制备2,4-二羟基丁酸盐的方法

制备2,4-二羟基丁酸盐的方法
【专利摘要】本发明涉及一种从高丝氨酸制备2,4-二羟基丁酸的方法，其包括第一步，将高丝氨酸的伯氨基转化为羰基以获得2-氧代-4-羟基丁酸盐和第二步，将所获得的2-氧代-4-羟基丁酸盐(OHB)还原为2,4-二羟基丁酸盐。
【专利说明】制备2, 4-二羟基丁酸盐的方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种从高丝氨酸制备2, 4-二羟基丁酸盐（2, 4-DHB)的新方法，其包括 两个步骤：
[0002] -第一步，将高丝氨酸的伯氨基转化为羰基以获得2-氧代-4-羟基丁酸盐，和
[0003] -第二步，将获得的2-氧代_4_轻基丁酸盐（OHB)还原以获得2, 4-DHB。
[0004] 本发明所述的羧酸依据盐形式（例如2, 4-二羟基丁酸盐， 2.4- dihydroxyburyrate)命名或依据酸形式（例如2,4-二轻基丁酸， 2.4- dihydroxybutyric acid)的命名的含义等同。

【背景技术】
[0005] 2, 4-二羟基丁酸（等同于2, 4-DHB或DHB)是经济价值可观的化合物。通过调节 适宜的PH，可以在含水介质中将DHB转化为α-羟基-γ-丁内酯。α-羟基-γ-丁内酯 是制备蛋氨酸代替品2-羟基-4-(甲硫基）-丁酸（HMTB) (US2009/318715)的主要前体，其 具有较大的动物营养品市场。目前，α-羟基-γ-丁内酯通过多步骤方法从γ-丁内酯衍 生而来，所述多步骤方法意味着在γ-丁内酯的α位卤化并随后在碱性介质中通过羟基取 代卤原子（US2009/318715)。
[0006] 油价的上涨提高了从可再生资源制备DHB的需要。微生物能够将生物质衍生的原 材料，例如糖或有机酸转化为很多种不同的化合物（Werpy&Petersen，2004)。随着生物化学 体和基因信息的增长，有可能将微生物改性，使其以高产量和产率，过量生产天然产生的代 谢中间产物（Bailey，1991)。微生物制备的优化通常需要代谢网的合理构化，其确保了在其 他成员中意向代谢物生物合成所需的酶的过度表达，产品反馈抑制的缓和。另一种可能是 植入新的酶体系，催化意向代谢物的生产。
[0007] 构化代谢的方法和酶催化需要生物化学的详细知识和产生意向代谢物的代谢途 径的规划。就生产DHB而言，并不具备上述信息。仅极少的研宄报道了在缺乏琥珀酸半醛 脱氢酶的患者中产生DHB (Shinka等，2002)，但是并未确定在生产DHB中涉及的酶反应。因 此，DHB的发酵或酶生产，需要（i)确定热力学上可行的途径，其将可以获得的前体转化为 DHB，（ii)确定或构建在所述途径中能够催化每个反应步骤的酶和（iii)在适宜的制备生 物中途径酶的功能表达。本发明的目的在于满足这些需要。


【发明内容】

[0008] 因此，本发明的目的之一在于从高丝氨酸制备2, 4-DHB的方法，其包括两个步骤 (见图1):
[0009] -第一步，将高丝氨酸的伯氨基转化为羰基以获得OHB，和
[0010] -第二步，将所获得的OHB还原为2, 4-DHB。
[0011] 本发明的方法的第一步和/或第二步可以通过用内源基因或外源基因编码的酶 来催化。
[0012] 在说明书中，也可以通过参照编码具有所述活性的酶的基因指定酶的活性。所用 基因的类别并不限于特定的生物，但是覆盖了其他生物（例如微生物、功能等价物、功能变 体及其功能片段，只要所述生物保存了酶的活性）中所有对应的基因和蛋白质。
[0013] 就本发明的另一方面而言，将高丝氨酸的伯氨基转化为羰基以获得OHB的酶可以 是高丝氨酸转氨酶、高丝氨酸脱氢酶或高丝氨酸氧化酶。
[0014] 就本发明的另一方面而言，可以在具有天冬氨酸转氨酶（EC2. 6. I. 1)活性、支链 氨基酸转氨酶（EC2. 6. 1. 42)活性或芳香氨基酸转氨酶（EC2. 6. 1. 57)活性的酶中识别具有 高丝氨酸转氨酶活性的酶。
[0015] 就本发明的另一方面而言，所述高丝氨酸转氨酶可以是来自大肠杆菌、Ec-IlvE 和乳酸链球菌和Ll-BcaT的支链氨基酸转氨酶，和来自大肠杆菌、Ec-TyrB、乳酸链球菌、 Ll-AraT和酿酒酵母、Sc-Aro8的芳香族氨基酸转氨酶，或来自大肠杆菌、Ec-AspC的天冬氨 酸转氨酶。
[0016] 本发明的第二步通过具有OHB还原酶活性的酶催化。本发明的另一方面在于， 具有OHB还原酶活性的酶可以在具有2-羟基酸脱氢酶活性的酶中确定，特别是具有乳酸 脱氢酶（Ldh) (EC1. I. L 27、ECL I. L 28)、苹果酸脱氢酶（Mdh) (EC1. I. L 37、ECL I. L 82、 ECL I. 1. 299)活性的酶，或支链（D)-2-羟基酸脱氢酶（EC1. I. 1. 272、ECL I. 1. 345)活性 的酶中确定。更特别地，具有高丝氨酸转氨酶活性的酶是通过基因 ilvE、tyrB、aspC、araT、 bcaT、或 AR08 编码。
