一种酶法转化海参总皂苷制备次生皂苷的方法
【专利摘要】本发明公开了一种酶法转化海参总皂苷制备次生皂苷的方法，包括以下步骤：a)将鲜海参去除内脏，放入沸水中煮，得到海参蒸煮液；b)海参蒸煮液调节pH，离心得到上清液；c)上清液过柱，分别用去离子水和20%乙醇溶液冲洗树脂，再用70%乙醇溶液进行洗脱，收集70%乙醇溶液洗脱组分；d)减压浓缩所收集的洗脱组分，至浸膏状，用去离子水复溶，离心取上清，上清液经石油醚萃取脱脂，取水层再用水饱和正丁醇萃取，减压浓缩至浸膏状，冷冻干燥即得海参总皂苷；e)采用蜗牛酶酶解海参总皂苷；f)减压浓缩后进行冷冻干燥，即得海参次生皂苷。本发明条件温和，制备方法简单。
【专利说明】一种酶法转化海参总皂苷制备次生皂苷的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种酶法转化海参总皂苷制备次生皂苷的方法。
【背景技术】
[0002]海洋中蕴藏着极为丰富的资源和能源，而我国海区拥有的物种也十分多样，随着海洋产业不断的快速发展，越来越多的企业家都把目光投向了海洋这块市场，因此近十几年来我国海洋制药行业发展得十分迅猛，而国内对棘皮动物门中海参的研究也是一大热门的领域。
[0003]海参为棘皮动物门(Echinodenmata)海参纲(Holothunoider)生物，全世界的海参有1200多种，我国海域约有140多种。在海参体壁和内脏中，能分泌出一些活性作用很强的物质，即海参皂苷，它是海参主要次生代谢产物，也是其进行化学防御的物质基础。药理实验表明，海参皂苷大都具有强烈的生理活性作用，如抗肿瘤、抗真菌、抗炎、抗病毒、提高免疫力、溶血性及抗胆碱作用等。
[0004]目前，国内外对海参体壁、海参加工废液、海参体腔液中的皂苷提取工艺进行了研究，例如2011年8月17日公开的CN102150851A发明专利申请公开的“海参皂苷及其制备方法、在食品药品中的应用”；又如:2011年5月18日公开的CN102060905A发明专利申请公开的“利用鲜海参加工废液制备海参皂苷Holotoxin Al对照品的工艺方法”;还有，2012年6月27日公开的CN102512452A发明专利申请公开的“利用海参体腔液制备海参皂苷的工艺方法”。
[0005]至今为止，已经从海参中分离出至少140多种的海参皂苷。海参皂苷由苷元和寡糖链两部分组成，含有5个角甲基，苷元的3位上有羟基取代，与糖通过β -O糖苷键结合成苷。海参皂苷的化学结构十分复杂多样，侧链的结构、内酯环的变化、双键的位置以及12、16、17位上的取代基上的变化都会引起苷元结构的变化，而寡糖链的结构会因单糖的连接位置和顺序、单糖的组成和数目、硫酸酯基的连接位置和数目等发生变化。药理活性研究表明，海参皂苷的活性与苷元、寡糖链的结构都有关系。对于苷元结构相同、而糖基侧链不同的物质，它们的药理活性也有着显著的差别。因此，改变海参皂苷糖基侧链的结构，有可能得到药用价值更高的次生皂苷。
[0006]对天然产物结构的修饰主要有化学法、微生物法和酶法。化学法主要包括酸碱法，虽然操作简单，但专一性差，且大量使用有机溶剂会对环境造成污染；而很多天然产物的生物转化采用微生物发酵法，即用微生物产生的代谢酶对底物进行水解，微生物法专属性较强，条件温和，环境污染小，但微生物发酵法培养条件苛刻，且发酵需要寻找高效的菌株以满足工业化生产的需要。因此，相比于化学法和微生物发酵法，体外酶法专一性强，酶解效率高，操作简单，只要确定酶反应的最适条件即可。有关皂苷类的酶法转化研究目前在人参皂苷、三七皂苷、大豆皂苷等取得较大的进展。2009年7月15日公开的CN101481725A发明专利申请公开的“酶促水解人参皂苷Rb1制备人参皂苷F2的方法”中就将含量较高、药用价值较低的人参皂苷Rb1转化成含量较低、药用价值较高的人参皂苷F2。而对于海参皂苷的生物转化，目前都还未有相关的研究报道。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种酶法转化海参总皂苷制备次生皂苷的方法。
[0008]本发明的技术方案如下:
[0009]一种酶法转化海参总皂苷制备次生皂苷的方法，包括以下步骤:
[0010]a)将鲜海参去除内脏，放入沸水中煮20— 30min，得到的即为海参蒸煮液；
[0011]b)海参蒸煮液调节pH至9.5-10.5,6000-10000r/min离心20_60min得到上清液；
