专利名称：一种将粒毛盘菌胞外黑色素改性为水溶性黑色素的方法
技术领域：
本发明属于黑色素溶解度改性方法技术领域，具体涉及将粒毛盘菌(Iachnum)胞外黑色素改性为水溶性黑色素的方法。
背景技术：
黑色素作为一类广泛存在于自然界中的色素,是目前已知生物色素中来源较广泛的色素之一，主要产生于动植物和微生物的进化过程中，是通过多羟基酚氧化而成的构造不规则的类多酚聚合体。根据结构上的差异，可分为真黑色素(eumelanins)、棕黑色素 (phaeomelanins)以及异黑色素(allomelanins)三种类型。黑色素的性质比较稳定。据《细胞微生物学》(CellularMirobiology，2003, 5，167-223)介绍，黑色素常与蛋白质牢固结合，且不溶于水。中国专利号ZL200910145058.4《一种粒毛盘菌及由其液态发酵制备黑色素的方法》公开了本发明人课题组以保藏编号为CCTCC No:M 209193的一株粒毛盘菌(Iachnum)YM-223 (本发明人课题组自定编号代码)制备黑色素的方法。所制备的黑色素具有较强的抗氧化活性和光保护作用，且经过毒理性试验证实其安全无毒，同时该粒毛盘菌黑色素在pH彡7时稳定，pH彡6时沉淀，其在(T40°C的水中溶解度为0. 03^0. 12g/100g。由于该该粒毛盘菌黑色素在水中的难溶性使其在医疗、食品等领域的应用受到限制。若能将碱溶性黑色素改性成水溶性黑色素，以便于人体吸收，可充分发挥其保健功能，具有重大意义。目前，国际上对黑色素进行改性的研究很少。《生物化学与生物物理学》(Archivesofbiochemistry and biophysics, 1984, 2, 157-162)曾报道对以化学方法合成的黑色素进行甲基化修饰，并经红外光谱和电子自旋共振光谱检测，结果表明两者有一定区别，甲基化黑色素具有较多的重氮甲烷成分。除此之外还未见有其他黑色素改性的报道，且至今尚未见到有关真菌黑色素改性或将不溶于水的黑色素通过改性获得水溶性黑色素方面研究的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种将保藏号为CCTCCNo:M 209193的粒毛盘菌(Iachnum)的胞外黑色素改性为水溶性黑色素的方法，以克服现有技术的上述缺陷。本发明将粒毛盘菌胞外黑色素改性为水溶性黑色素的方法，其特征在于将保藏号为CCTCC No:M 209193的粒毛盘菌(Iachnum)发酵后提取纯化制得的胞外黑色素，与精氨酸或组氨酸或赖氨酸，和水，按质量比为1:0. 5^1. 5:4. 5^50的比例混合,震荡至黑色素固体溶解后，将该溶液干燥，即得到水溶性粒毛盘菌黑色素。所述干燥可选用冷冻干燥、常温干燥、真空干燥或喷雾干燥。采用本发明上述方法得到的改性粒毛盘菌黑色素，在(T40°C的水中溶解度由原来改性前的0. 03 0. 12g/100g提高到了改性后的3. 85 4. 65g/100g。采用本发明方法可以克服原保藏号为CCTCC No:M 209193的粒毛盘菌(Iachnum)胞外黑色素由于难溶于水而不适合用于制成口服制剂或食品添加剂用于医疗、食品等领域的问题，对于扩展黑色素的应用领域和适用范围具有积极意义。
图I为改性前的原粒毛盘菌(Iachnum) CCTCC No:M 209193胞外黑色素的红外光谱图；图2为采用本发明方法对粒毛盘菌(Iachnum) CCTCC No:M 209193胞外黑色素采用精氨酸进行改性后的黑色素的红外光谱图。
具体实施例方式实施例I :
