专利名称：：碱性成纤维细胞生长因子及其组合物在制备美容化妆品中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明提供了碱性成纤维细胞生长因子的新用途，尤其是公开了碱性成纤维细胞生长因子及其组合物在制备美容化妆品中的用途，同时还提供了其生产工艺，属于生物美容制品
技术领域：
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背景技术：
：本发明涉及的碱性成纤维细胞生长因子(BasicFibroblastGrowthFactor,简称bFGF)，是主要由大脑和脑垂体中的星形胶质细胞、垂体滤泡及部分神经细胞所分泌的一种促细胞分裂生长因子。bFGF的基因定位于染色体4q26227,其转录产物RNA有多个拼切位点及多个翻译起始位点,由此产生多种分子量的bFGF,小分子量18Kd的bFGF多由AUG起始翻译,分泌到胞外的bFGF以这种亚型多见。高分子量21kD、22.5kD、24kD、34kD的bFGF以CUG为翻译起始点，主要定位于胞核中。不象其他细胞分泌性蛋白,bFGF缺少典型的信号肽,不能通过经典的高尔基2内质网途径分泌到胞外,但具体机制至今仍不详。现今研究的bFGF的生物学活性主要是针对18Kd的亚型。bFGF能刺激和调节血管内皮细胞、上皮细胞、成肌细胞、成骨细胞和神经胶质细胞等多种起源于中胚层、神经外胚层的细胞分化增飱，在胚胎发育、组织愈合中起重要作用。目甜bFGF的研究或应用均局限在促进神经损伤的修复方面，尚未见有其在美容方面的研究或应用。本发明涉及的hGM-CSF是人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(Humangranulocytemacrophagecolonystimulatingfactor)的简称，是人体内分泌的一种重要的促细胞生长增殖的细胞剌激因子，具有显著的诱导未成熟的骨髓细胞前体细胞增殖和成熟等功能。它由T细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肥大细胞、B细胞和巨噬细胞等分泌。根据其糖基化程度不同，分为9个以上不同的类型，分子量从14.5-32kd不等。hGM-CSF作为一种强有力的细胞分裂因子，具有很高的生物活性。极微量hGM-CSF即能强烈促进相关细胞的增殖和成熟。目前，hGM-CSF的研究和应用均局限在治疗肿瘤放化疗后的白细胞减少、骨髓移植和再生障碍性贫血等方面，hGM-CSF还作为疫苗佐剂使用。尚未发现hGM-CSF在美容方面的研究和应用。另外，将hGM-CSF和bFGF组合在一起，应用于人的美容，目前也未见文献报道。
发明内容本发明公开了一种碱性成纤维细胞生长因子在制备美容化妆品中的用途。本发明还公开了碱性成纤维细胞生长因子组合物在制备美容化妆品中的应用。本发明的技术解决方案包括1、以碱性成纤维细胞生长因子为主要活性成分，采用特殊的真空冷冻干燥工艺及常规的美容化妆品生产工艺制成化妆品。2、本发明还提供了一种含有bFGF、hGM-CSF为主要活性成分的美容化妆品(重量份数比)bFGF110万AUhGM-CSF3002000ug活性稳定剂4~8g活性促进剂0.33g蛋白酶抑制剂0.10.6g透皮吸收促进剂0.12g所用的蛋白酶抑制剂为硼酸亮氨酸、硼酸缬氨酸、硼酸丙氮酸、N-乙酰半胱氨酸中的任意一种。所用的透皮吸收促进剂为月桂氮卓酮、丙二醇、巯基乙酸钙中的任意一种。所用的活性稳定剂为透明质酸、甘露醇、右旋糖苷的任意一种；所用的活性促进进剂为水溶性胶原蛋白。所述的美容化妆品的制备方法，包括以下步骤在bFGF中加入活性稳定剂、活性促进剂、蛋白酶抑制剂及透皮吸收促进剂的任意一种或多种，用纯化水配制成水溶液，再采用真空冷冻干燥工艺制成冻干粉。也可在上述歩骤中同时加入hGM-CSF，制成美容化妆品。本发明的技术方案中涉及以下成分活性成分bFGF、hGM-CSF;活性稳定剂透明质酸、甘露醇、右旋糖苷；活性促进剂水溶性胶原蛋白；蛋白酶抑制剂硼酸亮氨酸、硼酸缬氨酸、硼酸丙氨酸、N-乙酰半胱氨酸；透皮吸收促进剂佐恩(月桂氮卓酮，Azone)、丙二醇、巯基乙酸钙。