作为治疗剂的肝细胞生长因子模拟物的制作方法

作为治疗剂的肝细胞生长因子模拟物的制作方法
【专利摘要】生成了能够起到模拟物和拮抗剂作用的小分子肽类肝细胞生长因子模拟物。这些分子已经表明或预测对众多疾病具有治疗潜力，包括痴呆、神经变性疾病、糖尿病和代谢综合征、癌症和伤口愈合不良。
【专利说明】作为治疗剂的肝细胞生长因子模拟物
[0001]联邦资助研发声明
[0002]本发明部分地是在美国国立卫生研究院(NIH)授予的编号为MH086032的政府资助下完成的。政府对于本发明拥有一定的权利。[0003]序列表
[0004]本发明包括附后的TXT文档“序列.txt”中的序列表全部内容，创建于2012年4月2日，包含1022字节，均以引用的方式包含在本文中。
[0005]说明书
[0006]总结
【技术领域】
[0007]本发明一般涉及肝细胞生长因子(HGF)模拟物的研发，它可以起到模拟物(兴奋剂)或拮抗剂的作用。模拟物的作用:加强认知功能；作为基本的神经保护/神经再生因子；有利于创伤修复；提高胰岛素敏感性和葡萄糖运输；并减少组织或器官纤维化以防止或逆转痴呆症状，保护机体免于或逆转神经退化性疾病，有利于修复神经系统的损伤，增加组织和器官的血管化，改善受损创伤的愈合，减少或逆转器官中的纤维化改变，例如心脏、肺、肾脏和肝脏。拮抗剂的作用，例如，作为抗血管生成因子和抗癌因子，治疗不同的恶性肿瘤和疾病，例如黄斑变性和糖尿病视网膜病变，它们都和血管过度形成有关。
【背景技术】
[0008]模拟物:
[0009]痴呆:仅美国，就已经有大约一千万人诊断为痴呆，并且这一数字随着人口老化每年都在持续增加。治疗和照顾这些病人的成本年均超过700亿美元，并且处于快速增长中。不幸的是，当前对于痴呆的治疗选项是非常有限的并基本无效的。对这种有着重大需求并且增长迅速的健康问题的治疗手段的缺乏，导致新型和创新性的治疗手段必须尽快开发。
[0010]痴呆病的核心源于神经元中减退的突触连接和内嗅皮层、海马和新(大脑)皮质中的神经元死亡的综合。因此，有效的治疗方法期望能够增加突触连接，保护神经元免于潜在的死亡诱导物，并且刺激从预先存在的神经干细胞库中丢失的神经元的替换。这些临床终端提倡神经营养因子的治疗应用，它可以介导神经发育、神经形成、神经保护和突触发生。不出所料，神经营养因子曾被认为可以作为对多种神经退化性疾病的治疗选项，包括阿尔茨海默病(见文献-Nagahara and Tuszynski, 2011; Calissano et al.，2010)。一个特别吸引人、但常常被忽视的神经营养因子是HGF，它被证明可以同时刺激神经形成(Shang etal.，2011，Wang et al，2011)和突触发生(见下面的初步研究)。HGF的用途可能代表了一种针对痴呆可行的治疗方法，这一认识并不让人惊讶。HGF是一种在多个脑部区域有效的神经营养因子(Kato et al., 2009;Ebens et al.，1996),同时它可以影响多种类型的神经元细胞。
[0011]神经保护/神经再生:HGF和C-Met能够在处于发育阶段和已成年脑部及神经中活跃表达。Met系统对于中枢和周围神经系统的正常起作用是必需的。大量研究表明，HGF和C-Met在脑部多个区域表达，包括额叶皮层、室管膜下层、丘脑、小脑皮质、深灰质和用于认知的重要区域-海马。
[0012]上述生物学活性还表征了 Met在脑部所起的功能，其中HGF/c-Met信号传导是神经营养性的(Honda et al.，1995)和保护性的(Zhang et al., 2000; Takeo et al., 2007 ；Tyndall and ffalikonis, 2007;Takeuchi et al.，2008)。与它在其他组织的活性相似,脑部的Met涉及发育，能够在分化、有丝分裂和神经突生成期间起到导向因子的作用(Ebens etal., 1996; Sun et al., 2002; Tyndall and Walikonis, 2007)。HGF/c-Met 信号传导同样也表明能够促进神经元损伤愈合(Trappal et al.，2008),特别是在局部缺血性脑损伤之后(Takeo et al.，2007)。HGF在神经退化性疾病动物模型中也显示具备神经保护作用，所述疾病包括肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)。HGF的各种功能，加上它高度有效的神经营养活性，促使HGF可以作为治疗神经系统各种疾病的潜在治疗剂。
[0013]肌萎缩性脊髓侧索硬化症=ALS是一种致命的突发性的神经退化性疾病，其特征在于脊髓中的运动神经元和运动皮质及脑干中的传出神经元出现退化。这种退化的影响导致逐步丧失肌肉功能，并最终导致全身瘫痪。大约90%的ALS病例被认为是随机发生的而没有已知致病源，剩余的10%似乎是家族性的，部分源自过氧化物歧化酶I (SODl)中铜/锌的不足，导致夸张的氧化压力和开放性蛋白质反应。各种ALS疾病形式的共同之处是目前均没有有效的治疗方法。
[0014]尽管缺乏有效的治疗选择手段，若干研究已经强调了使用肝细胞生长因子(HGF)作为治疗剂的潜在益处。这些调查表明，在患有家族性ALS疾病的鼠科动物或大鼠模型中应用肝细胞生长因子(HGF)能够显著减慢运动神经元的退化(Aoki et al.，2009);减少助于退化过程的神经胶质增生(Kadoyama et al.，2007);延迟瘫痪的发生(Kadayama etal.，2009);和增加寿命(Sun et al.，2002)。