[0012]c)上清液过AB-8型大孔树脂柱，分别用3-4倍柱体积的去离子水和20%乙醇溶液冲洗树脂，再用5-15倍柱体积的70%乙醇溶液进行洗脱，收集70%乙醇溶液洗脱组分；
[0013]d)减压浓缩所收集的洗脱组分，至浸膏状，用去离子水复溶，6000-10000r/min离心20-60min取上清，上清液经石油醚萃取脱脂，取水层再用水饱和正丁醇萃取2_4次，合并正丁醇层，减压浓缩至浸膏状，冷冻干燥即得海参总皂苷；
[0014]e)采用蜗牛酶酶解海参总皂苷，缓冲液为ρΗ3.5-4.50.005-0.02 μ mol/L的磷酸柠檬酸缓冲液，蜗牛酶粗酶与海参总皂苷的重量比例为1:1_3，在水浴锅中反应24-48h，用甲醇终止反应，并用0.5-2倍体积的乙醇萃取浸提12-36h ；
[0015]f)减压浓缩后，用去离子水复溶，再用水饱和正丁醇萃取2-4次，合并正丁醇层，减压浓缩后进行冷冻干燥，即得海参次生皂苷。
[0016]其中，本发明所用的海参优选为刺参。
[0017]其中，本发明步骤a)加入的沸水体积优选为:煮20— 30min后，每kg海参产生400-600ml倍蒸煮液。
[0018]其中，步骤d)去离子水复溶时，加入的体积优选为浸膏体积的1-5倍。
[0019]其中，步骤e)蜗牛酶粗酶优选在45°C水浴锅中活化lh。
[0020]其中，步骤e)水浴锅反应温度可以为40_50°C，优选为45°C。
[0021]本发明充分利用新鲜海参加工煮制过程中所产生的蒸煮液，从而能够分离提取出海参总皂苷，并用蜗牛酶粗酶对海参总皂苷进行转化，得到次生皂苷。本发明提供了一种利用蜗牛酶粗酶在温和的条件下选择性的催化水解海参总皂苷，从而得到更有潜力、更稀有的次生皂苷的方法。酶具有高效性、专一性等特点，而对于海参皂苷的生物转化，到目前为止都还未见有相关的研究报道。因此，本发明有助于海参皂苷在医学、制药行业的进一步发展。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为海参总皂苷冻干品。图1显示的即为海参总皂苷过AB-8型大孔树脂后得到的冻干样品。
[0023]图2为海参总皂苷酶解前后的薄层层析图谱。从图2中可以看出，在物料比1:2、pH4.0、45°C下反应36h，蜗牛酶将海参总皂苷成功转化为次生皂苷，酶解组分的迁移率为0.44±0.01。
[0024]图3为海参蒸煮液过AB-8型大孔树脂柱的薄层层析图谱。从图3可以看出，提取出的海参皂苷主要有两种类型。[0025]图4两种类型的海参皂苷酶解前后的薄层层析图谱。A、B表示两种不同类型的海参皂苷。
【具体实施方式】
[0026]实施例1
[0027](I)将IOOkg的新鲜海参取出内脏后，放入沸腾的开水中煮20_30min，IOOkg的海参产生约50kg的海参蒸煮液。取海参蒸煮液5L，调节pH值为10，8000r/min离心40min得到上清液。
[0028](2)将所得的上清液通过AB-8型大孔树脂柱，流速为2BV/h，吸附饱和后，用2L的去离子水冲洗，再用2L20%的乙醇溶液冲洗，最后用6L70%的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至浸膏状，用500mL的去离子水复溶,8000r/min离心40min取上清,上清液经石油醚萃取脱脂，取水层再用水饱和正丁醇萃取三次，合并正丁醇层，减压浓缩至浸膏状，冷冻干燥即得海参总皂苷。
[0029](3)配制500mL pH4.0，0.01 μ mol/L的磷酸柠檬酸盐缓冲液。首先，称取125mg的蜗牛酶粗酶，加入少量缓冲液，在45°C活化lh。另外，称取冷冻干燥得到的海参总皂苷250mg，用剩余的缓冲液溶解。将活化的蜗牛酶粗酶加入到海参总皂苷中，在45°C下恒温水浴反应36h。
[0030](4)用甲醇进行终止反应后，加入乙醇进行萃取浸提24h，减压浓缩后，用去离子水复溶，用水饱和正丁醇萃取三次，合并正丁醇层，减压浓缩后进行冷冻干燥，即得到海参次生皂苷，并用薄层层析法对样品进行检测，是否海参总皂苷发生了酶解反应。
[0031]图1显示的即为海参总皂苷过AB-8型大孔树脂后得到的冻干样品；而从图2中可以看出，在物料比1:2、pH4.0、45°C下反应36h，蜗牛酶将海参总皂苷成功转化为次生皂苷，酶解组分的迁移率为0.44 ± 0.01。
