专利名称：白蚁内源木质纤维酶Bac-to-Bac重组杆状病毒的构建方法
技术领域：
本发明涉及白蚁内源木质纤维酶重组杆状病毒的构建方法。
背景技术：
生物质能是通过植物的光合作用把太阳能以化学能形式在生物质中储存的一种能源形式，是重要的可再生能源。上世纪以来，随着现代工业的快速发展和世界人口的激增，当前人类正面临着能源和石油危机的严峻挑战。 乙醇作为高效、环保的燃料及添加剂在社会生产及居民生活中发挥着不可替代的作用，大力发展乙醇，逐步取代汽油作为主要能源势在必行。目前，燃料乙醇的生产主要依靠粮食作物，但粮食作物资源很难满足日益增长的能源需求，与宝贵的粮食资源不同，木质纤维原料是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。木质纤维原料中纤维素及半纤维素约占干重的60-85%，纤维素、半纤维素经酶学降解生产单糖是公认的最理想的的转化方法。因此，纤维素酶和半纤维素酶的研究一直是生物学领域的重要课题之一。自然界微生物对木质纤维的降解是一个缓慢的过程，虽然对木质纤维有较完整和彻底的降解能力，但降解效率却并不高，使之成为木质纤维材料利用的限速步骤和瓶颈环节。而白蚁由于自身对生长养分来源的需求，其自身从咀嚼器官、消化管到酶系、共生微生物群落等，都为木质纤维素的降解提供了最为高效的机制，白蚁内外源木质纤维酶的开发被认为是大量转化和利用木质纤维生物能源的重要参考途径。因此，以白蚁作为模式生物，对其木质纤维降解体系进行研究已成为近年来的学术热点。在研究白蚁内源木质纤维酶的过程中仍存在着许多问题有待解决，其中与传统微生物产纤维素、半纤维素酶的克隆表达不同，白蚁内源木质纤维酶区别于细菌、真菌内源酶，是一种昆虫内源酶，其合成后修饰系统区别于大肠杆菌、酵母菌等传统表达体系，而目前的研究主要集中于利用传统微生物表达体系进行酶的克隆、表达，利用这种传统微生物表达体系进行白蚁内源木质纤维酶的克隆和表达，很难保证表达产生的酶蛋白具有原始活性。因此，在白蚁内源酶蛋白表达过程中，需要一种接近白蚁自身蛋白表达加工的高效表达体系。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有白蚁内源木质纤维酶的蛋白表达很难保证具有原始活性的问题，而提供白蚁内源木质纤维酶Bac-to-Bac重组杆状病毒的构建方法。本发明的白蚁内源木质纤维酶Bac-to-Bac重组杆状病毒的构建方法是按以下步骤进行的一、参照GenBank中发表的黑翅土白蚁(Odontotermes formosanus)的EG酶的基因序列，设计引物Pl和P2，以黑翅土白蚁cDNA为模板，进行PCR扩增，对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的片段，并与PMD18-T载体进行连接，获得Pl8EGI ；二、用Hind III和EcoR I对pFastBacl转移载体和步骤一获得的pl8EGl分别进行双酶切，分别回收双酶切后的pFastBacl转移载体和双酶切得到的EG基因的目的条带，将回收的EG与pFastBacl进行连接，连接产物经鉴定后获得pFBEGl ；三、将pFBEGl转化至大肠杆菌DHlOBac感受态细胞并筛选白色单菌落，然后提取重组Bacmid DNA，以IOOng重组Bacmid DNA为模板，以Pl和P2为引物，进行PCR扩增，将含有F基因的重组Bacmid命名为Bacmid-EG ；四、利用脂质体介导转染法将重组Bacmid-EG转染sf9细胞，获得重组杆状病毒BVEGl，即完成白蚁内源木质纤维酶Bac-to-Bac表达载体的构建；其中，步骤一和步骤三中所述的引物Pl序列均为5’ -ACATTCCACTTCAGAAGACGTC-3’ ；引物P2为5’ -TGCAGAGGACGAATTCCTTTA-3’。 本发明的有益效果本发明利用PCR获得白蚁内源纤维素酶EG基因片段，将其连入到质粒载体PMD18-T多克隆位点中，获得重组质粒，经转化、蓝白筛选后获得重组质粒P18EG1，经PCR及酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示，PCR、酶切结果与预期结果相符，利用酶切连接的方法将EG基因片段转入pFastBackl质粒中，转化筛选后获得pFBEGl重组质粒，转染昆虫细胞后，获得带有白蚁内源纤维素酶基因的重组杆状病毒。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统利用昆虫杆状病毒作为传递媒介，可将外源蛋白基因整合在昆虫杆状病毒基因组中，并保证病毒的完整性，经过病毒的包装和侵染，外源基因进入昆虫细胞，利用病毒自身的中晚期强启动子，在昆虫细胞中高效表达外源蛋白基因，杆状病毒的宿主范围仅限于昆虫和少数其他无脊椎动物，其专一性使其对人和哺乳动物是安全的。杆状病毒除个别基因外绝大多数基因无剪接作用，能够最大程度保证外源基因的功倉泛。本发明以白蚁作为研究目标，克隆白蚁内源木质纤维酶基因，利用昆虫杆状病毒表达体系(Bac-to-Bac)构建重组杆状病毒，经过转染、扩毒，利用昆虫细胞高效表达白蚁内源木质纤维酶，最大程度接近白蚁自身内源木质纤维酶的表达环境，为提高表达产物活性提供最佳条件。从而找到高效、低成本的转化木质纤维的酶系，解决木质纤维生产乙醇等可再生能源的瓶颈环节问题。