在上述的活性成分中加入活性稳定剂、活性促进剂、蛋白酶抑制剂及透皮吸收促进剂中的任意一种或多种，用低温纯化水配制成水溶液，并置于冰浴中，待分装。将上述配制而得的水溶液，分装到西林瓶中，置于真空冷冻干燥机中进行冻干后即得。专用溶媒的制造透皮吸收促进剂0.12份蛋白酶抑制剂0.10.6份活性稳定剂4~8份丙三醇2~6份pH5.07.4PBS溶液加至100份按上述比例将透皮吸收促进齐U、蛋白酶抑制剂、活性稳定剂混合，用PBS溶液溶解，加入丙三醇，混匀，分装，加塞，用流通蒸汽灭菌后即得。冻干粉的制剂制造按上述比例将活性成分、活性稳定剂、活性促进剂和/或活性稳定剂和/或蛋白酶抑制剂和/或透皮吸收促进剂，用低温纯化水配制成水溶液，并置于冰浴中；将上述配制而得的水溶液，分装到西林瓶中，将胶塞半加塞，置于真空冷冻干燥机中进行冻干。冻干工艺及条件为开启真空冷冻干燥机，对制品进行预冷，将制品温度降至-60°C，降温时间为4-5小时。启动真空泵，将箱内真空度抽至0.3Mbar。加温，升华，升华时间为14-18小时，升华完毕，压塞，箱内充入无菌气体，开箱，取出制品，轧盖，入库。产品形式为冻干粉加专用溶媒，使用时需用专用溶媒作溶解剂。专用溶媒的配方及工艺为将透皮吸收促进剂、蛋白酶抑制剂、活性稳定剂，用pH5.07.4PBS溶液溶解，加入丙三醇，混匀，分装，加塞，用10(TC流通蒸汽灭菌30分钟后即得。活性稳定剂可用其中的一种或几种，但三种活性稳定剂及一种活性促进剂同时使用效果最佳。透皮吸收促进剂及蛋白酶抑制剂在组方中每次一般只用其中的一种，也可几种合用，其效果类似。以下实验表明本发明的美容效果1材料活性成分bFGF和hGM-CSF，均为市售品，也可采用基因工程法自行生产。使用前要进行活性测定，bFGF活性测定采用的是细胞增殖/MTT法，hGM-CSF的活性测定采用的是TF-1细胞/MTT比色法，两种方法的具体操作方法均见中国药典2005版。活性稳定剂透明质酸、甘露醇、右旋糖苷。市售，化学纯。活性促进剂水溶性胶原蛋白，市售，纯度大于95%。蛋白酶抑制剂硼酸亮氨酸、硼酸缬氨酸、硼酸丙氨酸、N-乙酰半胱氨酸，市售，化学纯。透皮吸收促进剂佐恩(月桂氮卓酮，Azone)、丙二醇、巯基乙酸钙。市售，化学纯。蛋白酶胃蛋白酶、胰蛋白酶，市售，化学纯。2方法2.1冻干粉制剂的制造参见上文2.2专用溶媒的制造参见上文2.3抗蛋白酶降解试验实验品将上述制造的含有活性成分的冻干粉制剂用专用溶媒溶解，制成水溶液，并分别测定其两种活性成分的活性，以此活性值作为100%。活性测定的方法同上。对照品除不含有蛋白酶抑制剂外，其余同实验品。用纯化水制成水溶液，并分别测定其两种活性成分的活性，以此活性值作为100%。蛋白酶溶液将胃蛋白酶及胰蛋白酶，用纯化水配成含1%胃蛋白酶及1%的胰蛋白酶的混合水溶液。分别取实验品及对照品各20ml，分别加入蛋白酶溶液0.5ml，混匀，置37'C水浴中孵育，分别于不同的时间取样，进行活性测定。2.4稳定性试验取上述制得的含有两种活性成分的冻干粉制剂，分别置于室温及7'C冰箱中，分别于放置不同的时间后取样，进行含量及活性测定。2.5美容效果试验实验品1:含有bFGF及hGM-CSF的冻干制剂实验品2:只含有hGM-CSF的冻干制剂实验品3:只含有bFGF的冻干制剂空白对照品既不含bFGF也不含hGM-CSF的冻干制剂市售对照品市售某品牌嫩肤美容产品实验品13及空白对照品，在使用前均用专用溶媒溶解，之后，涂布于面部皮肤，并用特定的方法进行导入。分别进行如下美容效果试验2.5.1嫩肤、去皱试验选取4055岁老年人200人，男女各半。随机分为5组，每组40人，男女各半。每组分别使用上述实验品或空白对照品，连续2个月，然后分别评价其嫩肤、去皱的美容效果。2,5.2祛斑试验选取2035岁面部有色斑的女性160人，随机分为4组，每组40人。每组分别使用上述各实验品或空白对照品，连续2个月，然后分别评价其祛斑效果。2.5.3祛痘试验选取1825岁面部有青春痘的人160人，男女各半，随机分为4组，每组40人，男女各半。