[0017] 就甚至更特定的方面而言，具有高丝氨酸转氨酶活性的酶通过SEQ ID No. 59、SEQ ID No. 61、SEQ ID No. 63、SEQ ID No. 65、SEQ ID No. 67 或SEQ ID No. 69或与所述序列至少 50% 同源的任意序列或对应 SEQ ID No. 60、SEQ ID No. 62、SEQ ID No. 64、SEQ ID No. 66、 SEQ ID No. 68、SEQ ID No. 70或与所述序列至少50%同源的任意序列所编码。
[0018] 就本发明的另一方面而言，所述OHB还原酶可以是来自乳酸链球菌（Ll-LdhA)、穴 兔（Oc-LldhA)、嗜热脂肪土芽孢杆菌（Gs-Lldh)、或枯草杆菌（Bs-Ldh)的（L)-乳酸脱氢 酶，来自大肠杆菌（Ec-LdhA)的（D)-乳酸脱氢酶，来自大肠杆菌（Ec-Mdh)的（L)-苹果酸 脱氢酶或来自乳酸链球菌（Ll-PanE)的支链（D)-2-羟基酸脱氢酶。
[0019] 就本发明的甚至更特定的方面而言，所述OHB还原酶表示为以下氨基酸序列SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 12、SEQ ID No. 14,SEQ ID No. 288,SEQ ID No. 30,SEQ ID No. 32,SEQ ID No. 102,SEQ ID No. 104, SEQ ID No. 106,、SEQ ID No. 108、SEQ ID No. 110、SEQ ID No. 112、SEQ ID No. 114、SEQ ID No. 116或SEQ ID No. 118或与所述序列至少50%同源的任意序列，或通过以下核酸序列编 码：SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. IUSEQ ID No. 13,SEQ ID No. 287,SEQ ID No. 29,SEQ ID No. 3USEQ ID No. 10USEQ ID No. 103, SEQ ID No. 105、SEQ ID No. 107、SEQ ID No. 109、SEQ ID No. 111、SEQ ID No. 113、SEQ ID No. 115或SEQ ID No. 117或通过与所述序列至少50%同源的任意序列编码。
[0020] 另一方面，如上所述，本发明还涉及将OHB还原为2, 4-DHB的酶的使用。
[0021] 与上述酶基本同源的蛋白质也是本发明的一方面，如功能变体或功能片段。
[0022] 表述"基本同源"包括了结构和/或氨基酸组分和/或生物活性同源。
[0023] 更通常地，本发明中，两种蛋白质序列之间的同源可以通过本领域技术人员已知 的方法确定。通常通过参照序列和意向蛋白序列之间的序列一致的百分比定义。
[0024] 如本文中使用的，本文将相对于确定的氨基酸或核苷酸序列的"序列一致百分比 (%) "定义为候选序列中氨基酸残基或核苷酸与酶序列中氨基酸残基或核苷酸一致的百 分比，如果必要，在排布序列并引入空位之后，为实现最大百分比的序列一致，并且没有将 任意保守取代视为序列一致的一部分。本领域技术人员已知进行序列排布和确定序列一致 性的方法，无需过度实验即可进行，并可以精确计算的一致性值。详见，例如，Ausubel等， 版本（1995)Current Protocols in Molecular Biology，第 19 章 （Greene Publishing 和 Wiley-lnterscience，纽约）；和 ALIGN 程序（Dayhoff (1978) in Atlas of Protein Sequence and Structure 5: Pif 3? 3 (National Biomedical Research Foundation,华 盛顿）。存在很多排布序列和确定序列一致性的方法，包括例如，Needleman等的等同排 布的算法，（1970) J. Mol. Biol. 48:443 ;Smith等的区域等同的算法，（1981)六扣.六卩卩1· Math. 2:482 ;Pearson 等的类似方法的研宄，（1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 ; Smith-Waterman 算法（Meth. Mol. Biol. 70:173-187 (1997);和 BLASTP，BLASTN 和 BLASTX 算法（详见Altschul等（1990) J. Mol. Biol. 215:403-410)。