[0015]HGF的应用可能代表了一种针对ALS可行的治疗方法，然而这一认识是不能预料到的。很早就认识HGF和它的类型I酪氨酸激酶受体c-Met在管状结构发育中的作用(Santos et al.，1993)和它们对于肝细胞和上皮来源的细胞的基本增殖、抗-细胞凋亡、有丝分裂(motogenic)和形态发生中的作用。然而，最相关的是最近认识到HGF在多个脑部区域都是有效的神经营养因子(Maina and Klein, 1993;Kato et al.，2009)和它作为运动神经元的促存活/再生因子是特别有效的(Ebens et al., 1996;Yamamoto etal., 1997;Hayashi et al., 2006;Elsen et al.，2009)。
[0016]帕金森氏病:长久用于治疗很多神经退化性疾病的治疗选择方法是采用生长因子，以期防止疾病恶化，恢复丧失的功能，或者两者兼具，所述神经退化性疾病包括帕金森氏病(PD)(综述，Rangasamy et al.，2010)。然而,这一想法在临床医学水平上大部分尚未实现，因为有和脑部递药有关的限制以及成本问题。生长因子一般是代谢不稳定的大蛋白质分子，并且因为太大而不能通过血脑屏障(BBB)。因此，大部分递送方法是利用基因治疗方法，以期望生长因子能够在正确的位置高浓度长时间表达以提供临床缓解。虽然，在动物模型中已采用了大量创造性的和成功的手段，以期递送生长因子例如⑶NF (Wang etal.，2011)到脑部，但这些方法在技术上是复杂的和令人生畏的，难于在大量病人身上实施。[0017]虽然很多生长因子系统经检测为ro的潜在治疗靶标，但人们主要地、并且我们错误地认为忽视了肝细胞生长因子(HGF)/c-Met (它的类型I酪氨酸激酶-受体)系统。不过，HGF作为H)的治疗方法的潜在应用在Koike et al.，(2006)的一项研究中显示:HGF质粒直接插入到黑质(SN)将导致局部过表达HGF，并能够显著防止神经元细胞死亡和保护6-羟基多巴胺(6-0HDA)帕金森氏病大鼠模型中正常的运动功能。观察到的HGF对多巴胺能(DA)神经元的神经保护效应和它增加多巴胺能神经祖细胞的增殖和迁移作用是相吻合的(Lan et al.，2008)。[0018]然而，对于HGF对黑质纹状体路径的神经保护作用不应该感到惊讶，考虑到它对干细胞的调控作用和管状结构的发育(Santos et al.，1993)和它对于很多细胞类型都有基本增殖、抗-细胞凋亡、有丝分裂和形态发生作用，所述细胞类型包括肝细胞和上皮来源细胞等(Gherardi et al.,1993)。特别相关的是，Maina et al.表明HGF对于多种神经元细胞类型都是有效的神经营养因子(Kato et al，2009)，包括运动神经元(Elsen etal., 2009;Hayashi et al.，2006)、海马神经兀(Lim et al.，2008)、小脑颗粒细胞(Ieraciet al.，2002)和交感神经元(1999)。而且，HGF对于神经干细胞的扩增和分化好像是一个关键调控因子(Nicoleau et al.，2009)，这表明神经细胞和其他多种外周干细胞都处于HGF/c-Met系统的控制之下。
[0019]创伤性脑损伤/脊髓损伤:创伤性脑损伤TBI经常会对认知功能产生负面影响，并引起轻微的情感能力减弱效应或严重的延长的和衰弱的认知功能障碍(Kane et al.,2011)。认知困难和其他神经功能缺损包括焦虑、行为过激、和抑郁会导致生活品质显著下降(Masel和DeWitt，2010)。总结伊拉克和阿富汗持续进行的军事行为，创伤性脑损伤已经成为主要战争伤害，占全部战争伤亡的28%(0kie，2005 ;美国医学，2006年5月，卷42)。在2001年和2010年之间的全部军事服务成员遭受创伤性脑损伤的人数估计为180，000人至320，000人之间(美国国防和老兵脑损伤中心)。
[0020]从根本上讲，TBI是一种脑部损伤，导致神经元突触连接降低，神经元损失和死亡，大脑血管损伤，导致缺血性/含氧量低诱导的损害，以及次级神经胶质损伤。神经元的丧失和突触连接性的减少在海马特别明显(Gao et al., 2011; Zhang et al., 2011a; Zhang etal.，2011b),这导致长期强化(potentiation)的缺陷(Schwarzbach et al.，2006)和认知缺陷(例如Dikmen et al., 2009; Patel et al.，2010)。导致神经元损失和突触连接降低的TBI相关损伤疾病的高发，表明对支持神经修复和/或替代的治疗的需求。这些临床终端提倡利用神经营养因子治疗TBI，它可以介导神经发育，神经形成，神经保护和突触发生。不出所料的是，神经营养因子曾被认为是TBI的治疗选项(Kaplan et al., 2010;Richardsonet al.,2010;Qi et al.，2011)。一个特别吸引人的但常常被忽视的神经营养因子是HGF，它被证明可以同时刺激神经形成(Shang et al., 2011 ;ffang et al, 2011)和突触发生(见下面的初步研究)。事实上，HGF的应用可能代表了一种切实可行的治疗TBI的选择方法，这源自于最近认识到HGF在脑部多个区域都是有效的神经营养因子(Kato et al.，2009; Ebenset al.，1997),并同时影响多种神经兀细胞类型(Yamamoto et al., 1997;Hayashi etal., 2006;Elsent et al.，2009)。
[0021]HGF和伤口愈合:过度创伤的典型特征是由于细胞外基质(ECM)成分的合成和降解之间的不平衡，导致不必要的细胞外基质成分在伤口聚集。病理性创伤的治疗可能直接抑制ECM的合成并促进ECM的降解。在皮肤中的HGF通过以下几种方式有效促进伤口愈合:激发真皮层血管内皮细胞的增殖和流动性；刺激表皮角化细胞的流动性；加强局部血液供应；并加速创伤的再上皮化(Nakanishi et al.，2002)。再上皮化抑制了伤疤形成。研究已经表明，导入HGF基因能够通过刺激血管生成和再上皮化而加速真皮伤口愈合(Nakanishiet al.，2002)。增加HGF/SF的治疗手段可以期望用于促进伤口愈合和阻止伤疤形成。
