一种提高川贝母细胞同步化的诱导方法
【专利摘要】本发明公开了一种提高川贝母细胞同步化的诱导方法，属于生物【技术领域】。本发明方法主要采用氦气阻断法与低温诱导共同对川贝母有丝分裂进行同步化诱导，该诱导方法能有效地提高其后续的多倍体诱导率，克服了川贝母种植过程中出现品种退化的问题，能明显缩短种植周期，进而提高川贝母的产量及药用成分含量，该方法步骤简单，工艺稳定，适用于在工业化大生产。
【专利说明】—种提高川贝母细胞同步化的诱导方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种川贝母的生物技术方法，特别是涉及一种有效提高川贝母细胞同步化的诱导方法。 【背景技术】
[0002]川贝母(Fritillaria cirrhosa D.Don)是百合科多年生草本植物，以鳞莖入药，为名贵的川产道地药材，堪称药中之宝。川贝母植株对生长环境要求苛刻，它喜冷阴气候条件，具有耐寒、喜湿、喜荫蔽、怕高温的特性。气温达到30°C或地温超过25°C，植株就会枯萎，在海拔低、气温高的地区不能生存，所以川贝母在海拔3500m~4500m的高度才能正常生长，这就使得川贝母野生资源十分稀缺，不能满足市场的需要。
[0003]多倍体药用植物一般具有根、茎、叶和花果的巨型性，抗逆性强，药用成分含量高等特性，这正是川贝母药材优质、高产育种所期望达到的目标。然而目前在植物多倍体的诱导过程中，常使用秋水仙素等药物来诱导植物染色体加倍，但这些药物都是采取阻断处于分裂时期细胞的纺锤丝的形成，从而获得多倍体细胞。众所周知，细胞在进行有丝分裂，细胞在间期的时间大大的长于分裂期；因此，采用秋水仙素等药物来诱导植物组织和器官产生多倍体时，都只能对分裂期的细胞有效，所以最终多倍体纯合体的诱导率都比较低。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种提高川贝母细胞同步化的诱导方法，该方法步骤简单，工艺稳定，适用于在工业化大生产中的广泛应用。
[0005]本发明的目的是通过以下技术方案来实现的:
一种提高川贝母细胞同步化的诱导方法，它包括以下步骤:
51:将由川贝母鳞片叶诱导产生的愈伤组织切成0.5~2cm2的大小转接到产生疏松愈伤组织的培养基中进行培养，pH值为5.6~6.5，培养条件:温度20~25°C，每天光照8~12h，光照强度为1000~18001x ；
52:将SI步骤获得的疏松愈伤组织按5~20g.1的接种量接入MS+KT 0.5~
1.0mg *L_1+2,4-D 0.5~2.0mg *L-1+鹿糖10~25g *L_1的液体培养基中进行悬浮培养,pH值为5.5~6.0，培养条件:温度18~22°C，每天光照6~10h，光照强度为600~ΙΟΟΟΙχ，摇床转速为80~100r/min的条件下，进行20~30天继代培养一次；
53:在S2步骤的悬浮培养过程中，选取在第三次继代培养基中添加I~3mmol/L的腺嘌呤核苷培养处理细胞10~18h，再更换在不加腺嘌呤核苷的培养基中继续培养I周；接着向培养基中通入氦气并保持压力为50~80磅/英寸2，在20~25°C的培养条件下培养12~24h后放出氦气；
54:将S3步骤处理完毕的细胞转接入MS+NAA 0.1~0.5mg.171+KT 0.1~0.5mg.171+蔗糖20~40g吨―1+甘油5~20%的液体培养基中，在I~5°C的低温条件下培养12~24h后再放在温度为18~22°C条件下恢复培养24~48h。[0006]优选地，SI步骤所述的培养基为:MS+6-BA 0.1~0.5mg.L_1+NAA 0.1~
1.0mg.L:+2,4~D 1.0 ~4.0mg.L1+ 鹿糖 30 ~50g.L1+ 琼脂 4.5 ~6.0g.L、