还存在使用这些算法的计算 机程序，其包括但不限于：ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件或WU-BLAST-2 (Altschul等， Meth.Enzym.，266:460-480 (1996));或 GAP，BESTFIT，BLAST (Altschul 等），supra，FASTA 和 TFASTA，Genetics Computing Group(GCG)市售程序包，第 8 版本，Madison，威斯康星州， 美国；和在 PC/Gene 程序中的 CLUSTAL，Intelligenetics，Mountain View，加州。本领域技 术人员可以确定测量排布的适宜参数，包括在对比的序列的长度上实现最大排布的算法。 优选地，使用程序确定的默认参数确定序列的等同性。特别地，序列一致性的确定可以通过 Smith-Waterman 的同源查找算法（Meth. Mol. Biol. 70:173-187 (1997))置入 MSPRCH 程序 (Oxford Molecular)，使用具有以下检索参数的仿射空位罚分：空位开设罚分12,空位拓展 罚分1。优选地，可以使用威斯康星州麦迪逊市的Genetics Computer Group，Inc.的GCG 序列分析软件程序包的GAP程序，使用矩阵62 (blosum62)的氨基酸取代矩阵，其具有空位 权重12,长度权重2,进行配对氨基酸的对比。至于最佳的两种氨基酸序列的排布，变体氨 基酸序列的连续片段相对于参照的氨基酸序列可具有额外的氨基酸残基或缺失的氨基酸 残基。用于与参照的氨基酸序列对比的连续片段将包括至少20个连续的氨基酸残基，可以 是30、40、50或更多的氨基酸残基。可以通过指派空位罚分更正与衍生物的氨基酸序列中 存在空位相关联的序列一致性的增加。
[0025] 根据本发明，具有相同活性的酶（0ΗΒ还原酶、或将高丝氨酸的伯氨基转化为羰基 以获得OHB的酶）至少50 %、70 %或85 %的氨基酸序列相同，优选至少约85 %的氨基酸序 列相同，更优选至少约90 %的氨基酸序列相同，甚至更优选至少约95 %的氨基酸序列相同 并且还更优选98 %的氨基酸序列相同。优选地，任意"保守氨基酸取代"的氨基酸取代使 用L-氨基酸，其中一个氨基酸通过另一种生物上近似的氨基酸替代。保守氨基酸取代避免 了被取代的氨基酸的一般的消耗、疏水性/亲水性和/或位阻效应。保守取代的例子是在 以下基团之间的取代：Gly/Ala、Val/Ile/Leu、Lys/Arg、Asn/Gln、Glu/Asp、Ser/Cys/Thr 和 Phe/Trp/Tyr。例如，衍生物的区别在仅I至10个氨基酸残基的不同，如6-10个，仅5个， 仅4、3、2或甚至1个氨基酸残基。
[0026] 术语，功能变体包括，与本申请具体描述的序列相比，可能存在基本序列变体的但 仍然保留原始酶活性的酶。
[0027] 这也表示，酶的序列可能包括至少比原始酶更少的氨基酸但是所述的截短型酶仍 然保持原始酶的活性。
[0028] 就本发明的一方面而言，提升了催化本发明方法的第一步和/或第二步的酶的活 性。这种提升可以通过如实施例1或4所述的酶试验测量。
[0029] 可以通过至少一种突变获得所述酶的改变，所述突变（i)改进了分别用于高丝氨 酸或OHB改性酶的活性和/或底物的亲和力，和或（ii)降低了用于其天然底物的改性的酶 的活性和/或底物的亲和力。
[0030] 在本发明中，术语"改善活性和/或底物的亲和力"表示在突变之前，酶
[0031] -不能使用底物，和/或
[0032] -以至少低三倍的最大特异速率合成反应产物，和/或
[0033] -具备至少低三倍的高丝氨酸或OHB的亲和力，和/或
[0034] -具备至少高三倍的天然底物的最大特异活性，和/或
[0035] -具备至少高三倍的天然底物亲和力
[0036] 就本发明的又一方面而言，其包括编码催化本发明所述方法的第一步和第二步的 酶的核苷酸序列。
[0037] 就本发明甚至更特定的方面而言，所述OHB还原酶通过以下核酸序列编码：SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 11、SEQ ID No. 13、SEQ ID No. 287、SEQ ID No. 29、SEQ ID No. 31、SEQ ID No. 101、SEQ ID No. 103、 SEQ ID No. 105、SEQ ID No. 107、SEQ ID No. 109、SEQ ID No. 111、SEQ ID No. 113、SEQ ID No. 115、或SEQ ID No. 117或通过与所述序列至少50%同源的任意序列编码。
