公开日2010年12月29日 申请日期2010年6月29日 优先权日2010年6月29日
发明者张琪, 童德文, 许信刚 申请人:西北农林科技大学