图I为EG基因的PCR电泳图，其中，I为EG基因的PCR产物，M为DNA MarkerDL15, 000；图2 为 pFastBacl、pl8EGl 双酶切电泳图，其中，I 为 pl8EGl 的 Hind III和 EcoR I双酶切胶回收产物电泳图，2为pFastBacl的Hind III和EcoR I双酶切胶回收产物电泳图，M 为 DNA Marker DL15,000 ；图3为重组Bacmid的PCR鉴定电泳图，其中，I和2为重组Bacmid的PCR产物电泳图，M 为 DNA Marker DL15, 000 ；图4为重组杆状病毒PCR鉴定电泳图，其中，I至6为重组杆状病毒PCR产物电泳图，7为未携带EG基因的重组杆状病毒PCR产物电泳图，M为DNA Marker DL15，000。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式的白蚁内源木质纤维酶Bac-to-Bac重组杆状病毒的构建方法是按以下步骤进行的一、参照GenBank中发表的黑翅土白蚁(Odontotermes formosanus)的EG酶的基因序列，设计引物Pl和P2，以黑翅土白蚁cDNA为模板，进行PCR扩增，对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的片段，并 与PMD18-T载体进行连接，获得Pl8EGI ；二、用Hind III和EcoR I对pFastBacl转移载体和步骤一获得的pl8EGl分别进行双酶切，分别回收双酶切后的pFastBacl转移载体和双酶切得到的EG基因的目的条带，将回收的EG与pFastBacl进行连接，连接产物经鉴定后获得pFBEGl ；三、将pFBEGl转化至大肠杆菌DHlOBac感受态细胞并筛选白色单菌落，然后提取重组Bacmid DNA，以IOOng重组Bacmid DNA为模板，以Pl和P2为引物，进行PCR扩增，将含有F基因的重组Bacmid命名为Bacmid-EG ；四、利用脂质体介导转染法将重组Bacmid-EG转染sf9细胞，获得重组杆状病毒BVEGl，即完成白蚁内源木质纤维酶Bac-to-Bac表达载体的构建；其中，步骤一和步骤三中所述的引物Pl序列均为5’ -ACATTCCACTTCAGAAGACGTC-3’ ；引物P2为5’ -TGCAGAGGACGAATTCCTTTA-3’。本实施方式的引物Pl和P2是参照GenBank中收录的Odontotermes formosanusEG酶(GenBank编号为⑶326330. I)序列，通过比较分析，应用生物软件Primer5. 0设计引物(表I)。表I引物序列
引物引物序列方问用途
Pl5' ACATTCCACTTCAGAAGACGTC 3' +七'..咋 EG .iAM
P2c5'TGCAGAGGACGAATTCCTTTA35—扩增 EG 基因注引物方向“ + ”代表上游引物，“一”代表下游引物；引物保存浓度100 U M，保存于_78°C冰箱，工作浓度为20 U M，保存于_20°C冰箱。本实施方式步骤一中的白蚁cDNA的序列为GenBank中发表的黑翅土白蚁(Odontotermes formosanus)的序列，GenBank 编号为 GU32633O. I。本实施方式中的大肠杆菌DH5 a感受态细胞与大肠杆菌DHlOBac感受态细胞购买自 Invitrogen 公司。本实施方式步骤一中1%琼脂糖凝胶电泳检测的是大小为1700bp的EG酶基因片段(如图I所示)。
本实施方式步骤一中的纯化回收采用购买自上海华舜生物工程有限公司的DNA胶回收试剂盒(Gel Extraction Mini Kit)进行回收,试剂盒中包含SI、Wl、TE溶液。纯化回收的具体操作步骤如下(I)在紫外灯下切下含1700bp的EG酶基因条带的琼脂糖块，称重后，加3倍体积SI液后，置于50°C水浴5-10min,使琼脂糖块完全溶化,每隔2min颠倒混匀一次；(2)将溶化的琼脂糖凝胶液体移入吸附柱中，12000r/min离心lmin，使产物吸附于吸附膜上，将收集管中的液体倒掉，再将吸附柱放入同一个收集管中；(3)在吸附柱中加500 ii L Wl液，12000r/min离心lmin，弃掉收集管中液体，将吸附柱放入同一个收集管中；(4)在吸附柱中再加入500 ii L Wl液，静置lmin后，12000r/min离心lmin ; (5)将收集液倒掉，再将吸附柱放入同一个收集管中，12000r/min离心Imin ；(6)将吸附柱放入一个干净的I. 5mL离心管中，于吸附膜中央加30 u LTE溶液，放A 50°C水浴2min, 12000r/min离心lmin。取I. 5mL离心管中的液体直接进行连接或用封口膜封好后，于-20°C保存。本实施方式步骤一中纯化后的产物与pMD18-T载体在16°C连接过夜进行连接，连接反应体系为10 u L,反应条件为
