与cdk抑制剂相关的生物标志物的制作方法

与cdk抑制剂相关的生物标志物的制作方法
【专利摘要】本发明提供监测生物标志物的差异基因表达以确定患者对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKi)的敏感性的方法、确定细胞对CDKi的敏感性的方法、利用CDKi治疗患者的方法和筛选候选CDKi的方法。
【专利说明】与CDK抑制剂相关的生物标志物 发明领域
[0001] 本发明涉及药物基因组学领域，以及用于确定对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂 的细胞敏感性的生物标志物的用途，治疗方法和筛选化合物的方法。
[0002] 发明背景
[0003] 在1992年通过筛选会调节细胞周期，尤其是Gl-S期进展中，的基因首次克隆 了人细胞周期蛋白 D3 (CCND3) (Xiong 等，Genomics 1992, 13:575-584, Motokura 等，了· Biol. Chem. 1992,267:20412-20415)。其是三个D型细胞周期蛋白（细胞周期蛋白D1、D2 和D3)之一。发现，CCND3作为D型细胞周期蛋白会与细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4和 Q)K6装配，以形成促进细胞周期进展通过Gl的全酶（Bates等，Oncogene 1994,9:71-79)。 一旦经过Gl晚期，CCND3对细胞周期进展就不再是必需的（Sherr, Trends in Bio. Sci 1995, 20(5) 187-190) 〇
[0004] 结构上，CCND3含有细胞周期蛋白结构域和两个PEST结构域。PEST结构域用于 泛素介导的降解并且发现于细胞需要快速调节或更新的蛋白质中。PEST结构域富含脯氨 酸（P)、谷氨酸（E)、丝氨酸（S)和苏氨酸（T)残基，并且长度在12-60个氨基酸范围内。人 CCND3在氨基酸256-268 (含端点）和271-291 (含端点）处含有PEST结构域。在研宄PEST 结构域的作用中，研宄者已经发现CCND3中的单个等位基因 SNP导致氨基酸259处从丝氨 酸至丙氨酸的氨基酸改变（S259A)。S259A改变破坏PEST结构域，因此，当与未突变的等位 基因相比时，变体CCND3具有增加的稳定性（Savas等，OMICS 2007, 11 (2) :200-208)。
[0005] CCND3为淋巴细胞的发育所需。当产生CCND3敲除小鼠（CCND3-/-)以测试CCND3 功能（Sicinska等，Cancer Cell 2003,4(6):451-461)时，这些敲除小鼠不经历幼T细胞 的正常增殖，这是非常的组织特异性缺陷。为了说明CCND3在T细胞恶性肿瘤中起的作用， CCND3敲除小鼠与过量表达p56LCK(其展示大量的T细胞肿瘤）的小鼠杂交。表达野生 型CCND3/p56LCK的小鼠快速形成T细胞恶性肿瘤。相反，T细胞恶性肿瘤在CCND3敲除/ P56LCK小鼠中延迟6-8周。使用该数据研宄人恶性肿瘤，同一个团队使用siRNA方法以在 人T细胞急性成淋巴细胞性白血病（T-ALL)细胞系中敲低CCND3。在所测试的所有12个细 胞系中敲低CCND3显著抑制了细胞增殖，验证了小鼠数据并证明了 CCND3在人T细胞恶性 肿瘤中的重要性。
[0006] DNA测序技术的便利、速度和成本上的改善允许研宄者检查癌细胞完整基因组 的改变。采用该方法，两个团队进行了弥散性大B细胞淋巴瘤（DLBCL)的完整基因组 分析，以发现可能负责该癌症的特定基因和途径（Pasqualucci等，Nature Genetics 2011，43(9) :830-837:Morin 等，Nature2011, 476:298-303)。该方法在 3/54 所测试的 DLBCLs中发现了 CCND3突变。
[0007] 在该公开内容中，CCND3突变用作生物标志物或指示物，预测和靶定特异性疗法的 患者。寻找指示哪个患者应该接受治疗有用的生物标志物是有用的，尤其是在癌症方面。与 试错方法相反，这允许更及时并且更强效的治疗。此外，指示在施用后细胞继续对疗法敏感 的生物标志物的发现也是有用的。这些生物标志物可以用于监测接受治疗的那些患者的反 应。如果生物标志物指示患者已经对治疗开始不敏感，那么所施用的剂量可以增加、减少、 完全终止或是施用额外的治疗。如此，需要开发与细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK)抑制剂 相关的生物标志物。该方法保证正确的患者接受适当的治疗并且在治疗过程中，可以监测 所述患者持续的CDK抑制剂敏感性。
[0008] 在⑶K抑制剂的开发中，特异的生物标志物将帮助理解施用时的作用机制。所述 作用机制可涉及细胞周期中调节机制的复杂级联和差异基因表达。在药物开发的临床前阶 段完成该分析，以确定癌细胞对CDK抑制剂候选物的特定敏感性和候选物的活性。药效学 研宄中特别感兴趣的是鉴定特异标志物的敏感性和活性，如本文公开的那些。
[0009] 发明概沐
[0010] 本公开内容提供，细胞周期蛋白D3(此后为"CCND3"）PEST结构域中的突变在确 定细胞对细胞周期蛋白依赖性激酶4和/或细胞周期蛋白依赖性激酶6的抑制剂（此后为 "⑶Ki"）的敏感性中充当特定的生物标志物。本公开内容包括产生⑶Ki的"基因标签"的 CCND3突变分析，其在预测何种癌细胞对CDKi敏感中具有增加的准确性和特异性。所述方 法分析从患者获取的癌样品中PEST结构域中的CCND3突变，将其与非癌或正常对照相比较 并预测癌样品对CDKi的敏感性。CCND3突变的分析可以指示有利的反应或不利的反应。本 发明是"个性化医疗"的实例，其中基于对该个体特异的功能基因组标签治疗患者。