[0038] 根据本发明的OHB还原酶特别对应（L)-乳酸脱氢酶A，其与野生类型的酶相比，在 V17、Q85、E89、1226或A222中的至少一个位置包括至少一个突变。在乳酸脱氢酶家族中， 这些位置被保护，本文中，其定义参照乳酸链球菌（L)-乳酸脱氢酶A (SEQ ID No. 6)。本领 域技术人员通过对应的氨基酸序列的排布将易于确定在其他乳酸脱氢酶中的对应的氨基 酸残基。因此，本发明还提供了在其他乳酸脱氢酶中这些氨基酸的变化。
[0039] 根据本发明的OHB还原酶特别对应（L)-苹果酸脱氢酶，其与野生类型的酶相比， 在112、R81、M85、D86、V93、G179、T211或M227中的至少一个位置包括至少一个突变。在 苹果酸脱氢酶家族中，将这些位置保护，本文中，其定义参照大肠杆菌（L)-苹果酸脱氢酶 (SEQ ID No. 2)。本领域技术人员通过对应的氨基酸序列的排布将易于确定在其他苹果酸 脱氢酶中的对应的氨基酸残基。因此，本发明还提供了在其他苹果酸脱氢酶中这些氨基酸 的变化。
[0040] 根据本发明，"核酸序列"表示单链或双链形式的DNA或RNA分子，优选DNA分子。 本文中使用的"分离的DNA"，表示不是天然产生或不再处于其原始存在的天然环境中的 DNA，例如，与嵌合基因中的其他控制元素相关联的DNA编码序列，传输入其他寄主细胞中 的DNA、或与任意天然产生的DNA序列相比具有不同核酸序列的人造的、合成制备的DNA序 列。
[0041] 本发明还涉及嵌合基因，其包括功能上的相互连接、至少一种在寄主生物中作用 的启动子、编码任意催化如本发明中定义的方法的第一步和第二步的酶的多核苷酸和在同 一寄主生物中作用的终止元素。嵌合基因可能包括的各种元素是，首先，控制蛋白质的转 录、翻译和成熟的元素，如启动子、信号肽或转运肽的序列、或组成多腺苷酸化信号的终止 元素，和其次，编码蛋白质的多核苷酸。术语"功能上相互连接"表示所述嵌合基因的元素 互相连接，使得这些元素中任一元素的功能能被另一元素影响。例如，启动子与编码序列功 能连接，其能影响所述编码序列的表达。根据本发明的嵌合基因的构建和其各种元素的组 合可以通过使用本领域技术人员熟知的技术实现。组成嵌合基因的控制元素的选择主要取 决于寄主生物，其在所述生物中必须起作用，本领域技术人员能够选择在给定寄主生物中 的功能性控制元素。术语"功能性"用以表示在给定寄主生物中能够作用。
[0042] 根据本发明，所述嵌合基因可能包含的启动子是组合型或诱导型。例如，用于在 细菌中表达的启动子可选自以下所述的启动子。用于大肠杆菌中表达的可以是lac、trp、 lpp、phoA、recA、araBAD、prou、cst-1、tetA、cadA、nar、tac、trc、Ipp-lac、Psyn、cspA、PL、 ?1^-96-50、卩1?^、了7、人？1^^7、了3-1&(3、了5-1&(3、了4基因 32、即--1&(3、￥他和蛋白质八的 启动子或Ptrp启动子（WO 99/64607)。用于革兰氏阳性菌如棒状杆菌或链霉菌中表达的 可以是例如PtipA或PSl和PS2 (FR91/09870)启动子或在申请EP0629699A2中所述的启动 子。用于酵母菌和真菌中表达的可以是乳酸克鲁维酵母PLAC4启动子或乳酸克鲁维酵母 Ppgk启动子（专利申请FR 91/05294)，里氏木霉tefl或cbhl启动子（W0 94/04673)，青霉 菌his、csl或apf启动子（W0 00/68401)和曲霉属真菌的niger gla启动子。
[0043] 根据本发明，所述嵌合基因还可以包括其他控制序列，其位于启动子和编码序列 之间，如转录激活子（增强子）。
[0044] 如此，本发明的嵌合基因在特定的实施方案中，转录方向上，至少包括功能上的相 互连接、在寄主生物中的功能性启动子控制序列、将以编码催化如本发明所定义的方法的 第一步和第二步的任意酶的多核苷酸编码的核酸序列和在所述寄主生物中起作用的终止 子控制序列。
[0045] 本发明还涉及包括根据本发明的嵌合基因或本发明的核酸序列的克隆体和/或 表达载体。根据本发明的载体用于将寄主生物转化并在此生物中表达任意催化本发明的方 法中第一和/或第二步的酶。此载体可以是质粒、粘粒、噬菌体或病毒。优选地，根据本发明 的转化载体是质粒。通常，所述载体的主要品质应能在寄主生物的细胞中自我保持并自我 复制（特别是凭借存在复制源）并表达任意催化本发明方法中第一步和/或第二步的酶。 出于寄主生物的稳定转化的目的，所述载体还可以融入基因组。此类载体的选择，以及根据 本发明将嵌合基因插入此载体的技术是本领域技术人员的公知常识的一部分。有利地，除 了根据本发明的嵌合基因，在本发明中使用的载体还包括，编码可选标记的嵌合基因。此可 选标记使得有可能选择有效转化的寄主生物，即其中加入载体的生物。根据本发明的特定 实施方案，待转化的寄主生物是细菌、酵母菌、真菌。可以使用的可选标记是包含抗生素耐 受基因的标记，例如，潮霉素磷酸转移酶基因。其他标记基因可以是补充营养缺陷的基因， 如pyrA、pyrB、pyrG、pyr4、arg4、argB和trpC基因，钼噪呤合酶或乙酰胺酶基因。可以是 编码已经确定的酶，如GUS酶的基因，或在转化的细胞中编码色素或控制色素产生的酶的 基因，所述可选标记的基因特别记载在专利申请W091/02071、W095/06128、W096/38567和 W097/04103。