[0007]优选地，SI步骤中培养条件:温度20°C，每天光照12h，光照强度为16001x。
[0008]优选地，S2步骤中培养条件:温度20°C，每天光照8h，光照强度为8001x。
[0009]优选地，S3步骤中向培养基中通入氦气并保持压力为60磅/英寸2，在22°C的培养条件下培养20h后放出氦气。
[0010]优选地，S4步骤中培养条件:在30C的低温条件下培养20h后再放在温度为20°C条件下恢复培养48h。
[0011]优选地，在经过S4步骤处理后，取少量细胞用滴管吹吸，将细胞打散混匀，滴I滴细胞悬液于冷冻干燥后的载玻片上，用席夫式染液染色制片，经显微镜观察并计算出分裂指数。
[0012]本发明的有益效果在于:本发明是通过对川贝母植物细胞进行同步化诱导处理，使川贝母细胞处于有丝分裂的相同分裂时期，从而有效地提高其后续的多倍体诱导率，进而提高川贝母的产量及药用成分含量。本发明主要以氦气阻断法与低温诱导共同对川贝母有丝分裂进行同步化诱导，从而建立一个同步化川贝母细胞系，该诱导方法克服了川贝母种植过程中出现品种退化的问题，能明显缩短种植周期。该诱导方法显著的提高了川贝母细胞的分裂指数，获得了较高的同步化率，该方法步骤简单，工艺稳定，适用于在工业化大生产中的广泛应用。
【具体实施方式】
[0013]下面结合实施例对 本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述:
实施例1:一种提高川贝母细胞同步化的诱导方法，它包括以下步骤:
51:将由川贝母鳞片叶诱导产生的愈伤组织切成0.5~2cm2的大小转接到产生疏松愈伤组织的培养基中进行培养，pH值为5.6~6.5，培养条件:温度20~25°C，每天光照8~12h，光照强度为1000~18001x ；
52:将SI步骤获得的疏松愈伤组织按5~20g.1-1的接种量接入MS+KT 0.5~
1.0mg *L_1+2,4-D 0.5~2.0mg *L-1+鹿糖10~25g *L_1的液体培养基中进行悬浮培养,pH值为5.5~6.0，培养条件:温度18~22°C，每天光照6~10h，光照强度为600~ΙΟΟΟΙχ，摇床转速为80~100r/min的条件下，进行20~30天继代培养一次；
53:在S2步骤的悬浮培养过程中，选取在第三次继代培养基中添加I~3mmol/L的腺嘌呤核苷培养处理细胞10~18h，再更换在不加腺嘌呤核苷的培养基中继续培养I周；接着向培养基中通入氦气并保持压力为50~80磅/英寸2，在20~25°C的培养条件下培养12~24h后放出氦气；
54:将S3步骤处理完毕的细胞转接入MS+NAA 0.1~0.5mg.171+KT 0.1~0.5mg.171+蔗糖20~40g吨―1+甘油5~20%的液体培养基中，在I~5°C的低温条件下培养12~24h后再放在温度为18~22°C条件下恢复培养24~48h。
[0014]实施例2:—种提高川贝母细胞同步化的诱导方法，它包括以下步骤:
S1:将由川贝母鳞片叶诱导产生的愈伤组织切成0.5~2cm2的大小转接到产生疏松愈伤组织的培养基MS+6-BA 0.1 ~0.5mg *L_1+NAA 0.1 ~1.0mg *L_1+2,4-D 1.0 ~4.0mg.171+鹿糖30~50g.L—1+琼脂4.5~6.0g.L—1中进行培养，pH值为5.6~6.5,培养条件:温度20~25°C，每天光照8~12h，光照强度为1000~18001x ；
52:将SI步骤获得的疏松愈伤组织按5~20g1的接种量接入MS+KT 0.5~
1.0mg *L_1+2,4-D 0.5~2.0mg *L-1+鹿糖10~25g *L_1的液体培养基中进行悬浮培养,pH值为5.5~6.0，培养条件:温度18~22°C，每天光照6~10h，光照强度为600~ΙΟΟΟΙχ，摇床转速为80~100r/min的条件下，进行20~30天继代培养一次；