[0011] 还可以在利用⑶Ki治疗后使用CCND3突变的预测值来确定患者是否仍然对治疗 敏感。一旦已经施用⑶Ki治疗，CCND3突变可以用作生物标志物，以监测患者对⑶Ki治疗 的持续敏感性。这在确定患者接受正确的治疗过程中有用。本公开内容包括预测并监测患 者对CDKi治疗的敏感性的方法。所述方法包括向患者施用CDKi，分析从治疗患者获得的 生物样品上的CCND3突变并将其与非癌或正常样品中的CCND3进行比较的步骤。基于对 PEST结构域中CCND3突变的检测评估患者的反应。此外，与正常或野生型对照细胞相比，来 自含有CCND3突变的细胞的CCND3蛋白质表达水平的检测和/或改变预示患者对治疗的敏 感性。CCND3突变体蛋白质表达水平改变的模式可以指示有利的患者反应或不利的患者反 应。
[0012] 附图描沐
[0013] 图1是CCND3蛋白质和某些突变的图解。CCND3的PEST结构域是人CCND3的氨基 酸 256-268 和 271-291。
[0014] 图2A是含有野生型CCND3的细胞（其证明对⑶Ki (1)不敏感）的细胞活力图解。
[0015] 图2B是含有突变体CCND3的细胞（其证明对⑶Ki⑴敏感）的细胞活力图解。
[0016] 图2C是用⑶Ki (1)处理的野生型和突变CCND3细胞系的EC5tl值的盒形图。
[0017] 图3A是含有野生型CCND3的细胞（其证明对⑶Ki (2)不敏感）的细胞活力图解。
[0018] 图3B是含有突变体CCND3的细胞（其证明对⑶Ki⑵敏感）的细胞活力图解。
[0019] 图3C是用⑶Ki (2)处理的野生型和突变CCND3细胞系的EC5tl值的盒形图。
[0020] 图4A是含有野生型CCND3的细胞（其证明对⑶Ki (3)不敏感）的细胞活力图解。
[0021] 图4B是含有突变体CCND3的细胞（其证明对CDKi (3)不敏感）的细胞活力图解。
[0022] 图4C是用⑶Ki (3)处理的野生型和突变CCND3细胞系的EC5tl值的盒形图。
[0023] 图5A/B是Western印迹，其证明CCND3突变导致增加的蛋白质稳定性。
[0024] 图6A是Western印迹，其显示含有CCND3突变的细胞导致更高水平的CCND3突变 体蛋白质。
[0025] 图6B是野生型细胞系和含有CCND3突变的细胞系中mRNA表达的图示。
[0026] 发明描沐
[0027] 确定癌细胞对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDKi)的敏感性的方法，所述方 法包括：a)测定癌细胞中细胞周期蛋白D3(CCND3)突变；和b)比较CCND3突变与非癌或正 常对照细胞，其中癌细胞中CCND3突变的存在指示其对CDKi敏感。
[0028] 方法，其中癌细胞选自：弥散性大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、急性 成淋巴细胞性B细胞白血病和伯基特淋巴瘤。
[0029] 方法，其中CCND3突变位于PEST结构域中。
[0030] 方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO. 2的氨基酸256-268中的至少一个氨基酸改 变。
[0031] 方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO. 2的氨基酸271-292中的至少一个氨基酸改 变。
[0032] 方法，其中CCND3突变是表2中的任何突变。
[0033] 方法，其中CCND3突变选自：氨基酸290处的异亮氨酸至赖氨酸的改变（I290K)、 氨基酸290处的异亮氨酸至苏氨酸的改变（I290T)、氨基酸284处的脯氨酸至亮氨酸的改 变（P284L)、氨基酸284处的脯氨酸至丝氨酸的改变（P284S)，和氨基酸287处缬氨酸至天 冬氨酸的改变（V287D)。
[0034] 方法，其中CDKi选自表1。
[0035] 预测癌症患者对利用CDKi治疗的敏感性的方法，所述方法包括：a)测定从患者获 得的癌样品中的CCND3突变；和b)比较CCND3突变与非癌或正常对照样品，其中癌样品中 CCND3突变的存在指示患者对利用CDKi的治疗敏感。
[0036] 方法，其中癌样品选自：弥散性大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、急性 成淋巴细胞性B细胞白血病和伯基特淋巴瘤。
[0037] 方法，其中CCND3突变位于PEST结构域中。
[0038] 方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO. 2的氨基酸256-268中的至少一个氨基酸改 变。
[0039] 方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO. 2的氨基酸271-292中的至少一个氨基酸改 变。
[0040] 方法，其中CCND3突变是表2中的任何突变。
