专利名称：小鼠皮肤黑色素细胞特异表达的载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物 技术领域，具体而言涉及一种在皮肤黑色素中特异表达，从而为产生转基因动物提供高效表达的载体。
背景技术：
⑶K5-A是⑶K家族成员，研究表明⑶K5-A通过调节羊驼黑色素细胞产生黑色素的路径上TYR和MClR等基因的表达，参与羊驼毛色形成，并在其表型和功能的维持中起重要的作用。为了将羊驼CDK5-A转入绒山羊使其毛色表型发生变化成为可能，载体中承载的可表达序列(包含启动子、报告基因、FLAG标签以及目标基因)的构建是前提。该构建技术主要应用DNA重组技术定向地将不同的DNA片段进行连接，在特定的受体细胞中与载体同时复制进行表达，从而产生新的目的遗传性状。该构建的目的是将⑶K5-A基因接入真核表达载体中，通过自身携带的特异启动子以及在哺乳动物细胞内表达的真核启动子使目的基因在特异细胞中表达。在设计该构建时根据目的而对所涉及的DNA片段进行修饰和改造。构建转基因小鼠的表达载体，理想的应该是带内含子的基因组DNA，可是，由于一般基因组DNA都比较长，获取完整而又正确的序列非常困难，所以一般情况下用的是cDNA。而且，制备转基因载体构建时，首先必须将导入DNA进行分离纯化，并线性化。而在使用的载体上除了多克隆位点之外，还有很多其它酶切位点的，故用限制性内切酶进行酶切可以使DNA线性化。另外，还可以通过在设计的引物上额外加上限制性内切酶酶切位点，也可以解决该问题。为了体现目标基因是否进行表达，在载体上需要一个报告基因，这样报告基因的一个优点是它可以区分转录体是来源于转染的质粒还是来源于内源性基因。同时，报告基因常含有一个Kozak —致序列(即该序列含有真核生物翻译起始密码子)，并在下游含有多聚A信号，因此在RNA聚合酶II作用下产生的mRNA能翻译为蛋白质。报告基因编码区的上游插入了启动子，是DNA分子报告基因的mRNA、蛋白质或酶水平可以反应启动子的活性。对于细胞特异性启动子而言，启动子活性在表达的细胞系中与其在非表达的细胞系中具有很大差异，因此，为了使构建在特异的细胞中表达，选择细胞内特异的启动子是必要的。目的基因在特异细胞中表达后，为了分析蛋白质的生物学功能以及筛选目的基因暂时不容易得到或特异细胞转染效率低的基因靶点，常在氨基端加一FLAG标签。Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，一般不与目的蛋白发生相互作用，并且不会影响目的蛋白的生物活性和细胞内定位，这样利于对其进行下游研究。
发明内容
本发明为了提高⑶K5在黑色素细胞中的表达效率，构建了含有⑶K5的载体。为了实现本发明的目的，本发明采用如下的技术方案
本发明一方面涉及一种载体，其序列结构为pMD18-T-TYRP2-CDK5-SV40intron/polyA，优选的，其含有SEQ ID 7的DNA序列。本发明另一方面还涉及一种试剂盒，其含有上述载体，优选的，在本发明的试剂盒中还包括辅助基因转染的试剂。本发明另外一方面还涉及制备上述载体的试剂盒，其包括SEQ ID :1-6的引物。本发明另一方面还涉及上述载体的用途，其特征在于所述的载体用于体外黑色素细胞的转染。另一方面，本发明还涉及上述载体在调节动物黑色素表达中的应用，所述的应用是非治疗目的的。
具体实施方式
(I)克隆小鼠TYRP2基因的启动子片段以小鼠基因组DNA为模板，PCR法扩增获得，经纯化后，进行TA克隆。所用引物如下Try2P-F(SEQ ID 1) :5’ CGAGCTCGTAAATGCACACATCTGCATGC 3’ (Sac I)Try2P-R(SEQ ID :2) :5，GCCCGGGGCCGGCGTCCCACCTGGTTTC 3， (XmaI)(2)克隆羊驼⑶K5 cDNA片段，并带有FLAG标签以羊驼cDNA为模板，引物中设计FLAG序列，PCR法扩增获得，经纯化后，进行TA克隆。所用引物如下CDK5-Kozak-F(SEQ ID 3) :5， GCCCGGGGCCGCCACCATGCAGAAATACGAGAAACTGG3， (Xma I)CDK5-flag-R(SEQ ID 4) :5’CTCTAGACTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGGGAGGGCAGAAGTCGGAGA 3， (XbaI)(3)克隆 SV40 intron/polyA 片段以含有SV40的质粒DNA (如pcDNAl. I)为模板，PCR法扩增获得，经纯化后，进行TA克隆。所用引物如下SV40pA-F((SEQ ID 5) :5’ CTCTAGAGGATCTTTGTGAAGGAACCTTA 3’ (XbaI)SV40pA-R((SEQ ID :6)) :5’ CGTCGACTCGATCCAGACATGATAAGATA 3’ (Sail)(4)克隆 pMDl8-T-TYRP2_CDK5-SV40intron/polyA用限制性内切酶XbaI and Sail消化环状pMD18_T质粒和SV40intron/polyA质粒(第3步TA克隆后)，胶回收纯化，并进行连接，产生pMD18-T-SV40 intron/polyA克隆。