53:在S2步骤的悬浮培养过程中，选取在第三次继代培养基中添加I~3mmol/L的腺嘌呤核苷培养处理细胞10~18h，再更换在不加腺嘌呤核苷的培养基中继续培养I周；接着向培养基中通入氦气并保持压力为50~80磅/英寸2，在20~25°C的培养条件下培养12~24h后放出氦气；
54:将S3步骤处理完毕的细胞转接入MS+NAA 0.1~0.5mg.171+KT 0.1~0.5mg.171+蔗糖20~40g吨―1+甘油5~20%的液体培养基中，在I~5°C的低温条件下培养12~24h后再放在温度为18~22°C条件下恢复培养24~48h。
[0015]实施例3:—种提高川贝母细胞同步化的诱导方法，它包括以下步骤:
51:将由川贝母鳞片叶诱导产生的愈伤组织切成0.5~2cm2的大小转接到产生疏松愈伤组织的培养基 MS+6-BA 0.1mg.L、NAA 0.1mg.1^+2，4-D 1.0mg1+ 蔗糖 30g.1+ 琼脂4.5g.1中进行培养，pH值为5.6~6.5，培养条件:温度20°C，每天光照8h，光照强度为 IOOOlx ；
52:将SI步骤获得的疏松愈伤组织按5g.1的接种量接入MS+KT 0.5mg.L^+2,4-D
0.5mg.L-1+鹿糖IOg *L_1的液体培养基中进行悬浮培养,pH值为5.5~6.0,培养条件:温度18°C，每天光照6h，光照强度为6001x，摇床转速为80r/min的条件下，进行20天继代培
养一次;
53:在S2步骤的悬浮培养过程中，选取在第三次继代培养基中添加lmmol/L的腺嘌呤核苷培养处理细胞10h，再更换在不加腺嘌呤核苷的培养基中继续培养I周；接着向培养基中通入氦气并保持压力为50磅/英寸2，在20°C的培养条件下培养12h后放出氦气；
54:将S3步骤处理完毕的细胞转接入MS+NAA 0.1mg.'+ΚΤ 0.1mg.L—1+蔗糖200g.1+甘油5%的液体培养基中，在1°C的低温条件下培养12h后再放在温度为18°C条件下恢复培养24h。
[0016]在经过S4步骤处理后，取少量细胞用滴管吹吸，将细胞打散混匀，滴I滴细胞悬液于冷冻干燥后的载玻片上，用席夫式染液染色制片，经显微镜观察并计算出分裂指数。
[0017]实施例4:一种提高川贝母细胞同步化的诱导方法，它包括以下步骤 :
51:将由川贝母鳞片叶诱导产生的愈伤组织切成0.5~2cm2的大小转接到产生疏松愈伤组织的培养基 MS+6-BA 0.5mg.L:+NAA 1.0mg.L:+2,4-D 4.0mg.L1+ 鹿糖 50g.L1+琼脂6.0g.L-1中进行培养，pH值为6.5，培养条件:温度25 V，每天光照12h，光照强度为18001x ；
52:将SI步骤获得的疏松愈伤组织按20g.1的接种量接入MS+KT 1.0mg.1^+2，4-D
2.0mg七1+蔗糖25g -1的液体培养基中进行悬浮培养，pH值为6.0,培养条件:温度22°C，每天光照10h，光照强度为ΙΟΟΟΙχ，摇床转速为lOOr/min的条件下，进行30天继代培养一次；
53:在S2步骤的悬浮培养过程中，选取在第三次继代培养基中添加3mmol/L的腺嘌呤核苷培养处理细胞18h，再更换在不加腺嘌呤核苷的培养基中继续培养I周；接着向培养基中通入氦气并保持压力为80磅/英寸2，在25°C的培养条件下培养24h后放出氦气；
54:将S3步骤处理完毕的细胞转接入MS+NAA 0.5mg .L-1'+ΚΤ 0.5mg七1+蔗糖40g.L-1+甘油20%的液体培养基中，在5°C的低温条件下培养24h后再放在温度为22°C条件下恢复培养48h。