本实施例中所使用的粒毛盘菌胞外黑色素，是根据中国专利号ZL200910145058. 4《一种粒毛盘菌及由其液态发酵制备黑色素的方法》，由保藏号为CCTCC No:M209193的粒毛盘菌(Iachnum) YM-223发酵后提取纯化制得的。先将保藏号为CCTCC No:M 209193的粒毛盘菌(lachnum)YM_223纯培养物接种于配方为按质量百分比由葡萄糖1%、蛋白质I. 0%、L-酪氨酸0. 03%、K2HPO4O. 1%、CuSO4O. 03%、琼脂15-20%和蒸馏水IOOOmL组成的，pH 6. 0-7. 0的马铃薯葡萄糖培养基的平板上活化，在23°C恒温培养5天后，取菌龄一致的菌块接种于装有50ml配方为按质量百分比由葡萄糖1_4%、蛋白质 0. 5-1. 0%、L-酪氨酸 0. 03-0. 1%, K2HP040. 03-0. 1%、CuS040. 01-0. 05% 和蒸馏水IOOOmL组成的，pH 6. 0-7. 0的粒毛盘菌YM-223马铃薯葡萄糖液体培养基的250ml三角瓶中，在25°C、以160r/min摇床培养5天后，得到粒毛盘菌(Iachnum) CCTCC No:M 209193种子液。将该粒毛盘菌(Iachnum) CCTCCNo:M 209193种子液按发酵培养基体积的4%接种于5L自动控制发酵罐，其中的发酵培养基同为上述粒毛盘菌YM-223马铃薯葡萄糖液体培养基，装液量为3L，通气量为2L/min，在28°C、以180r/min的转速培养10天后，抽滤2次，所得到的滤液即为发酵液。将发酵液按体积比I: I与2mol/L的氢氧化钠溶液混合成为浸提液，静置12小时，用lmol/L盐酸甲醇调节pH值至2 3，静置12小时，将所得到的黑色素悬浮液置于高速离心机中，5，000r/min离心IOmin,所得沉淀经去离子水洗漆至pH值为7后，用真空冷冻干燥机在_42'45°C温度、5 13Pa压力条件下真空冷冻干燥后，得到黑色素粗提物。再按该黑色素粗提物的质量(g)与浓度为6mol/L盐酸溶液的体积(ml)比为I ::40，在80°C水浴酸解4小时后，所得沉淀用去离子水洗涤至pH值为7后，置于高速离心机中，以5，000r/min离心15min，将沉淀按质量(g)与浓度为2mol/L的氨水溶液的体积(ml)比为1:10溶于氨水溶液中，采用旋转蒸发仪蒸去氨气至溶液pH值为7，将所得溶液先与石油醚按体积比1:1萃取3次，再与氯仿按体积比1:1萃取3次，最后与乙酸乙酯按体积比1:1萃取3次，所得萃取液用2mol/L盐酸甲醇溶解调至pH值为2，用高速离心机以5，000r/min离心lOmin，弃上清液，所得沉淀经去离子水反复洗涤至pH值为7后，用真空冷冻干燥机在-42'45°C温度、5 13Pa压力条件下真空冷冻干燥后，即得到粒毛盘菌(Iachnum) CCTCCNo:M 209193胞外黑色素。分别取Ig粒毛盘菌(Iachnum) CCTCCNo:M 209193胞外黑色素，分别加入0. 5g的
下列氨基酸天门冬氨酸、苏氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、色氨酸和甘氨酸，其中一份作为对照不加入氨基酸，再分别加入IOOmL蒸馏水中，在40°C震荡30min。采取5000r/min离心IOmin后收集上清液，测其在波长OD5tltl下的分光光度值，光度值越高表明溶解效果越好。结果表明采用不同氨基酸改性修饰后的黑色素的溶解度相差较大，其中以精氨酸改性修饰的黑色素吸光度最大，OD500为0. 357 ;而以赖氨酸和组氨酸改性修饰的黑色素OD5tltl分别为0. 137和0. 106，其溶解效果次于以精氨酸改性修饰的黑色素；而以天门冬氨酸、苏氨酸、色氨酸和甘氨酸修饰的黑色素的溶解效果较差，其OD5tltl均低于0. 05。分别取Ig粒毛盘菌(Iachnum) CCTCCNo:M 209193胞外黑色素，分别加入0. 