一种选育甘蓝型黄籽油菜隐性核不育临保系的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农作物育种技术领域，尤其涉及一种选育甘蓝型黄籽油菜隐性核不育临保系的方法。
【背景技术】
[0002]甘蓝型黄籽油菜种皮较薄、种子含油量高、油清澈透明、饼柏蛋白质含量高、纤维素和多酚含量低、饲料利用价值高，极大地改善了菜籽油和饼柏的商品价值，培育甘蓝型黄籽油菜已成为油菜育种的重要目标之一。瑞典教授Olsson(1960)从人工合成的甘蓝型油菜中首次找到了黄籽资源。此后，西德Robbelen(1981)、Jonsson(1983)、加拿大Stefansson (1986)也发现了甘蓝型黄籽油菜资源。1975年，华中农大刘后利教授从甘蓝型种间杂种后代中首次在中国发现了甘蓝型黄籽油菜。此后，国内其它单位如陕西省农垦中心(1980)、贵州农学院(1982)、江苏省农科院(1984)、中国农科院油料所(1985)等都对甘蓝型黄籽油菜开展了大量的应用和基础研宄工作。
[0003]与传统育种比较，小孢子培养技术可以缩短育种年限，提高育种效率。过去采用杂交育种法育成一个遗传性稳定的品种，需要很多年的时间。育种专家必须通过广泛的杂交、回交，然后进行自交，以保证新品种的同质性。现用小孢子培养方法，可以利用匕代产生的小孢子进行培养，获得单倍体植株，再经秋水仙碱使染色体加倍获得DH，育种时间可以缩短几年，特别适用于难以稳定性状的纯合，如甘蓝型油菜黄籽性状的纯合。同时育种家利用DH系在一个较小的群体中进行选择，可以大大提高常规育种的效率。例如在油菜低芥酸育种中，由于低芥酸油菜含双隐性基因，它在双单倍体中出现的频率是1/4，而在通常F2代中出现的频率是1/16。
[0004]黑籽隐性全不育系WSL1A是西南大学2013年选育定型的不育系，并于2013年4月通过重庆市品种审定委员会的鉴定。该品系的选育过程是从2006年引进皖油23杂种和德国NPZ公司MSL不育系材料开始，2007年对皖油23后代分离出的不育株与可育株成对兄妹交，皖油23后代和NPZ公司MSL不育系相互杂交，2008年根据育性分离和恢保关系鉴别隐性纯合两用系SL1AXSL1BdOOg年互换可育株测交确定临时保持系WSQB。2010-2012年连续临时保持系WSL1B与隐性纯合两用系不育株SL1A杂交，验证杂交后代为全不育系，进而定型为WSLA。该不育系花朵呈鲜黄色，花瓣小、雌蕊正常、雄蕊退化为褐色枯死状。甘蓝型黄籽恢复系SWU-05R来源于甘蓝型油菜多品系复合杂交后代经测交和定向选育获得的双低品系，SWU-05R于2013年4月通过重庆市品种审定委员会的鉴定。利用隐性全不育和恢复系可以生产杂交种，该不育系统选育的杂交种“渝油27”于2012年通过重庆市审定，已在生产上大面积推广。
[0005]选育甘蓝型黄籽油菜隐性全不育系是黄籽油菜杂交授粉系统的一个重要途径，获得黄籽临保系是先决条件。但是由于目前的临保系WSL1B为黑籽，临保系受2对以上隐性基因控制，需要广泛大量的测交。常规育种方法选育出的甘蓝型黄籽油菜都为WSL1A的恢复系，通过常规育种方法转育黄籽临保系，分离群体大，测交工作量和测交种后代育性鉴定工作量大，田间实施难度大。
【发明内容】
[0006]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种选育甘蓝型黄籽油菜隐性核不育临保系的方法，本发明提供的方法能够快速获得性状纯合、遗传稳定的黄籽隐性核不育临保系，方法简单，原始材料容易获得。
[0007]本发明提供了一种选育甘蓝型黄籽油菜隐性核不育临保系的方法，包括:
[0008]a)以黑籽隐性全不育品系为母本，甘蓝型黄籽品系为父本进行杂交，获得匕代；
[0009]b)采用甘蓝型油菜小孢子培养技术对Fl代植株的游离小孢子诱导培养，获得DH株系；
[0010]c)将DH株系与隐性纯合两型品系中的不育株测交，得到甘蓝型黄籽油菜核不育临保系。
[0011]本发明首先以黑籽隐性全不育为母本，以甘蓝型黄籽品系为父本杂交，获得匕代；然后采用甘蓝型油菜小孢子培养技术对F1代植株的游离小孢子诱导培养，秋水仙碱加倍获得DH株系；选择黄籽DH株系并与隐性纯合两型系不育株测交，测交种为100%不育，对应的黄籽DH单株即为本发明所述的黄籽隐性核不育临保系。通过本发明可以快速获得遗传稳定、性状纯合的黄籽临保系，为甘蓝型黄籽油菜杂交育种亲本创制提供新途径。