[0022]HGF作为代谢综合征和糖尿病的治疗方法选项:最近多个研究暗示了 HGF/c-Met系统在葡萄糖处理、胰岛素分泌和组织胰岛素敏感性的调控中起到关键作用。这些调查共同凸显了通过增加HGF/c-Met系统对于治疗2型糖尿病和代谢综合征的治疗潜力(Fafalios et al., 2011 ;Flaquer et al.，2012)。这些研究者已经表明:l)c_Met,作为具有胰岛素受体的HGF受体复合物；2) c-Met关键与肝部葡萄糖稳态有关；3) HGF能够恢复患鼠科糖尿病的大鼠模型的胰岛素响应；4) HGF基因治疗能够防止通常伴随糖尿病的肾损伤；和5) HGF能够改善糖尿病引起的血管并发症(Peng et al.，2011)。
[0023]HGF/c-Met信号通路加强血管生成:血管生成的定义是指在已有血管床中形成新的血管，它在生理过程例如伤口愈合和月经周期中都是基本要求，换句话说，它对于多种病理状况，例如癌症、黄斑变性、粥样硬化、糖尿病视网膜病、新生血管性青光眼、牛皮癣和类风湿性关节炎都是一个必要步骤。因此，不管是通过增强治疗性的血管生成还是通过阻止病理性的血管生成，调控血管生成对于近代医学具有令人振奋的前景。生理性的和病理性之间血管生成的平衡是通过众多内源性血管生成调制剂和抗-血管生成调制剂之间的交流介导的。
[0024]众多研究已经表明HGF是一个强大的形成新生血管的诱导子。而且，HGF/c-Met抑制剂是临床上相关的抗-血管生成剂(Gherardi et al.，2012)。这可能是通过多种途径获得的，通过直接或间接作用于内皮细胞。
[0025]HGF作为抗纤维化因子:纤维化疾病的形式是多种多样的，而且它是导致心脏、肾脏和肝脏衰竭的主要原因，而且也是导致多种病理状态包括心肌梗塞、糖尿病和酒精中毒的次要原因。肝细胞生长 因子(HGF)在多种动物模型中显示出具备强大的抗纤维化效应，它在减轻一系列动物模型的组织纤维化情况中具备显著的效应，HGF展示了显著强大的抗纤维化效应，使得可以减轻多种动物模型和组织的组织纤维化情况(Liu and Yang, 2006)。已经有证据记录了外源性HGF在慢性异源移植肾病的大鼠中的治疗效应，该模型是一种慢性炎症并逐步形成组织疤痕。肌内给药人类HGF基因能够降低死亡率，限制炎症和渗透，并减少肾的纤维化(Liu and Yang, 2006)。
[0026]在西方世界，冠状动脉病(CAD)、局部缺血症和心肌梗塞是导致心力衰竭的主要原因。严重型冠状动脉堵塞和粥样硬化的唯一选择是心脏搭桥手术。在CAD中观察到两种病理事件在CAD的心肌功能丧失中起到主要作用:I)心脏冠状动脉的堵塞会导致灌流到心脏的血液减少；和2)心脏受损后形成的组织纤维化会导致心室重构和顺应性下降。急性心肌梗死之后血液循环中HGF的水平增高已有报道过(Jin et al.，2003)。血液循环中HGF水平的增加可以用来作为心脏受损的生物标记物，并且关于它的保护作用可以提供一定的提示(Ueda et al.，2001)。能够增强HGF/Met信号传导的药物可以潜在地用于治疗心肌梗塞，保护机体免于氧化压力和由于细胞凋亡导致的细胞死亡，以及减少组织纤维化形成(Ahmetet al., 2002;Kondo et al., 2004;Pietronave et al.，2010)。而且，HGF 对于心肌梗塞的另一个有益效果在于它能够诱导新血管形成，这可以支撑形成新的心脏血管并改善心肌的
再灌注。
[0027]虽然已知HGF可以保护肝脏免于外界损伤，但是HGF的形成同样也和若干肝脏和肝外疾病有关。实验和临床证据显示，HGF在肝脏再生中起到关键的作用。肝硬化是纤维化瘢疤形成和肝细胞再生的不可逆的最终结果，是世界范围内导致患病率和死亡率的主要原因，并且没有有效的治疗方法。虽然这种疾病没有特定的致病源，硬化已经定义为肝脏的一种慢性疾病，会扩散肝实质细胞损害和再生，其中结缔组织的分散会导致支气管和血管结构不足(Fujimoto and Kaneda, 1999;Kaibori et al.，2002)。理想的是，治疗肝硬化的手段应该包含减弱纤维发生、增强肝细胞有丝分裂和改善组织结构。
[0028]研究表明，外源性给药重组HGF可以增加肝切除术后肝脏再生的可能性，特别是在肝硬化的情况中(Boros and Miller, 1995;Kaibori et al., 2002;Borowiak etal.，2004)。相反，研究已经表明安妥明相关化合物能够增加HGF/SF的含量，会诱导肝肿大、肝过氧化物酶体增殖和肝癌(Xu and Wu, 1999)。HGF/SF和肝脏疾病之间积极和消极的联系均表明，HGF相关的治疗已成为药剂研发的一个热点。
[0029]直接使用HGF的限制:直接使用HGF或其他任何蛋白神经营养因子作为治疗剂有两种严重的限制:1)大尺寸和亲水的特性阻止了它的血脑屏障透过率(BBB);和2)通过重组方法生产的成本太高，以至于限制了它们的广泛使用。

【发明内容】

[0030]这些障碍可以通过使用本文描述的小分子HGF模拟物的扩展库中的一种或多种而被克服；其中一些是口服有效的，体现了意义深远的促认知/抗痴呆/神经保护活性，而且合成成本低。
[0031]拮抗剂:C-Met受体不适当的活化可以通过遗传性的活化突变、上调转录或通过配体依赖性的自分泌或旁分泌机理而被增强。
[0032]C-Met在癌症中的活化:癌症是一组异质的疾病，其源自基因突变的累积。这些突变会引起原癌基因的功能改变，导致DNA修复、扩增和细胞凋亡信号调节异常(Tannock, 2005)。一组细胞中的信号调控失常会导致难以控制的生长和入侵，入侵包括直接侵入和损坏相邻的组织或通过淋巴系统或血流转移并分布到身体的其他位置。