[0041] 方法，其中CCND3突变选自：氨基酸290处的异亮氨酸至赖氨酸的改变（I290K)、 氨基酸290处的异亮氨酸至苏氨酸的改变（I290T)、氨基酸284处的脯氨酸至亮氨酸的改 变（P284L)、氨基酸284处的脯氨酸至丝氨酸的改变（P284S)，和氨基酸287处缬氨酸至天 冬氨酸的改变（V287D)。
[0042] 方法，其中CDKi选自表1。
[0043] 方法，其进一步包括：c)测量从患者获得的癌样品中CCND3的差异蛋白质表达；和 d)比较癌样品中CCND3的蛋白质表达与非癌或正常对照样品的CCND3蛋白质表达，其中癌 样品中CCND3蛋白质的增加水平指示所述患者对利用CDKi的治疗敏感。
[0044] 利用CDKi治疗癌症患者的方法，所述方法包括：a)测定从患者获得的癌样品中的 CCND3突变；b)比较癌样品中的CCND3突变状态与非癌或正常对照样品中的CCND3突变状 态，其中CCND3突变的存在指示所述患者对利用CDKi的治疗敏感；c)向该患者施用CDKi ; 和d)测定肿瘤生长的抑制。
[0045] 方法，其中癌样品选自：弥散性大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、急性 成淋巴细胞性B细胞白血病和伯基特淋巴瘤。
[0046] 方法，其中CCND3突变位于PEST结构域中。
[0047] 方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO. 2的氨基酸256-268中的至少一个氨基酸改 变。
[0048] 方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO. 2的氨基酸271-292中的至少一个氨基酸改 变。
[0049] 方法，其中CCND3突变是表2中的任何突变。
[0050] 方法，其中CCND3突变选自：氨基酸290处的异亮氨酸至赖氨酸的改变（I290K)、 氨基酸290处的异亮氨酸至苏氨酸的改变（I290T)、氨基酸284处的脯氨酸至亮氨酸的改 变（P284L)、氨基酸284处的脯氨酸至丝氨酸的改变（P284S)，和氨基酸287处缬氨酸至天 冬氨酸的改变（V287D)。
[0051] 方法，其中以治疗有效量施用⑶Ki。
[0052] 方法，其中CDKi选自表1。
[0053] 筛选⑶Ki候选物的方法，所述方法包括：a)使含有CCND3突变的细胞与⑶Ki候 选物接触；b)测定细胞活力的降低；和c)比较来自与CDKi候选物接触的CCND3突变体细 胞的细胞活力的降低和与对照CDKi接触的CCND3突变体细胞的细胞活力的降低。
[0054] 方法，其中对照CDKi选自表1。
[0055] 方法，其中含有CCND3突变的细胞选自：弥散性大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴细胞 性白血病、急性成淋巴细胞性B细胞白血病和伯基特淋巴瘤。
[0056] 方法，其中CCND3突变位于PEST结构域中。
[0057] 方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO. 2的氨基酸256-268中的至少一个氨基酸改 变。
[0058] 方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO. 2的氨基酸271-292中的至少一个氨基酸改 变。
[0059] 方法，其中CCND3突变是表2中的任何突变。
[0060] 方法，其中CCND3突变选自：氨基酸290处的异亮氨酸至赖氨酸的改变（I290K)、 氨基酸290处的异亮氨酸至苏氨酸的改变（I290T)、氨基酸284处的脯氨酸至亮氨酸的改 变（P284L)、氨基酸284处的脯氨酸至丝氨酸的改变（P284S)，和氨基酸287处缬氨酸至天 冬氨酸的改变（V287D)。
[0061] 组合物，其包含用于在所选癌症患者群体中治疗癌症的⑶Ki，其中与正常对照细 胞样品相比，在从所述患者获得的癌细胞样品中显示CCND3突变的基础上选择癌症患者群 体。
[0062] 组合物，其中癌样品选自弥散性大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、急 性成淋巴细胞性B细胞白血病和伯基特淋巴瘤。
[0063] 用于预测癌症患者对利用CDKi治疗的敏感性的试剂盒，其包含：i)用于检测 CCND3突变的工具；和ii)怎样使用所述试剂盒的说明书。
[0064] 定义
[0065] 除非上下文明确说明，如说明书和权利要求中所用，单数形式"a"、"an"和"the" 包括复数参考。例如，术语"细胞"包括多个细胞，包括其混合物。
[0066] 所有的数字名称，例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围均是近似值，其以 〇. 1的增量（+)或（_)变化。应理解，尽管不总是明确说明，所有数字名称前面具有术语 "约"。还应理解，尽管不总是明确说明，本文描述的试剂仅是示例性的并且其等同物为本领 域所知。
[0067] 术语"标志物"或"生物标志物"在本文中可互换使用。生物标志物是核酸或多肽， 并且多肽突变或差异表达的存在或缺失用于确定对任何CDKi的敏感性。例如，CCND3是癌 细胞中的生物标志物，当其与正常（非癌）细胞或对照细胞中的CCND3相比被突变时。
[0068] 当与未处理的对照相比，利用⑶Ki治疗后细胞活力降低时，细胞对⑶Ki抑制"敏 感"或展示"敏感性"。