[0046] 本发明还涉及改性微生物。
[0047] 更特别地，本发明的改性微生物实现了从高丝氨酸分两步制备2, 4-DHB，其包括：
[0048] -第一步，将高丝氨酸的伯氨基转化为羰基以获得2-氧代-4-羟基丁酸盐，和
[0049]-第二步，将所获得的2-氧代-4-羟基丁酸还原，以获得2, 4-二羟基丁酸盐。 [0050] 在所述两个步骤中涉及的酶是如上所述的酶。
[0051] 术语"微生物"用以表示更低级的单细胞生物，根据本发明，其中引入嵌合基因、核 酸或载体从而制备2, 4-DHB。优选地，寄主生物是微生物，特别是真菌，例如青霉菌、曲霉菌 和更优选黄曲霉、金孢子菌或木霉属，酵母菌，特别是酵母科、毕赤酵母科或裂殖酵母科，最 优选酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母或杰丁毕赤酵母、树干 毕赤酵母或巴斯德毕赤酵母，细菌，优选选自肠杆菌科、梭菌科、芽孢杆菌科、链霉菌科、链 球菌科、甲基杆菌科和棒状杆菌科，最优选大肠杆菌、枯草杆菌、谷氨酸棒状杆菌、丙酮丁醇 梭菌、扭脱甲基杆菌或乳酸链球菌。
[0052] 本发明还涉及改性的微生物，其包含至少一种根据本发明的嵌合基因，所述嵌合 基因合并入其基因组或者由染色体外基因元素，例如质粒携带。在本发明更特别的方面，转 化的寄主生物包括所述发明的编码多肽的核酸，所述多肽将高丝氨酸的伯氨基转化为羰 基以获得OHB，和/或编码多肽的核酸，所述多肽在2, 4-DHB中还原OHB或嵌合基因，其包 含编码多肽的核酸，所述多肽将高丝氨酸的伯氨基转化为羰基以获得OHB，和/或OHB还原 酶或表达载体，其包括编码多肽的核酸，所述多肽将高丝氨酸的伯氨基转化为羰基以获得 0ΗΒ，或具有OHB酶还原活性的多肽。
[0053] 本发明的另一方面在于，高丝氨酸向DHB转化的合成途径在微生物中表达，高丝 氨酸的产量提升。微生物中高丝氨酸产量的提升可以如下实现（i)过度表达酶，天冬氨酸 激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶和高丝氨酸脱氢酶，（ii)通过使天冬氨酸激酶对可由赖氨酸、蛋 氨酸或苏氨酸带入的产品的抑制不敏感和（iii)通过删除高丝氨酸的生物合成途径的分 支代谢途径。天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶和高丝氨酸脱氢酶的过度表达可以在适 宜组合型启动子或诱导型启动子的控制下，通过表达来自多拷贝质粒的酶实现。任选地，所 述酶的过度表达可以通过删除限制编码天冬氨酸激酶、天冬氨酸半醛脱氢酶和高丝氨酸脱 氢酶的基因转录的转录抑制因子实现。通过在其氨基酸序列中引入适宜的突变，可使天冬 氨酸激酶对由天冬氨酸衍生的氨基酸抑制不敏感。将高丝氨酸生物合成途径分解的进入代 谢途径的侵入点通过具有0-琥珀酰高丝氨酸或0-乙酰高丝氨酸合成酶活性（进入蛋氨酸 生物合成）、高丝氨酸激酶活性（进入苏氨酸生物合成）活性的酶催化，或二氨基庚二酸脱 羧酶活性（进入赖氨酸生物合成）。编码具有所述酶活性的基因的缺失避免了天冬氨酸衍 生的氨基酸的形成并因此有助于高丝氨酸的形成。
[0054] 相应地，在大肠杆菌中删除metA、thrB和IysA基因减弱了将高丝氨酸生物合成途 径的分支途径。可以通过例如过度表达双功能天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶突变体thrA S345F(对于苏氨酸的抑制不敏感）和asd(两种基因都来自大肠杆菌）；或通过过度表达单 功能天冬氨酸激酶突变体IysC E250K(对于赖氨酸不敏感），asd(两种基因都来自大肠杆 菌）和来自酿酒酵母的高丝氨酸脱氢酶基因 H0M6来实现在大肠杆菌中高丝氨酸途径的酶 的活性的提尚。
[0055] 本发明的微生物还可以具有较低的输出高丝氨酸的能力，提高此氨基酸的细胞 内供给性。为了实现减少高丝氨酸从细胞输出，可以删除能输出高丝氨酸的透性酶。所 述透性酶可以通过在微生物中过度表达基因库和在高丝氨酸或结构上近似的氨基酸如 苏氨酸、赖氨酸或天冬氨酸的抑制浓度下培养所述微生物来确定（Zakataeva等，1999/ FEBSLett/452/228-232)。其过度表达能实现任意所述氨基酸的更高浓度下的生长的基因， 有可能参与高丝氨酸的输出。
[0056] 另一方面，本发明的微生物是携带在高丝氨酸外流性转运子rhtA、rhtb和/或 rhtC中缺失的大肠杆菌.