[0033]Met和HGF系统的功能紊乱可能是众多人类恶性肿瘤的关键特征。在小鼠和人类细胞系中异位过表达的HGF和/或c-Met会导致在没有胸腺的裸鼠中形成肿瘤发生表型和转移性表现型(Rong et al.，1994)。大量研究表明，HGF/c-Met通路是人类恶性肿瘤中失调最严重的通路之一，所述恶性肿瘤包括但不限于，膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠直肠癌、子Hj内膜癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和甲状腺癌(http://www.va1.0rg/met/)。最后,在人类乳头状肾癌中已经发现了一种随机的、遗传形式的c-Met的激活突变(Danilkovitch-Miagkova and Zbar, 2002)。在其他类型的实体瘤和转移性病灶中同样发现了这些激酶区域序列改变的突变。在这一点上，值得一提的是HGF过表达或漏表达(miss-expression)经常和不良预后有关,c-Met或HGF在人类肿瘤细胞的表达下调可以降低它们的致肿瘤性(Abounader et al.，2002)。
[0034]在癌症中Met的激活最经常通过配体自分泌或旁分泌的激活而发生。骨肉瘤和多形性成胶质细胞瘤能够同时表达c-Met和HGF是自分泌控制功能障碍的例子。在其他例子中，旁分泌控制是最重要的，c-Met的过表达在人类原发肿瘤中已经报道过，其中HGF是由基质细胞而不是由肿瘤细胞本身提供的(Houldsworth et al., 1990;Kuniyasu etal., 1992;Hara et al., 1998;Tong et al., 2004;Miller et al, 2006;Bean et al.，2007)。[0035]已经检测的c-Met在其中过表达的瘤的列表正在稳定增加。以恶性肿瘤为例，事实上已在每个恶性肿瘤中发现c-Met的高水平表达(Danilkovitch-Miagkova andZbar, 2002)。受体的过表达会导致局部受体的寡聚化并且在低于配体浓度阈值时产生细胞反应。HGF本身能够引发c-Met的转录(Boccaccio et al.，1994)，因此HGF能够通过基质细胞在整个机体普遍表达，这一般会导致肿瘤过表达c-Met (Aguirre Ghiso et al.,1999 ；Parret al.，2004)。HGF的独特性使得它能在支撑癌细胞生长和新陈代谢的旁分泌正反馈途径中发挥关键作用。有趣的是，这种见解与观察到的c-Met的激活突变需要HGF以加强它们的催化效应是一致的(Michieli et al.，1999)。HGF同样也能以自分泌的方式异常刺激c-Met,正如在恶性胶质瘤(Weidner et al.，1990)、乳腺癌(Potempa andRidley, 1998)、横纹肌肉瘤(Hartmannetal., 1994)和骨肉瘤(Ridleyetal., 1995)中所述。虽然激活的机制是多种多样的，但清楚的是，Met和HGF是大多数人类癌症恶化的主要原因。此外，c-Met和HGF在增殖、入侵、血管生成和抗-细胞凋亡中已证明的活性(Weidneret al., 1990;Rong et al., 1994;Kitamura et al., 2000;Xiao et al.，2001;Wang etal., 2002;Derksen et al.，2003),能够区分这些分子参与了肿瘤发生中的不同阶段。虽然，c-Met用作癌症的一般标记物，它同样也是生物学意义上关于恶性肿瘤和病人预后的指示，它和不良预后的相关性非常高。因此预料能够抑制c-Met和HGF的分子可以干扰多种引起癌症的分子起因，并能够显著帮助减弱。来自Harding实验室的最近研究已经证实，HGF拮抗剂能够潜在地用作有效的抗癌症因子/抗血管生成因子(Yamamoto etal., 2010;Kawas et al., 2011;Kawas et al.，2012)。
[0036]黄斑变性/糖尿病视网膜病:与年龄有关的黄斑变性(ARMD)是在美国60岁以上人群中导致不可逆失明的最常见的原因。预计将有I千万美国人会在退休时期患有一定程度的这种与年龄相关的视力损伤。在正常的健康的眼中，视网膜色素上皮(RPE)细胞会形成一种极化的邻接感光器的单层细胞，并且这些RPE细胞会涉及保证视网膜稳定和视觉功能必须的各种活动。以黄斑变性为例，不幸的是，RPE细胞之间的粘连和交流功能由于炎症而丧失。当炎症发生的时候，RPE细胞能够分泌多种生长因子包括HGF/SF，其能够刺激RPE的分裂和迁移，并能从现存血管中形成新的血管(血管生成)。HGF同样能够刺激产生其他生长因子(例如VEGF)，它能够进一步促进形成新的血管，所述血管能够入侵相邻胞间质(Junet al.，2007)。因此，HGF阻断剂的使用可以用于预防、或者减慢疾病发展和随后导致的视力丧失的治疗方法。
[0037]增殖性糖尿病性视网膜病变(PDR)，使得视网膜中形成明显的新血管，其特征在于血管入侵到玻璃体腔，并伴随围绕增生性管道的出血和瘢疤形成(Katsura et al.，1998)。大量证据表明，一般情况下，特别是PDR情况下，多种生长因子参与新血管形成的开始阶段和发展阶段。这些生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)，血管内皮生长因子(VEGF)和HGF。这些生长因子之中，HGF对内皮生长和促有丝分裂的活性具有最明显的效应(Boulton，1999)。研究已发现，HGF在PDR病人玻璃体腔液体中的水平一般认为是高于非糖尿病患者的水平，同时HGF的水平在PDR病人的活动期是尤其高的(Katsura et al.，1998)。这表明HGF能够刺激或保持TOR中的新血管形成。因此，有理由相信HGF拮抗剂对于预防性治疗或者对于改善PDR的进展会是一种有希望的选择。