[0018]在经过S4步骤处理后，取少量细胞用滴管吹吸，将细胞打散混匀，滴I滴细胞悬液于冷冻干燥后的载玻片上，用席夫式染液染色制片，经显微镜观察并计算出分裂指数。
[0019]实施例5:—种提高川贝母细胞同步化的诱导方法，它包括以下步骤:
51:将由川贝母鳞片叶诱导产生的愈伤组织切成0.5~2cm2的大小转接到产生疏松愈伤组织的培养基 MS+6-BA 0.3mg.L:+NAA 0.5mg.L:+2,4-D 2.0mg.L1+ 鹿糖 40g.L1+琼脂5.0g.L-1中进行培养，pH值为6.0，培养条件:温度20°C，每天光照12h，光照强度为16001x ；
52:将SI步骤获得的疏松愈伤组织按IOg.L-1的接种量接入MS+KT 0.8mg.1^+2，4-D
1.0mg七1+蔗糖15g.L-1的液体培养基中进行悬浮培养，pH值为6.0,培养条件:温度20°C，每天光照8h，光照强度为8001x，摇床转速为lOOr/min的条件下，进行25天继代培养一次；
53:在S2步骤的悬浮培养过程中，选取在第三次继代培养基中添加2mmol/L的腺嘌呤核苷培养处理细胞12h，再更换在不加腺嘌呤核苷的培养基中继续培养I周；接着向培养基中通入氦气并保持压力为60磅/英寸2，在22°C的培养条件下培养20h后放出氦气；
54:将S3步骤处理完毕的细胞转接入MS+NAA 0.3mg .L-1'+ΚΤ 0.3mg七1+蔗糖30g .L-1+甘油10%的液体培养基中，在:TC的低温条件下培养20h后再放在温度为20°C条件下恢复培养48h。
[0020]在经过S4步骤处理后，取少量细胞用滴管吹吸，将细胞打散混匀，滴I滴细胞悬液于冷冻干燥后的载玻片上，用席夫式染液染色制片，经显微镜观察并计算出分裂指数。
[0021]实施例6:—种提高川贝母细胞同步化的诱导方法，它包括以下步骤:
51:将由川贝母鳞片叶诱导产生的愈伤组织切成0.5~2cm2的大小转接到产生疏松愈伤组织的培养基 MS+6-BA 0.3mg.L:+NAA 0.8mg.L:+2,4-D 2.0mg.L1+ 鹿糖 35g.L1+琼脂5.0g.L-1中进行培养，pH值为6.0,培养条件:温度23°C，每天光照9h，光照强度为12001x ；
52:将SI步骤获得的疏松愈伤组织按15g.L-1的接种量接入MS+KT 0.6mg.1^+2，4-D
1.5mg七1+蔗糖20g l-1的液体培养基中进行悬浮培养，pH值为5.6，培养条件:温度21°C，每天光照6h，光照强度为ΙΟΟΟΙχ，摇床转速为80r/min的条件下，进行25天继代培养一次；
53:在S2步骤的悬浮培养过程中，选取在第三次继代培养基中添加I~3mmol/L的腺嘌呤核苷培养处理细胞15h，再更换在不加腺嘌呤核苷的培养基中继续培养I周；接着向培养基中通入氦气并保持压力为70磅/英寸2，在20~25°C的培养条件下培养18h后放出氦气；
54:将S3步骤处理完毕的细胞转接入MS+NAA 0.3mg .l'+ΚΤ 0.4mg七1+蔗糖35g.171+甘油20%的液体培养基中，在4°C的低温条件下培养18h后再放在温度为22°C条件下恢复培养30h。
[0022]在经过S4步骤处理后，取少量细胞用滴管吹吸，将细胞打散混匀，滴I滴细胞悬液于冷冻干燥后的载玻片上，用席夫式染液染色制片，经显微镜观察并计算出分裂指数。
[0023]实施例7:—种提高川贝母细胞同步化的诱导方法，它包括以下步骤:
51:将由川贝母鳞片叶诱导产生的愈伤组织切成0.5~2cm2的大小转接到产生疏松愈伤组织的培养基中进行培养，PH值为5.6，培养条件:温度20°C，每天光照8h，光照强度为IOOOlx ；
52:将SI步骤获得的疏松愈伤组织按16g.L-1的接种量接入MS+KT 1.0mg.L-1+2,4-D