[0057] DHB的高效生产可以通过在不考虑DHB合成的辅助因子供给的优化下，优化寄主 生物的代谢网中碳通量的重新分配，并减弱导致代谢副产物而非DHB形成的竞争途径来确 保。用于改良菌株的关键方法提供了约束性流量平衡分析。此方法实现了计算取决于培养 条件的给定代谢网的理论产量，并易化了用于过度表达或删除的代谢目标的确定。描述了 用于代谢目标反应的过度表达和删除的实验技术（实施例8)。
[0058] 相应地，本发明的微生物也可以表现出增强的酶的活性，所述酶选自磷酸烯醇丙 酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、异柠檬酸裂合酶、丙酮酸羧化酶和己糖同向转运透 性酶和/或至少一种减弱的酶的活性，所述酶选自乳酸脱氢酶、乙醇脱氢酶、乙酸激酶、磷 酸乙酰基转移酶、丙酮酸氧化酶、异柠檬酸裂合酶、延胡索酸酶、2-酮戊二酸脱氢酶、丙酮 酸激酶、苹果酸酶、磷酸葡萄糖异构酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、 丙酮酸甲酸裂解酶、琥珀酸半醛脱氢酶、转运糖的转磷酸酶、酮羟基戊二酸醛缩酶、高丝氨 酸-〇-琥珀酰转化酶、高丝氨酸激酶、高丝氨酸流出物转运体、二氨基庚酸脱羧酶和/或甲 基乙二醛合成酶。
[0059] 另一方面，本发明的微生物是大肠杆菌，其过度表达至少一种选自如下的基因来 自大肠杆菌的ppc、pck、aceA、galP、asd、thrA、metL、IysC ;来自乳酸链球菌的pycA，和/ 或删除了至少一种选自 ldhA、ldhE、ackA、pta、poxB、focA、pf IB、sad、gabABC、sfcA、maeB、 ppc、pykA、pykF、mgsA、sucAB、ptsl、ptsG、pgi、fumABC、aldA、lldD、iclR、metA、thrB、lysA、 eda、rhtA、rhtB、rhtC 的基因。
[0060] 本发明还涉及2, 4-DHB的制备方法，其包括以下步骤
[0061] -在适宜的培养介质中培养本发明的改性微生物，
[0062] -从培养介质中回收2, 4-DHB。
[0063] 可以将所述2,4-DHB进一步纯化。
[0064] 产品的分离和纯化是非常重要的因素，其严重影响了整个过程的效率和产品成 本。产品回收的方法通常包括细胞分离以及分别产品纯化、浓缩和干燥的步骤。
[0065] 细朐分离
[0066] 可以使用超过滤和离心来将细胞从发酵介质中分离。从发酵介质中分离细胞常因 较高的介质粘度而复杂化。因此，我们可以加入活性剂（如矿物酸或碱金属盐），或加热液 体培养基来优化细胞分离。
[0067] 产品回收
[0068] 可以在移除生物质之前或之后应用各种离子交换的层析法分离DHB。其包括使用 初级阳离子交换树脂，其根据他们的等电点促进产品的分离。通常，树脂充满溶液，将残留 的产品分别洗脱，之后提高洗脱液的PH(例如，通过加入氢氧化铵）。另一种可能是使用固 定或模拟移动床树脂的离子交换层析法。为了获取充分的产品纯度，可能需要组合不同的 层析步骤。这些纯化方法与昂贵的结晶方法相比是更为经济的，并且，就最终产品的形式而 言，提供了额外的优势和灵活性。
[0069] 产品浓缩和干燥
[0070] 纯化方法还可以包括干燥步骤，其可能涉及任意适宜的干燥方式，如喷雾造粒机、 喷雾干燥机、转鼓式干燥剂、旋转干燥器和隧道式干燥室。浓缩的DHB溶液可以通过在蒸汽 降压下，130°C，使用多用途浓缩器或薄膜蒸发器加热发酵液体培养液获得。

【专利附图】

【附图说明】
[0071] 图1 :从高丝氨酸制备2, 4-DHB的方法，其包括两部，第一步，将高丝氨酸的伯氨基 转化为羰基以获得OHB，第二步，将所获得的OHB还原为2, 4-DHB。
[0072] 图2 :在位置Q85突变的纯化的乳酸链球菌乳酸脱氢酶的特异活性。（A)OHB上的 特异活性，（B)丙酮酸上的特异活性，（C)在OHB和丙酮酸上的最大V值的比值表达的底物 的特异性。图C中大于1的值表示对于OHB优选的（在用于0-50mM的OHB或丙酮酸的突 变的酶的底物上都没有获得酶活性的饱和）。在20mM的底物浓度下测量活性。
[0073] 图3 :在位置R81突变的纯化的大肠杆菌乳酸脱氢酶的特异活性。（A) OHB上的特 异活性，（B)草酰乙酸的特异活性。在20mM的OHB或0. 5mM的草酰乙酸的底物浓度下测量 活性。
[0074] 以下非限制性实施例说明本发明。 实施例
[0075] 实施例I :0ΗΒ还原酶活性的展示
[0076] 包含编码乳酸脱氢酶或苹果酸脱氢酶的野生型基因的质粒的构建：