每组分别使用上述各实验品或空白对照品，连续2个月，然后分别评价其祛痘效果。2.5.4安全性试验在上述嫩肤去皱试验、祛斑试验及祛痘试验中，同时观察其对皮肤的刺激性、过敏性及其它不良反应。3结果3.1冻干粉制剂的制造结果经上述工艺制造出来的冻干粉制剂，外观呈疏松的块状或粉状，呈白色或类白色。加水极易溶解，溶解后呈澄清透明的溶液。经微生物学检测，未检出活的微生物，为无菌溶液。超过国家有关化妆品的卫生标准。3.2专用溶媒的制造结果经上述工艺制造出来的专用溶媒，外观澄清透明。经微生物学检测，未检出活的微生物，为无菌溶液。超过国家有关化妆品的卫生标准。3.3抗蛋白酶降解试验结果表1抗蛋白酶降解试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>由上表可以看出，实验组在37。C温度下与胃蛋白酶及胰蛋白酶共同作用30分钟后，其活性基本不下降，作用1小时后，其活性仍降低很少。而对照组在与蛋白酶共同作用IO分钟后，其活性即只剩原来的四分之一以下。结果说明，本发明之制品具有良好的抗蛋白酶降解作用。而用本品进行美容护肤时，制品在皮肤上的停留并导入的时间不超过20分钟，故本发明之制品的抗蛋白酶降解作用的时间是足够的。3.4稳定性试验结果表2稳定性试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>从上表可以看出，本发明之制品，在常温放置及7。C下放置至36个月时，其含量均未见明显变化；在常温下放置至18个月时，其活性未见明显变化；在7'C下放賈至30个月时，其活性仍未见明显变化。结果表明，本发明之制品，可在常温下保存18个月，如置于7"C以下，则保存时间更长，可长达2.5年以上。3.5美容效果试验结果3.5.1嫩肤、去皱试验结果表3嫩肤、去皱试验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>hGM-CSF组4077.517.55.0bFGF组4085.012.52.5空白对照组4000100市售品对照组40047.552.5由上表可以看出，bFGF、hGM-CSF单独使用即有较好的嫩肤去皱效果；bFGF与hGM-CSF合用，嫩肤去皱的效果最佳；不含有bFGF和hGM-CSF的空白对照组，没有嫩肤去皱的效果；hGM-CSF与bFGF组、hGM-CSF组及bFGF组的美容效果均显著优于市售对照品组。3.5.2祛斑试验结果表4祛斑试验结果组别例数(人)祛斑效果(％)显著一般不明显bFGF及hGM-CSF组4072.520.07.5hGM-CSF组40復035.025.0bFGF组4055.035.010.0空白对照组4000100由上表可以看出，bFGF和hGM-CSF组、hGM-CSF组及bFGF组均具有较好的祛斑效果，其中，hGM-CSF和bFGF组合使用，祛斑效果最佳。3.5.3祛痘试验结果表5祛痘试验结果组别例数(人)祛痘效果(％)显著一般不明显bFGF及hGM-CSF组3066.720.013.3hGM-CSF组3060.026.613.4bFGF组3043.336.720.0空白对照组3000100由上表可以看出，bFGF和hGM-CSF组、hGM-CSF组及bFGF组均具有较好的祛痘效果，其中，hGM-CSF和bFGF合用，祛痘效果最佳。3.6安全性试验结果表6安全性试验结果例数(人)安全性试验结果(％)皮肤刺激性过敏反应其它不良反应72001.10.7经720人使用后，未发现对皮肤有刺激性，只发现8人面部轻度过敏，有5人局发痒或潮红。10本发明将bFGF和hGM-CSF应用于美容时，解决了三个严重的问题，否则其将无法实际应用。艮P:(1)bFGF及hGM-CSF在常温下难以保持其生物学活性。在常温下放置短时间后，其即失去其生物学活性，故其生产、运输、保存都成为不可逾越的鸿沟，使其实际应用难以实现。另外，其发挥生物学活性需特定的pH值、离子强度及温度，故制成霜剂等常见化妆品剂型，其将不具有任何生物学活性。(2)bFGF及hGM-CSF易被蛋白酶降解而失去活性。