【专利附图】

【附图说明】
[0038]图1A、B和C.Dihexa对水迷宫空间学习能力的影响。A:测试开始之前30分钟，直接向大鼠侧脑室(ICV)注射东莨菪碱，10分钟后向ICV注射DihexalO皮摩尔(低剂量)或100皮摩尔(高剂量)。在第一次训练试验之前每天重复该动作。8天内每天有5组试验。找到平台的潜伏期(latency )被认为是学习和记忆能力的衡量标准。接受高剂量Dihexa注射的大鼠能够完全克服东莨菪碱的缺陷，并与对照组没有差异。B:测试开始之前30分钟，直接向大鼠侧脑室(ICV)注射东莨菪碱，10分钟后口服给药Dihexal.25毫克/千克/天(低剂量)或2毫克/千克/天(高剂量)。在第一次训练试验之前每天重复该动作。8天内每天有5组试验。找到平台的潜伏期被认为是学习和记忆能力的衡量标准。接受高剂量Dihexa的大鼠能够完全克服东莨菪碱的缺陷，并与对照组没有差异。C:把性别和年龄(22-26个月)混合的老年大鼠随机分配到对照组/非处理组或Dihexa处理组中(2毫克/千克/天)。大鼠没有经过预筛。注意到一般会有大约50%的老年大鼠表现出缺陷，因而出现大组错误(Large group error)。Dihexa处理组表现的要显著好于非处理的对照组。
[0039]图2A和B.Dihexa和Nle1-AnglV剂量依赖性地刺激树突棘生成(spinogenesis)。A) Dihexa和B) Nle1-AnglV对mRFP- β -肌动蛋白转染的海马神经元以剂量依赖性方式增加树突棘密度。经过5天很宽浓度值范围内的Dihexa或Nle1-AnglV处理，神经元被刺激。培养基固定之后12天；从单独培养基中获得数据。典型的50 μ m树突部分中树突棘的个数采用手动统计。**=ρ〈0.05和#*=p〈0.001 ；η=50 ;平均值土平均数标准误差；ζ =与对照组有显著差异。
[0040]图3Α-Ε.Nle1- AngIV和Dihexa处理过的神经元对于树突棘生成的时间依赖效应。被m-RFP-β -肌动蛋白转染的海马神经元用10_12Μ的Dihexa或Nle1-AngIV在培养基内处理5天，或在体外第12天(DIV12)固定前处理30分钟，以促进树突棘生成。Α)采用媒介物(vehicle)处理5天后的海马神经元的树突树(dendritic arbor)的代表图象。B)采用10_12M的Dihexa刺激5天后的神经元的树突树的代表图象。C)采用10_12M的Nle1-AngIV刺激5天后的神经元的树突树的代表图象。D)代表每种处理情况体外处理5天后每50 μ m树突长度的树突棘的个数的柱形图。*#P〈0.001 ;n=200。E)代表每种处理情况急性处理30分钟后每50 μ m树突长度的树突棘的个数的柱形图。*#P〈0.001 ;n=60。*培养基固定之后12天；从单独培养基中获得数据。通过单因素方差分析和图基(tukey)事后检验法计算平均值土平均数标准误差。
[0041]图4.Nle1-AngIV和Dihexa增加树突棘的头部宽度。测量树突棘头部宽度作为突触强度的一个指示。树突棘的头部有更大的表面积能够接受更多的神经递质受体，也更容易形成功能性突触。AngIV类似物处理引起的树突棘头部宽度的增长表明神经传递得到促进。*#=ρ〈(λ 001 ;平均值土平均数标准误差；η=100。
[0042]图5A-G.Nle1-AngIV和Dihexa刺激的神经元的神经递质模式。Dihexa和Nle1-AngIV处理的神经元采用通用的突触前标记物突触蛋白和谷氨酸能突触前标记物VGLUTl进行免疫染色。测量突触后树突棘(红色)和突触前斑点(绿色)之间的百分比关系作为功能性突触的指示。A)代表采用媒介物、Nle1-AngIV和Dihexa处理之后增加的树突棘个数的柱形图。这能确保神经元中活跃的表型(#*=P〈0.001 ;平均值土平均数标准误差；n=25)。B)代表处理诱导的突触后树突棘占谷氨酸能突触前标记物VGLUTl的百分比关系的柱形图，突触前标记物和突触后树突棘之间的高比例相关性表明了已形成功能性连接(P>0.05 ;平均值土平均数标准误差；n=25)。C)代表采用媒介物、Nle1-AngIV或Dihexa处理之后树突棘个数增加的柱形图，这能确保神经元的健康。D)代表处理诱导的突触后树突棘占一般性突触前标记物突触蛋白的百分比关系的柱形图。在刺激后的神经元和媒介对照处理过的神经元之间没有观察到显著差异(P>0.05 ;平均值+平均数标准误差；n=25)，这表明突触前的多数传入都是谷氨酸能神经元。E)代表采用媒介物、Nle1-AngIV或Dihexa处理之后树突棘个数增加的柱形图，确保活跃的表型(林*=P〈0.001 ;平均值土平均数标准误差；n=25)。F)代表处理诱导的突触后树突棘占突触前标记物PSD-95的百分比关系的柱形图。G)突触后标记物PSD-95与突触后树突棘之间显示没有显著差异(P>0.05 ;平均值土平均数标准误差；n=25)，表明新形成的树突棘具备功能性的突触后成分。
[0043]图6A和B.分离的海马神经元中的微小-兴奋性突触后电流(mEPSCs)。Nle1-AngIV和Dihexa处理增加了微小兴奋性突触后电流(mEPSCs)的频率。在记录前5天采用媒介物、KT12M Nle1-AngIV或Dihexa处理的分离的海马神经元上完成记录。记录到的电流是在没有动作电位，同时存在番木鳖碱、木防己苦毒素和河豚毒素的条件下，由AMPA介导的突触传递自发产生的电流。A)用Nle1-AngIV或Dihexa处理的海马神经元中记录到的mEPSC代表剂量。B)代表用Nle1-AngIV或Dihexa处理的海马神经元中由AMPA介导的频率增加的柱形图。增加的频率表明Nle1-AngIV或Dihexa诱导的树突棘支持功能性的突触。***=p〈0.001 ；土平均数标准误差；n=25。