用限制性内切酶XmaI和XbaI消化上述获得的pMD18-T-SV40intron/polyA质粒以及羊驼⑶K5cDNA质粒(第2步TA克隆后)，胶回收纯化，并进行连接，产生pMD 18-T-CDK5-SV40 intron/po IyA 克隆。 用限制性内切酶SacI和XmaI消化上述获得的pMD18-T-CDK5_SV40intron/polyA质粒以及TYRP2启动子质粒(第I步TA克隆后)，胶回收纯化，并进行连接，产生pMD 18-T-TYRP2-CDK5-SV40 intron/po I yA 克隆。
(5)制备用于显微注射的转基因DNA用限制性内切酶SacI和SalI消化上述获得的pMD18-T-TYRP2-CDK5_SV40intron/polyA质粒，并进行胶回收纯化，产生用于转基因DNA。为了检测构建载体 pMD18-T-Try2P-CDK5A-SV40intron/polyA 的表达效率，首先进行了细胞转染在6孔板的每孔中加入大约2ml正常生长培养基，接种3X105个黑色素细胞。在37°C条件下培养细胞约60%;在灭菌离心管中准备试剂A和B (试剂A :对每孔细胞，使用125 u I不含血清的培养基稀释2 ii g DNA ;试剂B :对每孔细胞，使用125 U I不合血清的培养基稀释7 u I DNAfectin试剂)；将试剂A和B混合，室温条件下孵育20min以促进DNA-脂质体复合体的形成；移去细胞中的培养基，加入800 u I不含血清的培养基；将DNAfectin与DNA的复合物加入细胞中，轻柔摇动培养板，确保混匀；在37°C条件下保温15小时；移去转染试剂，每孔加入2ml含血清的完全培养；在37°C条件下培养细胞72小时后，收集所有细胞，并提取其总RNA，RT反应反转录为cDNA。以cDNA为模板，对MClR和TYR进行PCR扩增，扩增时收集SYRB-GREEN染料信号以示产生目的基因的产量。同时，用18S rRNA 做内参。以检测转染后黑色素细胞中毛色基因的表达变化。RT 反应体系10 ii I 反应体系中含 5XPrime ScriptTMBuffer2 u I, PrimeScriptTMRT Enzyme Mixl 0.5 u I, Oligo dT Primer25pmol,随机引物 50pmol,TotalRNAlu I, DEPC水加至lOyl。上述成分混匀后置于PCR仪器中，反应条件为370C 15min，85°C 5s。RT 产物保存于-20°C备用。建立PCR 反应体系10XReaction Buffer2. 5 U I, dNTPs (各 2. 5mM) 2. 0 U I,上下游引物(IOiiM)各 0. 5 iil，Taq DNA 聚合酶(2U)0. 2u I, cDNA 模板(500-1000ng) I. 0 u I,ddH2018. 3u I0按如下反应程序进行PCR反应。PCR所用引物如下
权利要求
1.一种载体，其序列结构为pMD18-T-TYRP2-CDK5-SV40intron/polyA，优选的，其含有SEQ ID 7 的 DNA 序列。
2.一种试剂盒，其含有权利要求I的载体，优选的，在试剂盒中还包括辅助基因转染的试剂。
3.一种制备权利要求I所述载体的试剂盒，其包括SEQ ID :1-6的引物。
4.权利要求I所述载体的用途，其特征在于所述的载体用于体外黑色素细胞的转染。
5.权利要求I所述载体在调节动物黑色素表达中的应用，所述的应用是非治疗目的的。
全文摘要
本发明公开了小鼠皮肤黑色素细胞特异表达的载体及其应用，其序列为pMD18-T-TYRP2-CDK5-SV40intron/polyA。本发明的载体具有高的表达效率，对于调节动物黑色素的表达具有重要意义。
文档编号C12N15/85GK102776234SQ20121004294
公开日2012年11月14日 申请日期2012年2月24日 优先权日2012年2月24日
发明者冀元凯, 杨姗姗, 白俊明, 范瑞文, 董常生, 谢建山 申请人:山西农业大学