bFGF及hGM-CSF的化学本质为蛋白多肽类，人皮肤表面存在大量的蛋白酶，在bFGF接触皮肤后，会很快被皮肤表面的蛋白酶降解而失去活性。(3)bFGF及hGM-CSF难以透皮吸收。bFGF及hGM-CSF均是大分子生物活性物质，在正常情况下，其难以透过皮肤进行吸收。本发明成功地解决了上述难题，使bFGF及hGM-CSF应用于美容成为现实。本发明的有益效果在于将bFGF及与hGM-CSF组合用于外用美容，两种生物活性成分联合应用，通过补充促进细胞代谢和增殖的生物活性因子，从根本上改善皮肤的生理状态，促进皮肤组织的修复和代谢；使皮肤异常细嫩年轻；淡化色斑，平复皱纹；减轻R晒对皮肤的损伤；并具有显著抗衰老作用。故嫩肤美容效果显著，且安全可靠，无副作用。bFGF及hGM-CSF联合应用，其组方中各成分可相互协同，较单用bFGF或hGM-CSF，可显著促进人上皮组织的生成和增殖，美容效果显著增强。将透皮吸收促进剂应用于bFGF和域hGM-CSF的美容组方中，解决了bFGF及hGM-CSF难以透皮吸收的问题，显著地提高了其美容效果。将蛋白酶抑制剂应用于bFGF及hGM-CSF的美容组方中，解决了bFGF及hGM-CSF易被蛋白酶降解的问题，保持了bFGF及hGM-CSF的活性，促进了bFGF及hGM-CSF的吸收，显著地提高了其嫩肤美容的效果。将bFGF及hGM-CSF制成冻干粉制剂，解决了其在常温下易失去活性的问题。该配方制成的冻干粉剂，可在常温下可保持活性18个月；在07卩冷库中，可保持活性2.5年以上。故可常温运输和保存，如置于冷库或冰箱中保持，效果更佳。解决了bFGF及hGM-CSF的生产、运输和保存时无法保持活性的问题，使bFGF及hGM-CSF的实际应用成为现实。其制造工艺合理，适合于工业化大规模生产。具体实施方式通过以下实施例进一歩举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。主要材料活性成分bFGF及hGM-CSF。可自行制造，也可外购购获得。其主要工艺过程为将bFGF及hGM-CSF工程菌在发酵罐内发酵，离心取菌体，用PBS液洗涤两次，置抽提液中抽提。离心取上清，盐析。离心，取沉淀。将沉淀复溶，用层析法进行纯化，收集bFGF及hGM-CSF峰，置-20'C低温冰柜中冻存。取样进行纯度及活性测定。活性稳定剂透明质酸、甘露醇、右旋糖苷，市售，化学纯。活性促进剂水溶性胶原蛋白，市售，纯度大于95%。蛋白酶抑制剂硼酸亮氨酸、硼酸缬氨酸、硼酸丙氨酸、N-乙酰半胱氨酸，化学纯。透皮吸收促进剂佐恩(月桂氮卓酮，Azone)、丙二醇、巯基乙酸钙。化学纯。实施例l:量取bFGF24万AU、hGM-CSF300700ug、透明质酸16g、甘露醇38g、右旋糖苷38g、水溶性胶原蛋白16g、纯化水加至100ml;将上述各成分溶解于低温纯化水中，分装，冻干，即得。实施例2:量取bFGF4002000ug、透明质酸16g、甘露醇38g、右旋糖苷388g、水溶性胶原蛋白16g、纯化水加至100ml，将上述各成分溶解于低温纯化水中，分装，冻干，即得。实施例3-量取hGM-CSF7002000wg、WGF0.12万AU、甘露醇38g、右旋糖苷38g、水溶性胶原蛋白l6g、纯化水加至100ml，将上述各成分溶解于低温纯化水中，分装，冻干，即得。实施例4:量取bFGF410万AU、hGM-CSF100300yg、甘露醇38g、右旋糖苷38g、透明质酸l6g、纯化水加至100ml，将上述各成分溶解于低温纯化水中，分装，冻干，即得。实施例5:量取bFGF58万AU、hGM-CSF200400wg、右旋糖苷38g、水溶性胶原蛋白16g、透明质酸l6g、纯化水加至100ml，将上述各成分溶解于低温纯化水中，分装，冻干，即得。实施例6:量取bFGF24万AU、hGM-CSF300700ug、甘露醇38g、水溶性胶原蛋白i6g、透明质酸16g、纯化水加至100ml，将上述各成分溶解于低温纯化水中，分装，冻干，即得。