[0032]实施例2
[0033](I)将上述所述的海参蒸煮液500ml，调pH值为10，8000r/min离心40min得到上清液。
[0034](2)将上清液上样于预处理的AB-8型大孔树脂柱，流速为2BV/h，吸附饱和后，再分别用300ml的去离子水和20%乙醇溶液冲洗，接着用600ml70%的乙醇溶液洗脱，洗脱组分经薄层层析检测，收集不同种类的海参皂苷。减压浓缩至浸膏状，用去离子水复溶后，8000r/min离心40min取上清，上清液经石油醚萃取脱脂，取水层再用水饱和正丁醇萃取三次，合并正丁醇层，减压浓缩至浸膏状，冷冻干燥即得种类不同的海参皂苷。
[0035]从薄层层析图谱中(图3)可以看出，提取出的海参皂苷主要有两种类型。
[0036](3)将收集得到主要的两种类型的海参皂苷，分别对其进行酶解反应。各配制250mLpH4.0,0.01 μ mol/L的磷酸柠檬酸盐缓冲液，称取40mg的蜗牛酶粗酶，加入少量缓冲液，在45°C活化lh。另外,分别取冷冻干燥的两种海参皂苷各lOOmg，用剩余的缓冲液溶解。将活化的蜗牛酶粗酶加入到海参 总皂苷中，在45°C下恒温水浴反应36h。
[0037](4)用甲醇进行终止反应后，加入乙醇进行萃取浸提24h，减压浓缩后，用去离子水复溶，用水饱和正丁醇萃取三次，合并正丁醇层，减压浓缩并用薄层层析法检测两种类型的海参皂苷是否都发生了酶解。[0038]在物料比1: 2、pH4.0、45°C下反应36h进行酶解反应，从图4中可以看出，只有一种类型的海参皂苷发生了酶解，产生了 Rf值为0.44的海参皂苷，且从图4中可以看出酶解反应并未完全(图4-B)。将酶解后的样减压浓缩后，用去离子水复溶，静置一段时间，出现了絮状物，而加入无水乙醇，絮状物消失，表明溶液中有溶于醇而不溶于水的物质。去除乙醇后，将酶解样进行离心，沉淀用薄层层析(TLC)检测，如图4-B所示，说明白色的絮状物中存在大量的皂苷，也表明原本水溶性的海参皂苷酶解后，产生了不溶于水而溶于醇的次生皂苷。
【权利要求】
1.一种酶法转化海参总皂苷制备次生皂苷的方法，包括以下步骤: a)将鲜海参去除内脏，放入沸水中煮20-30min，得到的即为海参蒸煮液； b)海参蒸煮液调节pH至9.5-10.5,6000-10000r/min离心20_60min得到上清液； c)上清液过AB-8型大孔树脂柱，分别用3-4倍柱体积的去离子水和20%乙醇溶液冲洗树脂，再用5-15倍柱体积的70%乙醇溶液进行洗脱，收集70%乙醇溶液洗脱组分； d)减压浓缩所收集的洗脱组分，至浸膏状，用去离子水复溶，6000-10000r/min离心20-60min取上清，上清液经石油醚萃取脱脂，取水层再用水饱和正丁醇萃取2_4次，合并正丁醇层，减压浓缩至浸膏状，冷冻干燥即得海参总皂苷； e)采用蜗牛酶酶解海参总皂苷，缓冲液为PH3.5-4.50.005-0.02 μ mol/L的磷酸柠檬酸缓冲液，蜗牛酶粗酶与海参总皂苷的重量比例为1:1_3，在水浴锅中反应24-48h，用甲醇终止反应，并用0.5-2倍体积的乙醇萃取浸提12-36h ； f)减压浓缩后，用去离子水复溶，再用水饱和正丁醇萃取2-4次，合并正丁醇层，减压浓缩后进行冷冻干燥，即得海参次生皂苷。
2.如权利要求1所述的一种酶法转化海参总皂苷制备次生皂苷的方法，其特征在于:所述的海参为刺参。
3.如权利要求1所述的一种酶法转化海参总皂苷制备次生皂苷的方法，其特征在于:步骤a)加入的沸水体积为:煮20-30min后，每kg海参产生400-600ml倍蒸煮液。
4.如权利要求1所述的一种酶法转化海参总皂苷制备次生皂苷的方法，其特征在于:步骤d)去离子水复溶时，加入的体积为浸膏体积的1-5倍。
5.如权利要求1所述的一种酶法转化海参总皂苷制备次生皂苷的方法，其特征在于:步骤e)蜗牛酶粗酶在45°C水浴锅中活化lh。
6.如权利要求1所述的一种酶法转化海参总皂苷制备次生皂苷的方法，其特征在于:步骤e)水浴锅反应温度40-50°C。
【文档编号】C12P33/20GK103898186SQ201410057554
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年2月20日 优先权日:2014年2月20日
【发明者】林毅, 林淑芳 申请人:华侨大学