2.0mgL-1+蔗糖IOgL-1的液体培养基中进行悬浮培养，pH值为5.5，培养条件:温度18°C，每天光照6h，光照强度为6001x，摇床转速为80r/min的条件下，进行20天继代培养一次；
53:在S2步骤的悬浮培养过程中，选取在第三次继代培养基中添加lmmol/L的腺嘌呤核苷培养处理细胞10h，再更换在不加腺嘌呤核苷的培养基中继续培养I周；接着向培养基中通入氦气并保持压力为50磅/英寸2，在20°C的培养条件下培养12h后放出氦气；
54:将S3步骤处理完毕的细胞转接入MS+NAA 0.5mgL-1+ΚΤ 0.5mgL+1+蔗糖20g L-1+甘油5%的液体培养基中，在1°C的低温条件下培养12h后再放在温度为18°C条件下恢复培养 24h。
[0024]在经过S4步骤处理后，取少量细胞用滴管吹吸，将细胞打散混匀，滴I滴细胞悬液于冷冻干燥后的载玻片上，用席夫式染液染色制片，经显微镜观察并计算出分裂指数。
[0025]实施例8:一种提高川贝母细胞同步化的诱导方法，它包括以下步骤:
S1:将由川贝母鳞片叶诱导产生的愈伤组织切成0.5~2cm2的大小转接到产生疏松愈伤组织的培养基中进行培养，PH值为6.5，培养条件:温度25°C，每天光照12h，光照强度为18001x ；
S2:将SI步骤获得的疏松愈伤组织按20g.L-1的接种量接入MS+KT 0.5mg.L-1+2，4-D
2.0mg七1+蔗糖IOg -L-1的液体培养基中进行悬浮培养，pH值为6.0,培养条件:温度22°C，每天光照10h，光照强度为ΙΟΟΟΙχ，摇床转速为lOOr/min的条件下，进行30天继代培养一次；
S3:在S2步骤的悬浮培养过程中，选取在第三次继代培养基中添加3mmol/L的腺嘌呤核苷培养处理细胞18h，再更换在不加腺嘌呤核苷的培养基中继续培养I周；接着向培养基中通入氦气并保持压力为80磅/英寸2，在25°C的培养条件下培养24h后放出氦气；
S4:将S3步骤处理完毕的细胞转接入MS+NAA 0.1mg L-1+ΚΤ 0.1mg七1+蔗糖40g L-1+甘油20%的液体培养基中，在5°C的低温条件下培养24h后再放在温度为22°C条件下恢复培养48h。
[0026]在经过S4步骤处理后，取少量细胞用滴管吹吸，将细胞打散混匀，滴I滴细胞悬液于冷冻干燥后的载玻片上，用席夫式染液染色制片，经显微镜观察并计算出分裂指数。
[0027]实施例9:一种提高川贝母细胞同步化的诱导方法，它包括以下步骤:
51:将由川贝母鳞片叶诱导产生的愈伤组织切成0.5~2cm2的大小转接到产生疏松愈伤组织的培养基中进行培养，PH值为6.0，培养条件:温度22°C，每天光照10h，光照强度为16001x ；
52:将SI步骤获得的疏松愈伤组织按20g.L-1的接种量接入MS+KT 1.0mg.1^+2，4-D2.0mg吨―1+蔗糖25g.L-1的液体培养基中进行悬浮培养，pH值为6.0,培养条件:温度20°C，每天光照8h，光照强度为8001x，摇床转速为90r/min的条件下，进行25天继代培养一次；
53:在S2步骤的悬浮培养过程中，选取在第三次继代培养基中添加2mmol/L的腺嘌呤核苷培养处理细胞16h，再更换在不加腺嘌呤核苷的培养基中继续培养I周；接着向培养基中通入氦气并保持压力为60磅/英寸2，在22°C的培养条件下培养18h后放出氦气；
54:将S3步骤处理完毕的细胞转接入MS+NAA 0.5mg.L-1+KT 0.5mg.L-1+蔗糖240g.L—1+甘油20%的液体培养基中，在3°C的低温条件下培养20h后再放在温度为20°C条件下恢复培养36h。
[0028]实施例10:—种提高川贝母细胞同步化的诱导方法，它包括以下步骤:
S1:将由川贝母鳞片叶诱导产生的愈伤组织切成Icm2的大小转接到产生疏松愈伤组织的培养基 MS+6-BA 0.3mg *L 1 +NAA 0.5 mg *L:+2,4-D 2.0mg.L1+ 鹿糖 30 ~50g *L k 琼脂5g.L-1中进行培养，在pH值为6.0，培养温度21 °C，每天光照IOh和光照强度为12001x的条件下培养。
[0029]S2:将SI步骤获得的疏松愈伤组织按15g .L-1的接种量接入MS+KT 0.5mg -L^+2,4-D 1.0mg.L-1+蔗糖20g.L-1的液体培养基中进行悬浮培养，在pH值为5.8，培养温度20°C、每天光照8h和光照强度为8001x，摇床转速为90r/min的条件下，以25天继代培养一次。
[0030]S3:在S2步骤的悬浮培养过程中，选取在第三次继代培养基中添加2mmol/L的腺嘌呤核苷培养处理细胞14h，再更换在不加腺嘌呤核苷的培养基中继续培养I周；接着采取缓慢向培养基中通入氦气并保持压力为60磅/英寸2，在22°C的条件下培养18h后，放出氦气。
[0031]S4:将在S3步骤处理完毕的细胞，转接入MS+NAA 0.3mg -L+KT 0.3mg.L-1+蔗糖30g.L-1+甘油15%的液体培养基中，在3°C的低温条件下培养18h后，再放在为温度20°C条件下恢复培养36h。
[0032]在经过S4步骤处理后，取少量细胞用滴管吹吸，将细胞打散混匀，滴I滴细胞悬液于冷冻干燥后的载玻片上，用席夫式染液染色制片，经显微镜观察并计算出分裂指数。
[0033]下面通过实验进一步说明本发明的效果:
实验一:本发明细胞分裂指数测定
SI步骤:将由川贝母鳞片叶诱导产生的愈伤组织切成Icm2的大小转接到产生疏松愈伤组织的培养基 MS+6-BA 0.3mg.I/1 +NAA 0.5 mg.L_1+2,4-D 2.0mg.L-1+ 蔗糖 30 ~50g.L-1+琼脂5 g.L—1中进行培养，在pH值为6.0，培养温度21°C，每天光照IOh和光照强度为12001x的条件下培养。S2步骤:将SI步骤获得的疏松愈伤组织按15g.L-1的接种量接入MS+KT 0.5mg.L^+2,4-D 1.0mg.L-1+蔗糖20g.L-1的液体培养基中进行悬浮培养，在PH值为5.8，培养温度20°C、每天光照8h和光照强度为8001x，摇床转速为90r/min的条件下，以25天继代培养一次。S3步骤:在S2步骤的悬浮培养过程中，选取在第三次继代培养基中添加2mmol/L的腺嘌呤核苷培养处理细胞14h，再更换在不加腺嘌呤核苷的培养基中继续培养I周；接着采取缓慢向培养基中通入氦气并保持压力为60磅/英寸2，在220C的条件下培养18h后，放出氦气。S4步骤:将在S3步骤处理完毕的细胞，转接入MS+NAA
0.3mg.r+KT 0.3mg.L-1+蔗糖30g.L-1+甘油15%的液体培养基中，在3°C的低温条件下培养18h后，再放在为温度20 V条件下恢复培养36h。在完成上述步骤后，取出细胞进行细胞分裂指数测定。取少量细胞，用滴管反复吹吸，将细胞打散混匀，滴I滴细胞悬液于冷冻干燥后的载玻片上，用席夫式染液染色制片，经显微观察每个样本，得其分裂指数为92.3%。
[0034]实验二:在实验一 S3步骤中改加入1.0mmoI/L腺嘌呤核苷处理川贝母细胞，其他步骤同实验一，其测得的川贝母细胞分裂指数为82.8%。
[0035]实验三:在实验一 S4步骤中的15%的甘油改为5%，其他步骤同实验一，其测得的川贝母细胞分裂指数为79.5%。
[0036]实验四:在实验一 S4步骤的低温处理温度改为5°C，其他步骤同实验一，其测得的川贝母细胞分裂指数为75.6%。[0037]实验五:在实验一 S4步骤中培养的细胞，放在5°C的低温条件下培养12h后，再放在为温度22°C条件下恢复培养24h，其他步骤同实验一，其测得的川贝母细胞分裂指数为63.3%。