[0044]图7A和B.对源于大鼠的器官型海马脑切片培养物的CAl海马神经元中Nle1-AngIV和Dihexa依赖性的树突棘生成的评估。发现Nle1-AngIV和Dihexa能够支持CAl海马神经元中的树突棘 生成。器官型海马脑切片培养物(厚度400 μ m)代表的更加完整环境，以生物弹道法(biolistically)转染可溶性的红色突光蛋白Tomato。选择CAl海马神经元用于评估，是由于已知它们在学习过程中具备可塑性反应。切片来自出生后5天的大鼠。A)来自经Tomato转染的海马脑切片的CAl神经元树突的代表图象。图片表示采用IO^2MNle1-AngIV或Dihexa处理2天的图象。B)在海马神经元CAl区锥体细胞观察到处理诱导的树突棘生成。对照切片中经测量为每50 μ m树突长度有7个树突棘，而经Nle1-AngIV和Dihexa处理过的神经元每50 μ m树突长度有11个树突棘；平均值土平均数标准误差，n=17 ;**=P〈0.01。通过单因素方差分析和图基(tukey)事后检验法计算统计学意义；试验至少重复三次。
[0045]图8.HGF剂量依赖性增加树突棘生成。HGF对于分离的海马神经元的树突棘生成的影响。选自I日龄或2日龄大鼠分离的海马神经元经mRFP-β-肌动蛋白转染并采用HGF刺激5天。采用2.5纳克/毫升HGF处理不会影响基础树突棘的数量，2.5纳克/毫升是亚阈值(sub-threshold)的。和采用媒介物处理的神经元相比，5、10和20纳克/毫升的剂量能够显著增加每50 μ m树突长度树突棘的个数。***P〈0.001 ;平均值土平均数标准误差；每个处理组n=50。
[0046]图9A和B.Dihexa和HGF对器官型海马脑切片培养物的的树突棘生成的影响。海马脑切片培养物在体外培养第三天(DIV3)采用红色可溶性蛋白Tomato以生物弹道法转染并在体外培养第五天(DIV5)采用Dihexa或HGF刺激。器官型海马脑切片培养物保持更加完整的穿质通路能够代表更完整的环境。A)展示学习相关的突触可塑性的海马区域的神经元类型CAl神经元的代表图象。海马脑切片采用媒介物、10_12M Dihexa或10纳克/毫升的HGF刺激2天。B)代表每个处理组每50 μ m树突长度的树突棘个数的柱形图。和对照处理组的神经元相比，Dihexa和HGF能够显著增加海马神经元CAl的树突棘个数。***=P〈0.001 ；平均值土平均数标准误差；对照组神经元n=20、Dihexa刺激的神经元n=26、HGF刺激的神经元n=38。
[0047]图10A-D.HGF处理对于分离的海马神经元的树突棘生成的影响。HGF的处理支持功能性突触的形成，正如突触后树突棘(红色)和突触前活跃区域的标志物(绿色)之间的高度相关性所示。A)海马神经元在体外培养第6天(DIV6)采用mRFP-β -肌动蛋白转染并在体外培养第6天采用10纳克/毫升的HGF处理后的代表图像。神经元采用普通的突触前标记物突触蛋白和谷氨酸能突触前标记物VGLUTl染色。B)代表活跃表型的柱形图，正如采用HGF (10纳克/毫升)刺激后每50 μ m树突长度的树突棘的个数的显著增加所示。平均树突棘个数=33而对照组=23 ;***=P〈0.001,采用单因素方差分析和图基(tukey)事后检验法；平均值土平均数标准误差；n=25)。C)富含肌动蛋白的突触后树突棘(红色)与一般性突触前标记物突触蛋白(绿色)相比的相关百分比。高相关百分比表明已形成了功能性突触。D)富含肌动蛋白的树突棘(红色)和谷氨酸能突触前标记物VGLUTl (绿色)并列相比的相关百分比。高于95%的关系表明这些传入大部分都是谷氨酸能神经元。
[0048]图11.Dihexa和HGF处理对于分离的海马神经元的mEPSCs频率的影响。转染了mRFP-β -肌动蛋白的分离的海马神经元在开始记录mEPSCs之前5天采用10_12M Dihexa或10纳克/毫升的Dihexa进行刺激。神经元采用河豚毒、木防已苦毒素和马钱子碱处理以抑制动作电位、GABA依赖性抑制和甘氨酸依赖性抑制。和媒介物处理的神经元相比，采用两种兴奋剂处理能够显著增强AMPA介导的电流(**P〈0.002 ;通过Newman-Keuls事后检验法和单因素方差分析计算土平均数标准误差；n分别为9、9和11)。
[0049]图12A和B.最高剂量和亚阈值剂量的血管紧张素IV类似物和HGF对于树突棘生成的影响。A)亚阈值剂量的HGF、Dihexa或Nle1-AngIV不会影响基础树突棘的数量。联合给药亚阈值水平的Dihexa (I(T13M)和HGF (2.5纳克/毫升)的表型与单独给药生物学有效剂量的Dihexa产生的效应类似；#=10_13M，$=2.5纳克/毫升。B)亚阈值剂量的母体化合物Nle1-AngIV (I(T13M)不会影响基础树突棘水平。联合给药亚阈值水平的Dihexa (I(T13M)和HGF (2.5纳克/毫升)的表型与单独给药生物学有效剂量的Nle1-AngIV产生的效应类似；#=10_13M，$=2.5纳克/毫升。亚阈值剂量的联合兴奋剂产生最大反应表明了受体通路的共性。***P〈0.001 ;平均值土平均数标准误差；n=50。