[0077] 将编码大肠杆菌中（L)-苹果酸脱氢酶，Ec-mdh(SEQ ID No. 1)，大肠杆菌中 (D)-乳酸脱氢酶，Ec-IdhA(SEQ ID No. 3)、乳酸链球菌的（L)-乳酸脱氢酶，Ll-IdhA(SEQ IDN0.5)、枯草杆菌的（L)-乳酸脱氢酶、BS-ldh(SEQIDN0.7)、嗜热脂肪土芽孢杆 菌的（L)-乳酸脱氢酶，Gs-ldh(SEQ ID No.9)，穴兔的（L)-乳糖脱氢酶的两种亚型， Oc-ldhA(SEQ ID No. 11和SEQ ID No. 13)的基因，PCR扩链，其使用高保真的聚合酶 Phusion?(Fermantas)和表1中列出的引物，大肠杆菌MG1655、乳酸链球菌IL1403和枯草 芽孢杆菌链168的基因组作为模板。密码子优化基因 Oc-IdhA和Gs-Idh以在大肠杆菌中表 达并通过MWG Eurofins合成。引物引入了分别在起始密码子上游和终止密码子下游的限 制位点（表1)，使用T4DNA连接酶（Fermantas)消化的PCR产品连接入pET28a+(Novagen) 表达载体相应的位点简易化。将连接产物转化入大肠杆菌DH5a细胞（NEB)。将形成 的 pET28-Ec-mdh、pET28-Ec-ldhA、pET28-Ll-ldhA、pET28-Bs-ldh、pET28-Gs-ldh 和 pET28-〇c_ldhA质粒分离并通过DNA序列表示，以分别包含大肠杆菌mdh、大肠杆菌ldhA、大 肠杆菌IdhA、枯草芽孢杆菌Idh、嗜热脂肪地芽孢杆菌Idh和穴兔IdhA基因的正确的全长 序列。对应的蛋白序列通过 SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 6、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 10、SEQ ID No. 12 和 SEQ ID No. 14 表示。
[0078] 表1 :用于候诜酶的扩链和克降的引物序列和限制位点
[0079]

【权利要求】
1. 一种从高丝氨酸制备2, 4-二哲基了酸盐（等同于2, 4-二哲基了酸）的方法，其包 括两个步骤： -第一步，将高丝氨酸的伯氨基转化为幾基W获得2-氧代-4-哲基了酸盐，和 -第二步，将所获得的2-氧代-4-哲基了酸盐（0皿）还原为2, 4-二哲基了酸盐。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述第一步和/或第二步通过内源基因或外源基 因编码的酶来催化。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一步分别通过具有高丝氨酸转氨酶、高 丝氨酸脱氨酶或高丝氨酸氧化酶活性的酶催化。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述具有高丝氨酸转氨酶活性的酶是通过基因 ilvE、tyrfk aspC、araT、bcaT、AR08 编码。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中所述具有高丝氨酸转氨酶活性的酶是通过SEQ ID No. 59、沈Q ID No. 61、沈Q ID No. 63、沈Q ID No. 65、沈Q ID No. 67或沈Q ID No. 69或与所 述序列至少50%同源的任意序列编码或对应SEQ ID No. 60、SEQ ID No. 62、SEQ ID No. 64、 SEQ ID No. 66、SEQ ID No. 68、SEQ ID No. 70或与所述序列至少50%同源的任意序列所编 码。
6. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第二步通过具有0皿还原酶活性的酶催 化。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述具有0皿还原活性的酶是乳酸脱氨酶、或苹果 酸脱氨酶、或支链2-哲基酸脱氨酶。
8. 根据权利要求6或7所述的方法，其中所述0皿还原酶是来自大肠杆菌的值)-乳酸 脱氨酶、来自乳酸链球菌、穴兔、嗜热脂肪±芽抱杆菌、或枯草杆菌的（L)-乳酸脱氨酶、来 自大肠杆菌的（L)-苹果酸脱氨酶、来自乳酸链球菌的支链值)-2-哲基酸脱氨酶或其同系 物。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述0皿还原酶是 -乳酸脱氨酶，其包括在位置V17、Q85、E89、1226或A222有至少一个突变，所述位置参 照乳酸链球菌乳酸脱氨酶（SEQ. ID No. 6)定义 -苹果酸脱氨酶，其包括在位置112、R81、M85、D86、V93、G179、T211或M227有至少一 个突变，所述位置参照大肠杆菌苹果酸脱氨酶（SEQ ID No. 2)定义。