[0012]在本发明中，所述黑籽隐性全不育品系为WSL1A，系西南大学王瑞副研宄员选育而成，并于2013年4月通过重庆市品种委员会的鉴定。该不育系含油量40.09%、芥酸为0.02%、硫苷29.8umol/g，抗倒性强，农艺性状较为优良。
[0013]所述甘蓝型黄籽品系为甘蓝型黄籽恢复系SWU-05R，系西南大学李加纳教授选育而成，于2013年4月通过重庆市品种审定委员会的鉴定。该黄籽品系含油量41.44%、芥酸0%、硫苷含量26.3umol/g，农艺性状优良。
[0014]按照本领域技术人员公知的方法，在油菜花期以WSL1A为母本，以SWU-05R为父本杂交，获得匕代种子。
[0015]接着，采用甘蓝型油菜小孢子培养技术对Fl代植株的游离小孢子诱导培养，获得DH株系；具体方法如下:
[0016]bl)以F1代植株为供体，花期从油菜花序上取花蕾，在小孢子分离培养基中研磨、过滤、离心后获得小孢子沉淀物；
[0017]b2)将步骤bl)获得的小孢子沉淀物在含秋水仙碱的胚状体诱导培养液中培养；然后将获得的培养物离心，离心得到的小孢子沉淀物在不含秋水仙碱的胚状体培养液中培养至可见胚状体，转到摇床上继续培养至子叶期；
[0018]b3)将步骤b2)获得的子叶期胚状体转入胚状体成苗培养基中继续培养至成苗；
[0019]b4)步骤b3)获得的苗继续生长至花期，获得DH株系。
[0020]将匕代种子种植得到F 植株后，花蕾期时从生长健壮的植株F ，摘取主花序或一次分枝花序顶端部分的花蕾，其长度优选为3.5?4.0mm。
[0021]在小孢子分离培养基中研磨之前，首先对花蕾进行消毒和无菌水清洗，具体操作如下:
[0022]将花蕾用75 %的酒精浸泡0.5-lmin，无菌水冲洗3次；再用0.1 %的HgCl2浸泡12min，无菌水冲洗3次，每次大约5min。
[0023]将花蕾在小孢子分离培养基中进行研磨，具体操作为:
[0024]将消毒后的花蕾转入无菌小烧杯中，加入小饱子分离培养基，用玻璃注射器内筒挤压花蕾。
[0025]将研磨后的花蕾经过过滤，将滤液进行离心，获得小孢子沉淀物。在本发明中，优选经300目的滤网过滤。所述离心具体为:将滤液转入带刻度的容积为1ml的离心管中，100rpm离心3min，离心后倒掉上清液，重新加入小孢子分离培养基，离心3次，获得小孢子沉淀物。
[0026]在本发明中，所述小孢子分尚培养基包括:B5大量兀素、B5微量兀素、B5有机添加物、FeNaEDTA 13.2mg.L—1 和蔗糖 130g.L ―1 (pH = 6.0)。具体而言，其包括:
[0027]2500mg/L 的 KN03、250mg/L 的 MgSO4.7H20、150mg/L 的 CaCl2.2H20、134mg/L 的(NH4)2SO4'150mg/L 的 NaH2PO4.Η20、0.83mg/L 的 ΚΙ、3.0mg/L 的 H3B03、10mg/L 的 MnSO4.4Η20、2.0mg/L 的 ZnSO4.7Η20、0.25mg/L 的 Na2MoO4.2Η20、0.025mg/L 的 CoCl2.6Η20、0.025mg/L的CuSO4.5H20、100mg/L的肌醇、1.0mg/L的烟酸、1.0mg/L的盐酸卩比卩多醇、10mg/L的盐酸硫铵、13.2mg/L的FeNaEDTA和130g/L的蔗糖；所述小孢子分离培养基的pH值为6.0。
[0028]获得小孢子沉淀物后，将其加入含秋水仙碱的胚状体诱导培养液中培养，所述含秋水仙碱的胚状体诱导液包括:125mg/L的KN03、125mg/L的MgSO4.7H20、500mg/L的Ca4NO3.4H20、125mg/L 的 ΚΗ2Ρ04、26.4mg/L 的 FeNaEDTA、22.3mg/L 的 MnSO4.4Η20、6.2mg/L 的H3BO3> 8.6mg/L 的 ZnSO4.7Η20、0.025mg/L 的 CuSO4.5Η20、0.25mg/L 的 Na2MoO4.2Η20、0.025mg/L的CoCI2.6H20、100mg/L的肌醇、5mg/L的烟酸、0.5mg/L的盐酸吡哆醇、0.5mg/L的盐酸硫胺素、2mg/L的甘氨酸、0.5mg/L的叶酸、0.05mg/L的生物素30mg/L的谷胱甘肽、800mg/L的L-谷酰