[0050]图13A-D.新型HGF拮抗剂Hinge对血管紧张素IV型配体和HGF介导的树突棘生成的影响。A)评估了 HGF拮抗剂Hinge(I(T12M)对树突棘生成的影响。在很宽剂量范围内，Hinge不会影响神经元的树突棘生成；包含Dihexa以确保神经元能够响应处理；B) Hinge抑制HGF诱导的树突棘生成；C) Hinge抑制Nlel-AngIV诱导的树突棘生成；D) Hinge抑制Dihexa诱导的树突棘生成。#=10_12M，$=10纳克/毫升。上述数据进一步表明Nlel-AngIV和Dihexa是由HGF/c-Met系统介导的。*#P〈0.001 ;平均值土平均数标准误差；η=50。
[0051]图14A-D.HGF拮抗剂Hinge对HGF和Dihexa介导的分离的海马神经元的mEPSCs增强的影响。在没有动作电位时，记录mEPSCs之后，对分离的海马神经元采用Hinge(l(T12M)、HGF、Dihexa (I(T12M)或 HGF (10 纳克 / 毫升)处理 5 天。A) Hinge 处理的神经元的代表痕量(trace)。B)媒介物处理的神经元的代表痕量。C)和对照处理组的神经元相t匕，HGF显著增加AMPA介导的频率。这一效应被Hinge减弱，而Hinge单独使用没有任何影响。D)自发的AMPA介导的频率会在Dihexa处理后显著增加，而在采用Hinge前处理后会显著降低，Hinge单独使用对基线频率没有任何影响。*P〈0.001 ;平均值土平均数标准误差，单因素方差分析和Newman-Keuls事后检验法。
[0052]图15A-B.c-Met蛋白在成年大鼠脑中的分布。总的脑部区域取自Sprague-Dawley大鼠，并迅速采用液氮冰冻。样品被均质化，并采用电泳和免疫印迹分离c-Met蛋白和肌动蛋白。A)代表对于认知非常重要的特定脑部区域的c-Met总量(未指明单位)的柱形图。比较脑部样品和HGF的产生地-肾脏。B)以肌动蛋白为内参照(loading control),样品使用能够结合c-Met蛋白(条带在145kDa)的探针的代表性蛋白印迹图象。基于BCA蛋白决定簇，每条泳道中使用等量的蛋白。
[0053]图16.在大鼠海马脑切片中使用HGF和Dihexa激活c-Met磷酸化。为了检测Dihexa是否能够激活成年大鼠脑中的c-Met受体，海马脑切片采用HGF、Dihexa或媒介物(aCSF)急性刺激30分钟。通过蛋白印迹中c-Met受体的磷酸化测量受体活化程度。和媒介物处理的切片相比，饱和剂量的HGF (100纳克/毫升)和Dihexa ( I(TkiM)能够有效增加经急性刺激的成年海马脑切片中c-Met的磷酸化。和对照相比，亚阈值剂量的HGF (50纳克/毫升)和Dihexa (10_12M)不能显著增加c-Met受体的磷酸化。然而，联合给药亚阈值剂量的HGF和Dihexa的表型与给药饱和剂量的HGF和Dihexa表型类似。
[0054]图17.HGF模拟物 、Dihexa对c_Met活化的影响。HEK293细胞采用各种剂量的HGF+/-Dihexa处理后，在37°C保温30分钟，然后通过免疫印迹分析磷酸化的(活化的)c-Met。结果清楚地表明，HGF和Dihexa能够协同激活c_Met。
[0055]图18.HGF模拟物、Dihexa、HGF依赖性细胞分散的影响。在MDCK细胞(犬肾上皮连续细胞系)中评定细胞分散性。细胞在盖玻片上生长聚集，然后转移到一个干净的平板。处理4天后，测定从盖玻片分散下来的细胞的数量。HEX=DiheXalO-1QM。
[0056]图19.确认敲除c-Met受体。通过采用用于证实蛋白存在的6Myc标记的cMet基因产品mRFP-β -肌动蛋白(未转染)、shRNA (c_Met)序列(仅shl用于敲除实验)和两种合并的shRNA转染HEK细胞，来确认敲除受体。转染的细胞继续培养24小时，然后在细胞裂解液(RIPA)中溶解，准备用于凝胶电泳。样品通过蛋白印迹采用探针检测Myc。未被感染的细胞可以用作显示没有信号的阴性对照，带有6-Myc标记的cMet基因产品是阳性对照并有强烈的信号。ShMetl和shMet2序列能够大大减弱信号，并且二者的结合没有信号表明能够有效敲除受体。
[0057]图20.使用shRNA敲除c-Met对树突棘生成的影响。该图显示了蛋白印记探测的Myc。经mRFP-β -肌动蛋白或shMet转染以便敲除c_Met受体的海马神经元采用HGF (10纳克 / 毫升)、Dihexa (I(T12M)或 Nle1-AngIV (I(T12M)刺激 48 小时。经 mRFP-β_ 肌动蛋白转染并经HGF、Dihexa或Nle1-AngIV刺激的神经元显著增加树突棘生成(*P〈0.05 ;平均值土平均数标准误差；n=100)。那些转染了 mRFP-β -肌动蛋白和shMet的神经元对HGF、Dihexa或Nle1-AngIV的刺激没有反应，证实HGF和c-Met是靶标(P>0.05 ;平均值土平均数标准误差；n=100)。
[0058]图21.HGF和c_Met对于空间学习和记忆有作用。在Morris水迷宫空间学习和记忆测试中，测量大鼠找到水下平台的潜伏期用于确定HGF/c-Met对学习和记忆的影响。大鼠接受侧脑室注射失忆药或HGF/c-Met受体兴奋剂。经东莨菪碱处理的大鼠一通过测量逃避潜伏期表明东莨菪碱不能使其学习该任务。经aCSF处理的一组大鼠的潜伏期一aCSF相比东莨菪碱处理的大鼠组第一天的培训明显更短。东莨菪碱一Dihexa处理过的大鼠和Hinge处理过的大鼠一Hinge虽然和东莨菪碱处理的小组没有明显不同，在培训第一天表现出快速适应任务。接受东莨菪碱+Hinge的小组一Dihexa和东莨菪碱处理的小鼠没有明显区别，并且逃避潜伏期较长。在Morris水迷宫空间学习和记忆测试中大鼠找到水下平台的小组潜伏期。Hinge单独对学习没有任何影响；然而，除了东莨菪碱，Hinge也能够阻止对任务的适应。
[0059]图22.和 D-Nle-Tyr-1Ie-NH- (CH2) 5_C0NH2 相比，大鼠血液中 Norleual 的稳定性。
[0060].