权利要求
1.白蚁内源木质纤维酶Bac-to-Bac重组杆状病毒的构建方法，其特征在于白蚁内源木质纤维酶Bac-to-Bac重组杆状病毒的构建方法是按以下步骤进行的 一、参照GenBank中发表的黑翅土白蚁(Odontotermesforimosanus)的EG酶的基因序列，设计引物Pl和P2，以黑翅土白蚁cDNA为模板，进行PCR扩增，对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，采用胶回收试剂盒进行纯化回收，获得目的片段，并与PMD18-T载体进行连接，获得P18EG1 ； 二、用HindIII和EcoR I对pFastBacl转移载体和步骤一获得的pl8EGl分别进行双酶切，分别回收双酶切后的pFastBacl转移载体和双酶切得到的EG基因的目的条带，将回收的EG与pFastBacl进行连接，连接产物经鉴定后获得pFBEGl ； 三、将pFBEGl转化至大肠杆菌DHlOBac感受态细胞并筛选白色单菌落，然后提取重组Bacmid DNA，以IOOng重组Bacmid DNA为模板，以Pl和P2为引物，进行PCR扩增，将含有F基因的重组Bacmid命名为Bacmid-EG ； 四、利用脂质体介导转染法将重组Bacmid-EG转染sf9细胞，获得重组杆状病毒BVEG1，即完成白蚁内源木质纤维酶Bac-to-Bac表达载体的构建；其中，步骤一和步骤三中所述的引物Pl序列均为5’ -ACATTCCACTTCAGAAGACGTC-3’ ；引物P2为5’ -TGCAGAGGACGAATTCCTTTA-3’。
2.根据权利要求I所述的白蚁内源木质纤维酶Bac-to-Bac重组杆状病毒的构建方法，其特征在于步骤一和三中所述的PCR扩增的反应体系为50 ii L反应体系，由下列成分组成 药品加入#积终浓度10X TaqPlus 缓冲液5jiLIXdNTP 混合物(IOmM)4^L0.8mM上游引物(P1,20UM)I^iL0.4nM下游引物(P2,20uM)I^L0.4(iM 模板 cDNA4^L热启动酶(2.5U/UL)0.5|_iL1.25U 补加ddftO至50|iL PCR扩增条件为步骤H寸间温度循环数预变性2min94°CI 变性IOsec98°C退火15sec55°C30 延伸2.5min72°C终延伸7min72°CI 0
3.根据权利要求I所述的白蚁内源木质纤维酶Bac-to-Bac重组杆状病毒的构建方法，其特征在于步骤一中连接体系如下成分体积 pMD18-T 载体I^L EG基因胶丨司收产物3 nL连接混合液5pL ddH20补加至IOpL 连接反应条件为16°C连接过夜。
4.根据权利要求I所述的白蚁内源木质纤维酶Bac-to-Bac重组杆状病毒的构建方法，其特征在于步骤二中双酶切反应体系为50ii L，条件为成分体枳质粒10成 Hinm (15U/nL)2.5^L Ecd^ I (15U/nL)2.5(xLIOX H buiTcr5[iL ddH20补至 50pL 37 °C水浴作用2h。
5.根据权利要求I所述的白蚁内源木质纤维酶Bac-to-Bac重组杆状病毒的构建方法，其特征在于步骤二中连接体系如下 成分体积 IOx连接缓冲液 带有粘性末端pFastBacl纯化产物I^iLEG基因纯化产物3^L T4 DNA连接酶0.5叫 ddH20补至 IOnL 连接反应条件为16°C连接过夜。
全文摘要
白蚁内源木质纤维酶Bac-to-Bac重组杆状病毒的构建方法，它涉及白蚁内源木质纤维酶重组杆状病毒的构建方法。本发明的目的是为了解决现有白蚁内源木质纤维酶的蛋白表达很难保证具有原始活性的问题。本发明利用PCR获得白蚁内源纤维素酶EG基因片段，连入pMD18-T，获得重组质粒，经转化、蓝白筛选后获得重组质粒p18EG1，经PCR及酶切鉴定，将EG基因片段转入pFastBack1质粒中，转化筛选后获得pFBEG1重组质粒，转染昆虫细胞后，即得。本发明最大程度接近白蚁自身内源木质纤维酶的表达环境，为提高表达产物活性提供最佳条件，从而找到高效、低成本的转化木质纤维的酶系。
文档编号C12N15/866GK102676584SQ20121017099
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月29日 优先权日2012年5月29日
发明者于德水, 原韬, 张介驰, 张晓彦, 谷军 申请人:黑龙江省科学院微生物研究所