10. 根据权利要求8或9所述的方法，其中所述0皿还原酶 -通过沈Q ID No. 2、沈Q ID No. 4、沈Q ID No. 6、沈Q ID No. 8、沈Q ID No. 10、沈Q ID No. 12、沈Q ID No. 14、沈Q ID No. 288、SEQ ID No. 30、沈Q ID No. 32、沈Q ID No. 102、 沈Q ID No. 104、SEQ ID No. 106、SEQ ID No. 108、SEQ ID No. 110、SEQ ID No. 112、SEQ ID No. 114、SEQ ID No. 116或SEQ ID No. 118所表示或通过与所述序列至少50%同源的任意 序列所表示 -通过核酸编码，所述核酸通过序列SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 3、SEQ ID No. 5、SEQ ID No. 7、SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 11、沈Q ID No. 13、沈Q ID No. 287、SEQ ID No. 29、沈Q ID No. 31、沈Q ID No. 101、SEQ ID No. 103、SEQ ID No. 105、SEQ ID No. 107、SEQ ID No. 109、 SEQ ID No. IIUSEQ ID No. 113、SEQ ID No. 115 或 SEQ ID No. 117 所表示或通过与所述序 列至少50%同源的任意序列所表示。
11. 一种用于从高丝氨酸制备2, 4-D皿的改性微生物，其包括两个步骤，在于/包括： -第一步，将高丝氨酸的伯氨基转化为幾基W获得2-氧代-4-哲基了酸盐，和 -第二步，将所获得的2-氧代-4-哲基了酸还原为2, 4-二哲基了酸盐。
12. 根据权利要求11所述的改性微生物，其中催化第一步和第二步的酶是权利要求 2-10中所述的酶。
13. 根据权利要求11或12所述的改性微生物，其中，与同样的未转化的微生物相比，提 高了高丝氨酸的产量。
14. 根据权利要求11至13任一项所述的改性微生物，其中，提高了天冬氨酸激酶、天冬 氨酸半醒脱氨酶和/或高丝氨酸脱氨酶的活性。
15. 根据权利要求11至14任一项所述的微生物，其中，与同样的未转化的微生物相比， 提高了 2, 4-D皿的产量。
16. 根据权利要求11至15任一项所述的微生物是细菌，优选选自肠杆菌科、梭菌科、芽 抱杆菌科、链霉菌科、链球菌科、甲基杆菌科和椿状杆菌科，最优选大肠杆菌、枯草杆菌、谷 氨酸椿状杆菌、丙酬了醇梭菌、扭脱甲基杆菌或乳酸链球菌，或酵母菌，优选选自酵母科、毕 赤酵母科或裂殖酵母科，最优选酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维 酵母或杰了毕赤酵母、树干毕赤酵母或己斯德毕赤酵母，或真菌，优选选自青霉菌、曲霉菌 和更优选黄曲霉、金抱子菌或木霉属。
17. 根据权利要求11至16任一项所述的微生物，其中，增强了至少一种酶活性的表达， 所述酶选自磯酸締醇丙酬酸駿化酶、磯酸締醇丙酬酸駿激酶、异巧樣酸裂合酶、丙酬酸駿化 酶和己糖同向转运透性酶，和/或减少了至少一种酶活性的表达，所述酶选自乳酸脱氨酶、 己醇脱氨酶、己酸激酶、磯酸己酷基转移酶、丙酬酸氧化酶、异巧樣酸裂合酶、延胡索酸酶、 2-酬戊二酸脱氨酶、丙酬酸激酶、苹果酸酶、磯酸葡萄糖异构酶、磯酸締醇丙酬酸駿化酶、磯 酸締醇丙酬酸駿激酶、丙酬酸甲酸裂解酶、班巧酸半醒脱氨酶、转运糖的转磯酸酶、酬哲基 戊二酸醒缩酶、高丝氨酸-0-班巧酷转化酶、高丝氨酸激酶、高丝氨酸流出物转运体、二氨 基庚酸脱駿酶和/或甲基己二醒合成酶。
18. 根据权利要求16所述的微生物是大肠杆菌，其过度表达至少一个选自W下的 基因；来自大肠杆菌的ppc、pck、aceA、galP、asd、thrA、metL、lysC ;来自乳酸链球菌的 pycA，和/或缺失至少一个选自如下的基因，1化A、a化E、ackA、pta、poxB、focA、pflB、sad、 gabABC、sfcA、maeB、ppc、pykA、pykF、mgsA、sucAB、ptsl、ptsG、pgi、fumABC、aldA、lldD、 icl民、metA、thrB、lysA、eda、rthA、rthB、rthC。
19. 一种制备2, 4-D皿的方法，其包括W下步骤 -在适宜的培养介质中培养权利要求11至18任一项所述的改性微生物， -从培养介质中回收2, 4-D皿。
20. 根据权利要求19所述的方法，其中进一步纯化2, 4-D皿。
21. -种具有高丝氨酸转氨酶、高丝氨酸脱氨酶或高丝氨酸氧化酶活性的酶在0皿中 转化高丝氨酸的用途。
22. -种具有（L)-乳酸脱氨酶、（L)-苹果酸脱氨酶或2-哲基酸脱氨酶活性的酶在 2, 4-D皿中转化0皿的用途。
【文档编号】C12P7/42GK104471069SQ201380036661
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年7月10日 优先权日:2012年7月11日
【发明者】托马斯·瓦尔特, 伊莲娜·科迪尔, 克莱芒蒂娜·德雷赛尔, 让-玛丽·弗朗索瓦, 罗伯特·胡艾特 申请人:安迪苏法国联合股份有限公司