【权利要求】
1.一种具有以下通式的肝细胞生长因子(HGF)模拟物:
2.如权利要求1所述的HGF模拟物，其特征在于R1为N-酰基，选自于由己酰基、庚酰基、戊酰基、丁酰基、丙酰基、乙酰基和苯甲酰基所组成的组。
3.如权利要求1所述的HGF模拟物，其特征在于R1为正亮氨酸基和D-正亮氨酸。
4.如权利要求1所述的HGF模拟物，其特征在于R1为氨基酸，所述氨基酸选自酪氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、精氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、赖氨酸、正缬氨酸、鸟氨酸和S-苄基半胱氨酸。
5.如权利要求1所述的HGF模拟物，其特征在于R2为酪氨酸。
6.如权利要求1所述的HGF模拟物，其特征在于所述HGF模拟物为己酸-酪氨酸-异亮氨酸-(6)-氨基己酰胺。
7.一种治疗组合物，包含: 至少一种具有以下通式的肝细胞生长因子(HGF)模拟物:
8.如权利要求7所述的治疗组合物，其特征在于进一步包含至少一种与所述至少一种HGF模拟物不同的其他生物活性试剂。
9.如权利要求8所述的治疗组合物，其特征在于所述至少一种其他生物活性试剂选自于由抗抑郁药、精神药物和镇痛药组成的组。
10.一种在有需要的受试者中强化认知功能、或者治疗或防止认知障碍的方法，包括向所述受试者给药治疗剂量的一种或多种具有以下结构通式的肝细胞生长因子模拟物:
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于所述给药步骤为在一时间段内实施多次。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于进一步包括下述步骤:在所述时间段内检测所述受试者的认知，并且基于检测结果调整所述HGF模拟物的给药量。
13.如权利要求10所述的方法，其特征在于所述HGF模拟物为己酸-酪氨酸-异亮氨酸-(6)-氨基己酰胺。
14.一种在有需要的受试者中扩展突触连接性和/或引起神经更替的方法，包括向所述受试者给药治疗剂量的一种或多种具有以下结构通式的肝细胞生长因子模拟物:
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于在所述受试者患有脊髓损伤之后实施所述给药步骤。
16.一种在有需要的受试者中治疗痴呆的方法，包括向所述受试者给药治疗剂量的一种或多种具有以下结构通式的肝细胞生长因子模拟物:
17.一种在有需要的受试者中提供神经保护或诱导神经再生的方法，包括向所述受试者给药治疗剂量的一种或多种具有以下结构通式的肝细胞生长因子模拟物:
18.一种在具有正常认知能力的个体中提高认知功能的方法，包括向所述受试者给药促进剂量的一种或多种具有以下结构通式的肝细胞生长因子模拟物:
19.一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向所述受试者给药治疗剂量的一种或多种具有以下结构通式的肝细胞生长因子模拟物:


20.一种在有需要的受试者中治疗糖尿病的方法，包含向所述受试者给药治疗剂量的一种或多种具有以下结构通式的肝细胞生长因子模拟物:
21.一种在有需要的受试者中治疗纤维化疾病的方法，所述纤维化疾病包括心肌纤维化、肺纤维化、肾纤维化和肝纤维化，所述方法包括向所述受试者给药治疗剂量的一种或多种具有以下结构通式的肝细胞生长因子模拟物:
22.—种在有需要的受试者中治疗血管功能不全的方法，所述血管功能不全包括深静脉血栓形成和冠状动脉闭塞，所述方法包括向所述受试者给药治疗剂量的一种或多种具有以下结构通式的肝细胞生长因子模拟物:
23.一种在有需要的受试者中促进伤口愈合的方法，包括向所述受试者给药治疗剂量的一种或多种具有以下结构通式的肝细胞生长因子模拟物:
24.一种在有需要的受试者中延缓或逆转疾病中眼部血管过度形成的方法，所述疾病包括糖尿病视网膜病和黄斑变性，所述方法包括向所述受试者给药治疗剂量的一种或多种具有以下结构通式的肝细胞生长因子模拟物:
【文档编号】A61K38/18GK103582490SQ201280026925
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年4月2日 优先权日:2011年4月2日
【发明者】J·W·哈丁, J·W·赖特, C·C·伯努瓦, L·H·卡瓦斯, G·A·韦曼 申请人:华盛顿州立大学研究基金会