25g、0. 5g、0. 75g、l. 0g、l. 25g和I. 5g精氨酸，再分别溶于IOOmL蒸馏水中，后续实验步骤同上。结果表明当精氨酸加入量增加时其改性黑色素溶解量增大，且当精氨酸添加量为I. Og时，其改性黑色素可完全溶解，OD值达最大，继续加大精氨酸量，则OD值不再增加。故选择最佳精氨酸改性修饰黑色素的质量比为黑色素精氨酸为1:1。取IOg粒毛盘菌(Iachnum) CCTCC No:M 209193胞外黑色素于三角瓶中，加入IOg精氨酸及IOOmL蒸馏水，在40°C震荡至黑色素溶解，用真空冷冻干燥机在-42 _45°C温度、5 13Pa压力条件下真空冷冻干燥后，即得到精氨酸修饰的粒毛盘菌(Iachnum) CCTCCNo:M 209193胞外精氨酸黑色素(以下简称为精氨酸黑色素)。对其进行复溶实验，结果表明精氨酸黑色素复溶效果较好，在40°C水中的溶解度为4. 65g/100g，在0°C水中的溶解度为 4. 38g/100g。分别将采用上述方法改性后的与改性前的2mg粒毛盘菌(lachnum) CCTCCNo:M209193胞外黑色素，分别与400mg干燥的KBr混匀压片，采用FT-IR6700傅立叶变换红外光谱仪于^OO^OOcnT1区间进行红外光谱测定。图I为改性前原粒毛盘菌(Iachnum)CCTCC No:M 209193胞外黑色素的红外光谱图，图2为采用本发明方法对粒毛盘菌(lachnum) CCTCC No:M 209193胞外黑色素采用精氨酸进行改性修饰后的黑色素的红外光谱图。对比分析这两个红外光谱图的结果表明，改性前后的粒毛盘菌(lachnum)CCTCCNo:M 209193胞外黑色素均具有真菌黑色素具有的特征吸收峰，即3218cm—1和1614cm—1处的C=O和-O(N)H基团特征吸收峰，除具有相似的O-H伸缩振动(3218. 802cm^)和脂肪族C-H的伸缩振动(2923. 404CHT1和2811. 457cm—1)外，精氨酸黑色素还具有酰胺C=O收缩振动(1672. 346cm-1 和 1637. 679cm_l)、和酰胺 C-N 伸缩振动(1359. 614cm-1 和 1328. 842cm_l)特征吸收峰，这是由于精氨酸与黑色素结合后，精氨酸的胍基与黑色素的羰基反应形成了酰胺。该结果表明精氨酸对粒毛盘菌(Iachnum)CCTCC No:M 209193胞外黑色素改性成功。准确称量L OOOg粒毛盘菌(lachnum) CCTCC No:M 209193胞外黑色素，加入ImLlmol L^1NH3 H2O摇匀后，加水定容于IOOmL的容量瓶中，取ImL色素溶液稀释一定倍数，在212nm波长下测得吸光度值K。计算得其色价Ewlcm为221. 0 ;准确称量I. OOOg改性后的粒毛盘菌(Iachnum)CCTCC No:M 209193胞外精氨酸黑色素，加水定容于IOOmL的容量瓶中，取ImL色素溶液稀释一定倍数，在202nm波长下测得吸光度值A2。根据公式计算色价
AU
C = ，其中A为吸光度值，B为稀释倍数，M为色素质量。测得其色价E15tlcmS 194. 6。两
者相比，其中改性后的粒毛盘菌(Iachnum)CCTCC No:M 209193胞外精氨酸黑色素的色价略低，但仍为桂花种子黑色素色价(El%lcmlmax=60. 24)(据《Food Science and Technology》(食品科学与技术，2006，39:496-502)报道)的3. 23倍(色价高更有利于工业生产)。
