乌拉尔甘草、光果甘草、胀果甘草及其杂交品种的快速分子鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于中药材品种鉴定技术领域，具体设及用特异的单核巧酸多态性 (single nucleotide polymorphism,SNP)位点对乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草W及乌 拉尔甘草与胀果甘草或光果甘草杂交后产生的样本进行准确鉴定和区分。
【背景技术】
[0002] 甘草作为最广泛使用的药用植物之一，在中国、美国、英国、欧洲、日本药典中均有 收载。2015版《中国药典》同时收载乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、光果甘 草(G. glabra L.)、胀果甘草(G. inflata Bat.)的干燥根和根茎作为甘草药材的来源，我 国主产品种为乌拉尔甘草。但不同品种的甘草在不同国家和地区的分布具有差异，例如，在 美国和欧洲部分地区，光果甘草是最主要的药用品种。
[0003] 甘草的传统形态学鉴定方法主要依赖于植物的地上部分特征，难W对甘草药材、 饮片W及各种加工品进行品种鉴定。显微鉴定方面，药材横切面的射线形态虽可作为甘草 品种区分的依据之一，但存在样品前处理困难、判别标准难W量化等问题，也无法对深加工 的药材饮片或粉末进行鉴定。化学成分方面，甘草的成分十分复杂，通过药材指纹图谱分析 也较难实现同属植物不同种的准确区分和鉴定。
[0004] DNA条形码技术是利用标准的、具有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段在 物种内的特异性和种间的多样性而创建的一种生物身份识别系统，从而实现对物种的快速 准确鉴定。Kenji等曾对不同品种甘草的ITS序列进行扩增和分析比对，发现胀果甘草和光 果甘草的ITS序列完全相同，同时与乌拉尔甘草的ITS序列在4个碱基位点存在差异(Biol. 曲arm. Bull. 2007，30，1497-1502)。因此，ITS序列中的SNP(single nucleotide polymor地ism,单核巧酸多态性)位点可用于乌拉尔甘草的鉴定。但文献(J.化t. Prod.， 2015, 78, 2007-2022)及本研究团队的实验结果（图1)均表明，在进行甘草样品的口S序列 扩增时，Kenji等所使用的ITS通用引物ITS4/5的扩增成功率和扩增效率较低，因此尚需通 过设计甘草ITS专属引物来提高PCR的准确性。此外，胀果甘草和光果甘草尚无较好的分子 鉴定方法。Kenji等筛选了叶绿体基因中的4个不同片段，仅tmH-psbA转录间隔区序列仅能 对大约80%的胀果甘草和光果甘草进行区分，仍有20%左右的样品无法通过目前已知的SNP 位点进行区分和鉴定(Biol. Pharm. Bull. 2007，30，1497-1502)。因此，对于Ξ个重要 的甘草药用品种，目前尚缺乏准确、高效的分子鉴定方法。
[000引本发明设计了用于甘草口 S序列扩增的特异性引物，继而对甘草中多个叶绿体DNA 片段进行了扩增和筛选，最终将甘草口 S序列和ndhC-trnV转录间隔区序列的SNP位点相结 合，建立了对乌拉尔甘草、光果甘草、胀果甘草Ξ个近缘物种及其杂交品种进行快速品种鉴 定的方法，有利于实现甘草的种苗培育、药材和饮片生产的规范化。
【发明内容】
[0006] 本发明第一个目的在于提供乌拉尔甘草、胀果甘草和光果甘草的鉴定用SNP标记。
[0007] 本发明第二个目的在于提供甘草鉴定用SNP标记在不同品种甘草鉴定中的应用。
[0008] 本发明第Ξ个目的在于提供不同品种甘草的快速分子鉴定方法和流程。
[0009] 本发明提供的乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草和其杂交品种的鉴定用SNP位点， 其核巧酸序列如SEQ ID No.l/2(ITS序列）和SEQ ID No.3/4(rKlhC-化nV转录间隔区序列） 所示，自口S序列的5'端起第159位为C或T，第383-385位为TGC或CAA;自mlhC-化nV转录间隔 区序列的5 '端起第487位为A或T。