[0069] "CCND3"指细胞周期蛋白D3基因。除非另有明确说明，如本文所用的CCND3指人 CCND3,登录号 BC011616(CCND3 核酸（SEQ ID NO. 1))和 AAH11616(CCND3 蛋白质（SEQ ID NO. 2)) 〇
[0070] "野生型"、"正常"或"非突变体"指这样的CCND3序列，其包含检索号BCO11616/ AAHl 1616(分别为核酸（SEQ ID NO. 1)和蛋白质（SEQ ID NO. 2))。
[0071] "突变体"或"突变"是偏离野生型CCND3的DNA或蛋白质序列的任何改变。这包 括，但不限于：CCND3基因及其相应蛋白质的单碱基核酸改变或单氨基酸改变、插入、缺失 和截短。
[0072] "对照细胞"、"正常细胞"或"野生型"指非癌组织或细胞。
[0073] "对照组织"、"正常组织"或"野生型"指非癌组织或细胞。
[0074] 术语"核酸"和"多核苷酸"可以互换使用并且指任何长度的核苷酸的聚合形式，脱 氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行任 何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段（例如，探针、引物、EST或SAGE 标签）、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、 分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针，和引 物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可 以在多聚体组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中 断。多核苷酸可以在聚合后，如通过与标记的组分缀合来进一步修饰。所述术语还指双链 和单链分子。除非另外指明或要求，本发明的任何多核苷酸的实施方案包括双链形式和已 知的或预测构成双链形式的两条互补的单链形式的每一条链。
[0075] "基因"指含至少一个可读框（ORF)的多核苷酸，其在转录和翻译后能编码特定的 多肽或蛋白质。能将多核苷酸序列用于鉴定与其相关的基因的较大片段或全长编码序列。 分离较大片段序列的方法是本领域技术人员已知的。
[0076] "基因表达"或备选地"基因产物"指基因转录和翻译时产生的核酸或氨基酸（例 如，肽或多肽）。
[0077] 术语"多肽"可与术语"蛋白质"互换使用，并在广义上指两个或多个亚基氨基酸 (subunit amino acid)的化合物、氨基酸类似物或拟肽。亚基能通过肽键连接。在另一个 实施方案中，亚基可以通过其他键，例如酯、醚等连接。
[0078] 如本文中所用，术语"氨基酸"指天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，以及 D和L旋光异构体、氨基酸类似物和拟肽。如果肽链很短，那么通常将三个或三个以上氨基 酸的肽称为寡肽。如果肽链很长，那么通常将肽称为多肽或蛋白质。
[0079] 术语"分离的"意为是自天然状态下与多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段 通常相关的组分、细胞组分及其他分离的。例如，分离的多核苷酸与在自然或天然环境，例 如在染色体上通常与其相关的3'和5'连续核苷酸分离。本领域技术人员显而易见的是， 非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段并不需要"分离"，以将其与其天然 存在的对应物区分开来。此外，"浓缩的"、"分离的"或"经稀释的"多核苷酸、肽、多肽、蛋白 质、抗体或其片段可与其天然存在的对应物区分开来，因为与天然存在的对应物相比，每一 体积的浓缩物或者分子数在"浓缩的"形式中更多或者在"分离的"形式中更少。在一级序 列或者例如糖基化模式上不同于天然存在的对应物的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或 其片段并不需要以分离形式存在，因为可以通过一级序列或者备选地，通过另一特征如糖 基化模式与其天然存在的对应物区分开来。因此，将非天然存在的多核苷酸提供为不同于 分离的天然存在的多核苷酸的单独实施方案。将在细菌细胞中产生的蛋白质提供为区别于 从真核细胞分离的天然存在的蛋白质的单独实施方案，其中在天然状态下所述真核细胞产 生所述蛋白质。
[0080] 当在多核苷酸操作的上下文中使用时，"探针"指寡核苷酸，其提供为通过与靶标 杂交，检测可能存在于目的样品中的靶标的试剂。通常，探针包含标记或者杂交反应之前或 之后标记可以结合的方法。合适的标记包括但不限于，放射性同位素、荧光色素、化学发光 化合物、染料和蛋白质包括酶。
[0081] "引物"是通常具有游离的3' -OH基的短的多核苷酸，其通过与靶标杂交，与目的 样品中可能存在的靶标或"模板"结合，从而促进与靶标互补的多核苷酸的聚合。"聚合酶 链反应"（"PCR"）是这样的反应：使用由"上游"和"下游"引物组成的"一对引物"或"一 套引物"，聚合的催化剂如DNA聚合酶以及一般热稳定聚合酶，复制组成靶多核苷酸的拷贝。 PCR方法是本领域熟知的，并且例如在PCR :A Practical Approach，M. MacPherson等人， IRL Press at Oxford University Press (1991)中教导。产生多核苷酸的复制拷贝的全部 过程，例如PCR或基因克隆在本文中总称为"复制"。还可以将引物用作杂交反应，例如DNA 或 RNA 印迹分析中的探针（Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第 二版（1989))。