实施例2:取实验室中原先保留下来的由他人按中国专利号为ZL200910145058. 4的专利《一种粒毛盘菌及由其液态发酵制备黑色素的方法》中所述的方法制备获得的粒毛盘菌(lachnum) CCTCCNo:M 209193胞外黑色素IOg于三角瓶中，加入IOg赖氨酸及IOOmL蒸馏水，震荡至使黑色素溶解后，将该溶液在_42'45°C、压力为5 13Pa的条件下真空冷冻干燥后，即得到以赖氨酸改性修饰的粒毛盘菌(lachnum) CCTCC No:M 209193胞外黑色素(以下简称为赖氨酸黑色素)。按实施例I中所述方法对赖氨酸黑色素的溶解度及色价进行测定，测得其在40°C的水中溶解度为4. 23g/100g，在(TC的水中溶解度为3. 94g/100g，略低于实施例I中制备的精氨酸黑色素。并测得赖氨酸黑色素的色价E15tlcm等于192. 7，与精氨酸黑色素相当。
实施例3:将IOg粒毛盘菌(lachnum) CCTCC No:M 209193胞外黑色素置于三角瓶中，加入IOg组氨酸及IOOmL蒸馏水，搅拌后放置至黑色素溶解，将该溶液在_42'45°C、5 13Pa的条件下真空冷冻干燥后，即得到以组氨酸改性修饰的粒毛盘菌(lachnum) CCTCC No:M209193胞外黑色素(以下简称为组氨酸黑色素)。按实施例I的方法对组氨酸黑色素的溶解度及色价进行测定，测得其在40°C的水中溶解度为3. 97g/100g,在0°C的水中溶解度为3. 85g/100g,略低于实施例I中制备的精氨酸黑色素，与实施例2中制备的组氨酸黑色素相当。并测得该组氨酸黑色素的色价E15tlran等于203. 3，略高于精氨酸黑色素与赖氨酸黑色素。在保持上述实施例1、2及3中其他条件不变的情况下，将粒毛盘菌胞外黑色素纯品与精氨酸、赖氨酸或组氨酸的比例扩大到1:0. 5^1:1. 5，所得到的精氨酸黑色素、赖氨酸黑色素及组氨酸黑色素的溶解度与原实施例1、2及3中制备的精氨酸黑色素、赖氨酸黑色素及组氨酸黑色素的溶解度相同，并未发生改变。在保持上述实施例1、2及3中其他条件不变的情况下，将粒毛盘菌胞外黑色素纯品与水的比例扩大到1:4. 5 1:50，所得精氨酸黑色素、赖氨酸黑色素及组氨酸黑色素的溶解度与原实施例1、2及3中相同，并未发生改变。在保持上述实施例1、2及3中其他条件不变的情况下，分别采用常温干燥、真空干燥或喷雾干燥的方法，所得到的精氨酸黑色素、赖氨酸黑色素及组氨酸黑色素的溶解度相同，并未发生改变。
权利要求
1.一种将粒毛盘菌胞外黑色素改性为水溶性黑色素的方法，其特征在于将保藏号为CCTCCNo:M 209193的粒毛盘菌(Iachnum)发酵后提取纯化制得的胞外黑色素，与精氨酸或组氨酸或赖氨酸，和水，按质量比为1:0. 5^1. 5:4. 5^50的比例混合,震荡至黑色素固体溶解后，将该溶液干燥，即得到水溶性粒毛盘菌黑色素。
2.如权利要求I所述将粒毛盘菌胞外黑色素改性为水溶性黑色素的方法，特征在于所述干燥选用冷冻干燥、常温干燥、真空干燥或喷雾干燥。
全文摘要
本发明公开了一种将粒毛盘菌胞外黑色素改性为水溶性黑色素的方法，特征是将保藏号为CCTCCNo:M 209193的粒毛盘菌(lachnum)发酵后提取纯化制得的胞外黑色素，与精氨酸或组氨酸或赖氨酸，和水，按质量比为1:0.5~1.5:4.5~50混合，震荡至黑色素固体溶解后，将该溶液干燥，即得到水溶性粒毛盘菌黑色素。采用本发明方法改性后的粒毛盘菌胞外黑色素在0~40℃水中的溶解度提高到了3.85~4.65g/100g。采用本发明方法可以克服原粒毛盘菌胞外黑色素因难溶于水而不适合用于口服制剂或食品添加剂的问题，对于扩展黑色素的应用范围具有积极意义。
文档编号C09B61/00GK102746705SQ20121021840
公开日2012年10月24日 申请日期2012年6月28日 优先权日2012年6月28日
发明者卢莹, 叶子扬, 叶明 , 郭赓艺 申请人:合肥工业大学