[0038]实验六:取消实验一 S3步骤中用2.0mmoL/L的腺嘌呤核苷处理环节，其他步骤同实验一，其测得的川贝母细胞分裂指数为36.7%。
[0039]实验七:将实验一 S3步骤全部取消，其他步骤同实验一，其测得的川贝母细胞分裂指数为6.2%。
[0040]实验八:将实验一 S3步骤全部取消，其他步骤同实验一，其测得的川贝母细胞分裂指数为38.1%。
[0041]通过实验表明，本发明诱导方法能有效提高川贝母细胞同步化，能显著的提高川贝母细胞的分裂指数，能有效地提高其后续的多倍体诱导率，进而能有效提高川贝母的产量及药用成分含量。
【权利要求】
1.一种提高川贝母细胞同步化的诱导方法，其特征在于:它包括以下步骤: 51:将由川贝母鳞片叶诱导产生的愈伤组织切成0.5~2cm2的大小转接到产生疏松愈伤组织的培养基中进行培养，pH值为5.6~6.5，培养条件:温度20~25°C，每天光照8~12h，光照强度为1000~18001x ； 52:将SI步骤获得的疏松愈伤组织按5~20g.L-1的接种量接入MS+KT 0.5~1.0mg *L_1+2,4-D 0.5~2.0mg *L-1+鹿糖10~25g *L_1的液体培养基中进行悬浮培养,pH值为5.5~6.0，培养条件:温度18~22°C，每天光照6~10h，光照强度为600~ΙΟΟΟΙχ，摇床转速为80~100r/min的条件下，进行20~30天继代培养I次； 53:在S2步骤的悬浮培养过程中，选取在第三次继代培养基中添加I~3mmol/L的腺嘌呤核苷培养处理细胞10~18h，再更换在不加腺嘌呤核苷的培养基中继续培养I周；接着向培养基中通入氦气并保持压力为50~80磅/英寸2，在20~25°C的培养条件下培养12~24h后放出氦气； 54:将S3步骤处理完毕的细胞转接入MS+NAA 0.1~0.5mg.171+KT 0.1~0.5mg.171+蔗糖20~40g吨―1+甘油5~20%的液体培养基中，在I~5°C的低温条件下培养12~24h后再放在温度为18~22°C条件下恢复培养24~48h。
2.根据权利要求1所述的一种提高川贝母细胞同步化的诱导方法，其特征在于:S1步骤中所述的培养基为:MS+6-BA 0.1 ~0.5mg.L-1+NAA 0.1 ~1.0mg.1^+2Α~?> 1.0 ~4.0mg.L1+ 鹿糖 30 ~50g.L1+ 琼脂 4.5 ~6.0g.L 工。
3.根据权利要求1所述的一种提高川贝母细胞同步化的诱导方法，其特征在于:S1步骤中培养条件:温度20°C，每天光照12h，光照强度为16001x。
4.根据权利要求1所述的一种提高川贝母细胞同步化的诱导方法，其特征在于:S2步骤中培养条件:温度20°C，每天光照8h，光照强度为8001x。
5.根据权利要求1所述的一种提高川贝母细胞同步化的诱导方法，其特征在于:S3步骤中向培养基中通入氦气并保持压力为60磅/英寸2，在22°C的培养条件下培养20h后放出氦气。
6.根据权利要求1所述的一种提高川贝母细胞同步化的诱导方法，其特征在于:S4步骤中培养条件:在3°C的低温条件下培养20h后再放在温度为20°C条件下恢复培养48h。
7.根据权利要求1所述的一种提高川贝母细胞同步化的诱导方法，其特征在于:在经过S4步骤处理后，取已处理过的细胞用滴管吹吸，将细胞打散混匀，滴I滴细胞悬液于冷冻干燥后的载玻片上，用席夫式染液染色制片，经显微镜观察并计算出分裂指数。
【文档编号】C12N5/04GK103468633SQ201310436772
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月24日 优先权日:2013年9月24日
【发明者】薛刚, 王跃华, 余强, 王晓蓉 申请人:薛刚