[0082] 如本文中所用，"表达"指DNA转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后翻译成 肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸来源于基因组DNA，表达可以包括真核细胞中mRNA 的剪接。
[0083] 当将"差异表达"应用于基因时，指从该基因转录和/或翻译的mRNA或者由该基 因编码的蛋白质产物的差异产生。与正常或对照细胞的表达水平相比，差异表达基因可以 是过量表达或者低表达（underexpress)。然而，如本文所用，过表达是基因表达的增加并且 一般是在正常或对照对应物细胞或组织中检测到的至少1. 25倍或，备选地至少1. 5倍或， 备选地至少2倍，或备选地至少3倍或备选地，至少4倍表达。如本文所用，低表达是基因 表达的降低并且一般低于在正常或对照对应物细胞或组织中检测到的至少I. 25倍或备选 地，至少1. 5倍或备选地，至少2倍或备选地，至少3倍或备选地，至少4倍表达。术语"差 异表达的"还指其中在癌细胞或癌组织中检测到表达，但在对照细胞或正常组织（例如非癌 细胞或组织）中不能检测到表达。
[0084] 由于基因的过量表达或基因拷贝数目的增加可以出现基因的高表达水平。由于负 调节物的失调或缺失，基因还可以被翻译至增加的蛋白质水平。最后，由于蛋白质增加的稳 定作用或减少的降解可以出现基因的高表达，导致蛋白质的积累。
[0085] "基因表达谱"或"基因标签"指至少一个生物标志物的表达模式，其在多个样品中 重现并且反映那些样品共有的性质，如突变、对特定治疗的反应、或细胞中特定生物学过程 或途径的激活。基因表达谱区分共有共同性质的样品和没有共同性质的那些样品，这比通 过将样品随机分配成两组实现的准确性更高。基因表达谱可以用于预测未知状态的样品是 否共有共同的性质。将预测生物标志物和典型谱之间的一些变异，但是生物标志物与典型 谱的整体相似性是这样的，在不共有生物标志物反映的共同性质的样品中偶然观察到相似 性在统计学上是不太可能。
[0086] 术语"cDNA"指互补DNA，即用酶如逆转录酶将细胞或生物中存在的mRNA分子制 备成cDNA。"cDNA"文库是细胞或生物中存在的全部mRNA分子的集合，用逆转录酶将所述 mRNA全部转变成cDNA分子，然后插入到"载体"（在添加外源DNA后可以继续复制的其他 DNA分子）中。用于文库的示例性载体包括噬菌体、感染细菌的病毒，如λ噬菌体。然后可 以针对特定的目的cDNA (和由此得到的mRNA)探测文库。
[0087] 如本文中所用，可互换使用的"固相支持物"或"固相支持体"并不限于特定类型的 支持体。相反，本领域普通技术人员可以获得并且已知大量的支持体。固相支持体包括硅 胶、树脂、衍生的塑料薄膜、玻璃珠、塑料珠、氧化铝凝胶、微阵列和芯片。如本文中所用，"固 相支持体"还包括合成的抗原呈递基质、细胞和脂质体。基于期望的最终用途和不同方案的 适用性，可以选择合适的固相支持体。例如，对于肽合成，固相支持体可以涉及树脂，例如聚 苯乙稀（例如，获自 Bachem Inc. ,Peninsula Laboratories 的 ΡΑΜ-r 树脂）、polyHIPE(R) ?树脂（获自Aminotech，加拿大）、聚酰胺树脂（获自Peninsula Laboratories)、用聚乙 二醇嫁接（graft)的聚苯乙稀树脂（TentaGelR?，Rapp Polymere，Tubingen，德国）或者聚 二甲基丙稀酰胺树脂（获自 Milligen/Biosearch，California)。
[0088] 还可以将多核苷酸与固相支持体连接，用于高通量筛选测定。例如，PCT WO 97/10365公开了高密度寡核苷酸芯片的构建。也参见，美国专利No. 5, 405, 783 ;5, 412, 087 和5, 445, 934。使用该方法，在衍生的玻璃表面上合成探针，以形成芯片阵列。将光保护的 核苷亚磷酰胺偶联至玻璃表面，经光刻用掩模通过光解选择性去保护，并与第二个所保护 的核苷亚磷酰胺反应。重复偶联/去保护过程，直到完成期望的探针。
[0089] 作为实例，通过使用基于芯片如Affymetrix? HG-U133-Plus-2GeneChips (Aff ymetrix, Santa Clara, CA)来测量信使RNA的水平，可以评估转录活性。因此，在可重复的 系统中，有可能高通量、实时定量大量目的基因的RNA。
[0090] 术语"严格杂交条件"指这样的条件，在所述条件下核酸探针可以与其靶序列特异 性杂交，而不与其他序列杂交。确定杂交的严格性的条件包括：温度、离子强度和变性剂如 甲酰胺的浓度。改变这些因素之一会影响另一因素，并且本领域技术人员理解，可以改变条 件以维持期望的严格水平。高度严格杂交的实例是：65°C -68°C，0.015M氯化钠、0.0015M 柠檬酸钠或者42°C，0. 015M氯化钠、0. 0015M柠檬酸钠和50%甲酰胺（参见Sambrook，上 文）。"中等严格"杂交的实例是条件：50°C -65°C，0. 015M氯化钠、0. 0015M柠檬酸钠或者 37°C -50°C，0. 015M氯化钠、0. 0015M柠檬酸钠和20%甲酰胺。当期望适量的核酸错配时， 使用中等严格条件。本领域技术人员理解，洗涤是杂交条件的一部分。例如，洗涤条件可以 包括02.X-0. IX SSC/0. 1%SDS和42°C_68°C的温度，其中增加温度增加了洗涤条件的严格 性。