[0010] 本发明提供的SNP位点可用于鉴定乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草和其杂交品 种:如果ITS序列5'端起第159位为C，且第383-385位为TGC，则鉴定为乌拉尔甘草;如果ITS 序列5'端起第159位为T，第383-385位为CAA，且iKlhC-trnV转录间隔区序列5'端起第487位 为A，则鉴定为光果甘草;如果口 S序列5 '端起第159位为T，第383-385位为CAA，且η化C-trnV 转录间隔区序列5'端起第487位为T，则鉴定为胀果甘草。如果ITS序列5'端起第159位同时 存在C和T，383-385位同时存在TGC和CAA，则鉴定为乌拉尔甘草与胀果甘草或光果甘草杂交 后产生的杂交品种。
[0011] 本发明提供的乌拉尔甘草、胀果甘草和光果甘草的鉴定方法，包括W下步骤： 1) W合适的方法提取样品DNA; 2) W待测样品DNA为模板，通过PCR反应扩增口 S序列； 3) 对扩增产物进行测序，确定ITS序列的5 '端起第159位和第383-385位的碱基。共有Ξ 种可能情况:情况一，如果口 S序列的5 '端起第159位碱基为C，383-385位的碱基为TGC，则样 品鉴定为乌拉尔甘草，鉴定结束;情况二，如果ITS序列的5'端起第159位碱基为C和T共存， 383-385位的碱基为TGC和CAA共存，则样品鉴定为杂交品种，鉴定结束;情况Ξ，如果ITS序 列的5 '端起第159位碱基为T，383-385位的碱基为CAA，则进行步骤4); 4) W待测样品DNA为模板，通过PCR反应扩增iKlhC-trnV转录间隔区序列； 5) 对扩增产物进行测序，确定η化C-trnV转录间隔区序列的5'端起第487位的碱基。测 序结果共有两种可能情况:情况一，如果η化C-trnV转录间隔区序列的5 '端起第487位碱基 为A，则样品鉴定为光果甘草，鉴定结束;情况二，如果5 '端起第487位碱基为T，则样品鉴定 为胀果甘草，鉴定结束。
[0012] 通过W上五个步骤，可实现乌拉尔甘草、胀果甘草、光果甘草和其杂交品种的区分 和鉴定。其中，杂交品种特指乌拉尔甘草与胀果甘草杂交后形成的后代，或乌拉尔甘草与光 果甘草杂交后形成的后代。
[0013] 本发明的独创性在于，一是设计了甘草ITS序列特异性引物，用于甘草属植物ITS 序列的高效扩增;二是首次发现叶绿体DNA中位于ndhC-trnV转录间隔区的一个全新SNP位 点，可用于胀果甘草和光果甘草的区分。将口 S序列与ndhC-trnV转录间隔区序列相结合，可 进行Ξ个品种的准确鉴定。
【附图说明】
[0014]图1中a为使用ITS通用引物（ITS 4/5)对甘草ITS序列进行扩增后的电泳结果，图1 中b为使用本发明所设计的甘草ITS特异性引物对甘草ITS序列进行扩增后的电泳结果。对 比可见，通用引物ITS4/5对甘草ITS序列的扩增错误率高（图1，曰），而甘草ITS特异性引物可 显著提高甘草ITS序列的扩增成功率和扩增效率(图1，b)。
[001引图2为乌拉尔甘草、光果甘草、胀果甘草及其杂交品种的ITS序列的SNP碱基情况 图。
[0016] 图3为乌拉尔甘草、光果甘草、胀果甘草的ITS序列比对结果。
[0017] 图4为乌拉尔甘草、光果甘草、胀果甘草的iKlhC-trnV转录间隔区序列比对结果。
【具体实施方式】
[0018] W下实施例用W对本发明作进一步的说明，但不用来限制本发明的范围。下述实 施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法;所述试剂和材料，如无特殊说明，均可 从商业途径获得。 实施例1、野生甘草样本的品种鉴定。
[0019] 1)从国内甘草的多个主要产区，收集野生甘草样本56份(均为干燥根），样品具体 信息如表1所示。用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)提取样品的 总DNA，具体步骤如下： ① 取药材粉末50mg于1.5mL EP管中，加入液氮和少量石英砂，用研磨棒充分研磨； ② 向研磨后的药材粉末中加入7(K)yL65°C预热的缓冲液GP1 (含0.5%琉基乙醇），迅速混 匀，65°C 水浴 40min; ③ 加入70化L氯仿，充分混匀，12000rpm离屯、5 min; ④ 将水相转入一新离屯、管中，加入70化L缓冲液GP2，混匀； ⑤ 将液体转入吸附柱CB3中，12000rpm离屯、30s，弃去废液； ⑥ 向吸附柱CB3中加入50化L去蛋白液GD，12000rpm离屯、30 S，弃废