实施例7:量取bFGF24万AU、hGM-CSF300700ug、甘露醇38g、透明质酸16g、纯化水加至100ml，将上述各成分溶解于低温纯化水中，分装，冻干，即得。实施例8:量取bFGF24万AU、hGM-CSF300700ug、右旋糖苷38g、水溶性胶原蛋白l6g、纯化水加至100ml，将上述各成分溶解于低温纯化水中，分装，冻干，即得。实施例9:量取bFGF24力'AU、甘露醇38g、右旋糖苷38g、水溶性胶原蛋白16g、纯化水加至100ml，将上述各成分溶解于低温纯化水中，分装，冻干，即得。实施例10:量取bFGF24万AU、透明质酸l6g、甘露醇38g、右旋糖苷38g、纯化水加至100ml，将上述各成分溶解于低温纯化水中，分装，冻千，即得。实施例ll:量取bFGF24万AU、透明质酸l6g、右旋糖苷38g、水溶性胶原蛋白l6g、纯化水加至100ml，将上述各成分溶解于低温纯化水中，分装，冻干，即得。实施例12:量取bFGF24力'AU、透明质酸l6g、甘露醇38g、水溶性胶原蛋白l6g、纯化水加至100ml，将上述各成分溶解于低温纯化水中，分装，冻干，即得。实施例13:量取bFGF24万AU、甘露醇38g、右旋糖苷38g、纯化水加至100ml，将上述各成分溶解于低温纯化水中，分装，冻干，即得。权利要求1、碱性成纤维细胞生长因子在美容化妆品中的应用。2、一种含有碱性成纤维细胞生长因子组合物的美容化妆品，主要活性成分为(重量份数比)碱性成纤维细胞生长因子3002000yg人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子110万AU3、根据权利要求1或2所述的美容化妆品，其特征在于人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子3002000ug碱性成纤维细胞刺激因子110万AU活性稳定剂活性促进剂蛋白酶抑制剂透皮吸收促进剂48g0.33g0.10.6g0.12g(4、权利要求2所述的美容化妆品，其特征在于所用的蛋白酶抑制剂为硼酸亮氨酸、硼酸缬氨酸、硼酸丙氨酸、N-乙酰半胱氨酸中的任意一种。5、权利要求2所述的美容化妆品，其特征在于所用的透皮吸收促进剂为月桂氮卓酮、丙二醇、巯基乙酸钙中的任意一种。6、根据权利要求1所述的美容化妆品的制备方法，包括以下步骤在人粒细胞巨噬细胞集落剌激因子、碱性成纤维细胞生长因子中加入活性稳定剂、活性促进剂、蛋白酶抑制剂、透皮吸收促进剂中的任意一种或多种，用纯化水配制成水溶液，再采用真空冷冻干燥工艺制成冻干粉；冻干工艺及条件为对制品进行预冷，使其降至-6(TC，降温时间为4-5小时；抽真空至0.3Mbar;加温，升华，升华时间为14-18小时；至制品中的水分升华完毕，压塞，箱内充入无菌气体。7、一种与权利要求1、2、3所述美容化妆品其配合使用的溶媒，由以下重量份数比的原料制成透皮吸收促进剂0.12份蛋白酶抑制剂0.10.6份活性稳定剂48份丙三醇2~6份PBS溶液加至100份将透皮吸收促进剂+蛋白酶抑制剂+活性稳定剂，用PBS溶液溶解，加入丙三醇,混匀，分装，加塞，用流通蒸汽灭菌后即得。全文摘要本发明公开了一种碱性成纤维细胞生长因子及组合物在制备美容化妆品中的用途，同时还提供了其生产工艺。本发明利用生物技术美容，将碱性成纤维细胞生长因子用于外用美容，并与人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子组合在一起应用于美容。碱性成纤维细胞生长因子与人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子两种生物活性成分联合应用，各成分相互协同，通过补充促进表皮细胞代谢和增殖的生物活性因子，从根本上改善皮肤的生理状态，促进表皮组织的修复和代谢；可使皮肤异常细嫩年轻，淡化色斑，平复皱纹，减轻日晒对皮肤的损伤，还具有显著抗衰老作用，嫩肤美容效果显著，且安全可靠，无副作用。文档编号A61Q19/00GK101327172SQ20081005101公开日2008年12月24日申请日期2008年7月23日优先权日2008年7月23日发明者冯来坤申请人:冯来坤