[0091] 当在两条单链多核苷酸之间以反向平行构型发生杂交时，称该反应为"退火"，并 且将这些多核苷酸描述为"互补"。如果在第一多核苷酸的链之一和第二多核苷酸之间发生 杂交，那么双链多核苷酸与另一多核苷酸可以是"互补的"或者"同源的"。根据通常公认的 碱基配对规则，按照相对链中期望彼此形成氢键的碱基的比例，可以量化"互补性"或"同源 性"（一种多核苷酸与另一多核苷酸互补的程度）。
[0092] 多核苷酸或多核苷酸区（多肽或多肽区）与另一序列具有"序列同一性"的确定 百分比（例如，80%、85%、90%、95%、98%或99%)指的是，当比对时，在比较的两个序列 中，碱基（或氨基酸）的百分比是相同的。可以使用本领域已知的软件程序，例如Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 等人，eds.，（1987) Supplement 30, section 7. 7. 18, Table7. 7. I中描述的那些程序进行这种比对并确定同源性和序列同一性百分比。 优选地，将默认参数用于比对。优选的比对程序是BLAST，并使用默认参数。特别地，优选的 程序是BLASTN和BLASTP，且使用以下的默认参数：遗传密码=标准；过滤=无；链=两条； 截断=60 ;期望值=10 ;Matrix = BL0SUM62 ;描述=50个序列；排序=高得分；数据库= 非冗余的。
[0093] 术语"细胞增殖性病症"应当包括表征为异常细胞生长和/或分裂或者功能丧失 的正常生理功能的调节异常。"细胞增殖性病症"的实例包括但不限于，增生、瘤形成、组织 转化或多种自身免疫病症，例如以T细胞凋亡的调节异常为特征的那些疾病。
[0094] 如本文中所用，术语"赘生性细胞"、"肿瘤性疾病"、"瘤形成"、"肿瘤"、"肿瘤细胞"、 "癌症"、"癌细胞"（可互换使用）指表现出相对自主生长的细胞，以致它们表现出以细胞增 殖控制（即，下调细胞分裂）的显著丧失为特征的异常生长表型。赘生性细胞可以是恶性 的或者良性的。"转移的细胞或组织"指的是细胞可以侵入并破坏邻近的机体结构。癌症可 以包括但不限于弥散性大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性B 细胞白血病和伯基特淋巴瘤。
[0095] 术语"PBMC"指外周血单核细胞，并包括"PBL外周血淋巴细胞。
[0096] "抑制"肿瘤生长或肿瘤生长的"抑制"表示当与未与⑶Ki化合物接触的肿瘤生长 相比，与CDKi接触时肿瘤细胞生长的减慢。可以通过本领域已知的任何方法评估肿瘤细胞 生长，其包括但不限于测量肿瘤大小、使用3H-胸苷掺入测定法确定肿瘤细胞是否正在增 殖、通过FDG-PET (氟代脱氧葡萄糖正电子成像术）成像测量葡萄糖吸收、或者计数肿瘤细 胞。"抑制"肿瘤细胞生长指的是以下状态的任一种或者全部：减缓、延迟和终止肿瘤生长， 以及肿瘤缩小。
[0097] "组合物"是活性剂和另一载体的组合，所述载体例如惰性的（例如，可检测的试剂 或标记）或者有活性的化合物或组合物，如佐剂、稀释剂、结合剂、稳定剂、缓冲液、盐、亲脂 溶剂、防腐剂、辅助剂等。载体还可以包含单独的或者组合的按重量或体积为1-99. 99%的 药物赋形剂和添加剂，例如：可以单独或者组合存在的蛋白质、肽、氨基酸、脂和糖（例如， 糖，包括单糖和寡糖；衍生的糖如糖醇、糖醛酸、酯化的糖等；以及多糖或糖聚合物）。糖赋 形剂包括例如，单糖如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖如乳糖、蔗 糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖如蜜三糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇如 甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、拉克替醇、木糖醇山梨糖醇（葡萄糖醇）和肌醇。
[0098] 示例性蛋白质赋形剂包括血清白蛋白例如人血清白蛋白（HSA)、重组人白蛋白 (rHA)、明胶、酪蛋白等。也可以在缓冲容量中发挥功能的代表性氨基酸/抗体组分包括丙 氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮 氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。
[0099] 术语"载体"还包括缓冲剂或pH调整剂；一般地，缓冲剂是由有机酸或碱制备的 盐。代表性缓冲剂包括有机酸盐如柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙 酸或苯二甲酸的盐；Tris、氨丁三醇盐酸盐（tromethamine hydrochloride)或磷酸盐缓冲 液。其他载体包括聚合的赋形剂/高分子添加剂如聚乙烯吡咯烷酮、聚蔗糖（聚合的糖）、 葡聚糖结合剂（例如，环糊精，如2-轻丙基-正交（quadrature)-环糊精）、聚乙二醇、调味 剂、抗微生物剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂（例如，聚山梨醇酯如TWEEN 20? 和TWEEN 80?)、脂（例如，磷脂、脂肪酸）、类固醇（例如，胆固醇）和螯合剂（例如，EDTA)。 [0100] 如本文中所用，术语"可药用载体"包括任一种标准的可药用载体，例如磷酸缓冲 盐水溶液、水和乳剂，如油/水或水/油乳剂，以及多种类型的润湿剂。组合物还可以包 括稳定剂和防腐剂，以及可应用于体内的任何上述载体。载体、稳定剂和佐剂的实例参见 Remington? s Pharmaceutical Science.，15th Ed. (Mack Publ. Co.，Easton (1975)和 the Physician' s Desk Reference, 52nd ed·，Medical Economics, Montvale, N. J. (1998)中。
[0101] "有效量"是足以实现有益或期望结果的量。可以在一次或多次施用或应用或给药 时施用有效量。
[0102] "受试者"、"个体"或"患者"在本文中可互换使用，其指脊椎动物，优选地哺乳动 物，更优选地人类。哺乳动物包括但不限于，小鼠、猿猴、人、家畜、运动动物和宠物。
[0103] 如本文所用的⑶K的"抑制剂"(⑶Ki)减少了 CCND3与⑶K4和/或⑶K6的结合。 该抑制可以包括，例如，在它们结合到一起之前减少CCND3与CDK4/6的结合，或在它们结合 到一起之后减少CCND3与CDK4/6的结合，因此释放两个分子。减少可以在低，但可检测量， 至分子完全解离的范围内。
[0104] 目前已经鉴定了许多CCND3突变作为⑶Ki的生物标志物。PEST结构域中的CCND3 突变可以用于确定患者对任何CDKi的敏感性。CCND3突变包括但不限于，PEST结构域中的 插入、缺失、移码和一个或多个点突变。例如但不限于，PEST结构域中的CCND3突变包括： 氨基酸290处的异亮氨酸至赖氨酸的改变（I290K)、氨基酸290处的异亮氨酸至苏氨酸的改 变（I290T)、氨基酸284处的脯氨酸至亮氨酸的改变（P284L)、氨基酸284处的脯氨酸至丝 氨酸的改变（P284S)，和氨基酸287处缬氨酸至天冬氨酸的改变（V287D)。例如，PEST结构 域中氨基酸290处从异亮氨酸至苏氨酸的CCND3突变（I290T)指示癌症患者对任何CDKi 的施用敏感并且将有利地对任何CDKi的施用反应。
[0105] ⑶K抑制剂（⑶Ki)是这样的化合物，其是CCND3 -⑶K4/6结合的抑制剂并且用于 与本发明的方法结合。CDKi用于药物组合物中用于人或兽医用途，其中例如在肿瘤和/或 癌细胞生长的治疗中指示对CCND3 - CDK4/6结合的抑制。CDKi化合物用于治疗例如弥散性 大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性B细胞白血病和伯基特淋 巴瘤。
[0106] 表I-CDKi化合物
[0107] CDKi ⑴
【权利要求】
1. 确定癌细胞对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（CDKi)的敏感性的方法，所述方法 包括：a)测定癌细胞中细胞周期蛋白D3(CCND3)突变；和b)比较CCND3突变与非癌或正常 对照细胞，其中癌细胞中CCND3突变的存在指示其对CDKi敏感。
2. 权利要求1的方法，其中癌细胞选自：弥散性大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴细胞性 白血病、急性成淋巴细胞性B细胞白血病和伯基特淋巴瘤。
3. 权利要求1的方法，其中CCND3突变位于PEST结构域中。
4. 权利要求1的方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO. 2的氨基酸256-268中的至少一 个氨基酸改变。
5. 权利要求1的方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO. 2的氨基酸271-292中的至少一 个氨基酸改变。
6. 权利要求1的方法，其中CCND3突变是表2中的任何突变。
7. 权利要求1的方法，其中CCND3突变选自：氨基酸290处的异亮氨酸至赖氨酸的改 变（I290K)、氨基酸290处的异亮氨酸至苏氨酸的改变（I290T)、氨基酸284处的脯氨酸至 亮氨酸的改变（P284L)、氨基酸284处的脯氨酸至丝氨酸的改变（P284S)，和氨基酸287处 缬氨酸至天冬氨酸的改变（V287D)。
8. 权利要求1的方法，其中⑶Ki选自表1。
9. 预测癌症患者对利用CDKi治疗的敏感性的方法，所述方法包括：a)测定从患者获 得的癌样品中的CCND3突变；和b)比较CCND3突变与非癌或正常对照样品，其中癌样品中 CCND3突变的存在指示患者对利用CDKi的治疗敏感。
10. 权利要求9的方法，其中癌样品选自：弥散性大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴细胞性 白血病、急性成淋巴细胞性B细胞白血病和伯基特淋巴瘤。
11. 权利要求9的方法，其中CCND3突变位于PEST结构域中。
12. 权利要求9的方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO. 2的氨基酸256-268中的至少一 个氨基酸改变。
13. 权利要求9的方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO. 2的氨基酸271-292中的至少一 个氨基酸改变。
14. 权利要求9的方法，其中CCND3突变是表2中的任何突变。
15. 权利要求9的方法，其中CCND3突变选自：氨基酸290处的异亮氨酸至赖氨酸的改 变（I290K)、氨基酸290处的异亮氨酸至苏氨酸的改变（I290T)、氨基酸284处的脯氨酸至 亮氨酸的改变（P284L)、氨基酸284处的脯氨酸至丝氨酸的改变（P284S)，和氨基酸287处 缬氨酸至天冬氨酸的改变（V287D)。
16. 权利要求9的方法，其中⑶Ki选自表1。
17. 权利要求9的方法，其进一步包括：c)测量从患者获得的癌样品中CCND3的差异蛋 白质表达；和d)比较癌样品中CCND3的蛋白质表达与非癌或正常对照样品的CCND3蛋白质 表达，其中癌样品中CCND3蛋白质的增加水平指示所述患者对利用CDKi的治疗敏感。
18. 利用CDKi治疗癌症患者的方法，所述方法包括：a)测定从患者获得的癌样品中的 CCND3突变；b)比较癌样品中的CCND3突变状态与非癌或正常对照样品中的CCND3突变状 态，其中CCND3突变的存在指示所述患者对利用CDKi的治疗敏感；c)向该患者施用CDKi ; 和d)测定肿瘤生长的抑制。
19. 权利要求18的方法，其中癌样品选自：弥散性大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴细胞 性白血病、急性成淋巴细胞性B细胞白血病和伯基特淋巴瘤。
20. 权利要求18的方法，其中CCND3突变位于PEST结构域中。
21. 权利要求18的方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO. 2的氨基酸256-268中的至少 一个氨基酸改变。
22. 权利要求18的方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO. 2的氨基酸271-292中的至少 一个氨基酸改变。
23. 权利要求18的方法，其中CCND3突变是表2中的任何突变。
24. 权利要求18的方法，其中CCND3突变选自：氨基酸290处的异亮氨酸至赖氨酸的改 变（I290K)、氨基酸290处的异亮氨酸至苏氨酸的改变（I290T)、氨基酸284处的脯氨酸至 亮氨酸的改变（P284L)、氨基酸284处的脯氨酸至丝氨酸的改变（P284S)，和氨基酸287处 缬氨酸至天冬氨酸的改变（V287D)。
25. 权利要求18的方法，其中以治疗有效量施用⑶Ki。
26. 权利要求18的方法，其中⑶Ki选自表1。
27. 筛选CDKi候选物的方法，所述方法包括：a)使含有CCND3突变的细胞与CDKi候选 物接触；b)测定细胞活力的降低；和c)比较来自与CDKi候选物接触的CCND3突变体细胞 的细胞活力的降低和与对照CDKi接触的CCND3突变体细胞的细胞活力的降低。
28. 权利要求27的方法，其中对照⑶Ki选自表1。
29. 权利要求27的方法，其中含有CCND3突变的细胞选自：弥散性大B细胞淋巴瘤、淋 巴瘤、淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性B细胞白血病和伯基特淋巴瘤。
30. 权利要求27的方法，其中CCND3突变位于PEST结构域中。
31. 权利要求27的方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO. 2的氨基酸256-268中的至少 一个氨基酸改变。
32. 权利要求27的方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO. 2的氨基酸271-292中的至少 一个氨基酸改变。
33. 权利要求27的方法，其中CCND3突变是表2中的任何突变。
34. 权利要求27的方法，其中CCND3突变选自：氨基酸290处的异亮氨酸至赖氨酸的改 变（I290K)、氨基酸290处的异亮氨酸至苏氨酸的改变（I290T)、氨基酸284处的脯氨酸至 亮氨酸的改变（P284L)、氨基酸284处的脯氨酸至丝氨酸的改变（P284S)，和氨基酸287处 缬氨酸至天冬氨酸的改变（V287D)。
35. 组合物，其包含用于在所选癌症患者群体中治疗癌症的CDKi，其中与正常对照细 胞样品相比，在从所述患者获得的癌细胞样品中显示CCND3突变的基础上选择癌症患者群 体。
36. 权利要求35的组合物，其中癌样品选自弥散性大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴细胞 性白血病、急性成淋巴细胞性B细胞白血病和伯基特淋巴瘤。
37. 用于预测癌症患者对利用CDKi治疗的敏感性的试剂盒，其包含：i)用于检测 CCND3突变的工具；和ii)怎样使用所述试剂盒的说明书。
【文档编号】C12Q1/68GK104487594SQ201380036674
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2013年6月26日 优先权日:2012年7月9日
【发明者】G·卡波尼格罗, S·德拉奇, L·加拉维, Z·亚加尼, S·金, G·克留科夫 申请人:诺华股份有限公司, 达纳-法伯癌症研究公司, 博德研究所